Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Действие ионизирующего излучения на живые организмы 12
1.1.2. Становление понятия и начало изучения проблемы 12
1.1.3. Повреждение и репарация ДНК в ответ на непосредственное действие ионизирующего излучения на клетку 13
1.1.4. «Немишенные» эффекты облучения и их роль в реакции клеток на ионизирующее излучение 15
1.1.5. Повреждающее действие ионизирующего излучения на органы и ткани организма 17
1.1.6. Терапевтические мероприятия, направленные на нивелирование последствий действия ионизирующего излучения 20
1.2. Потенциал мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в терапии эффектов ионизирующего излучения 22
1.2.1. Природа и функции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток 23
1.2.2. Возможности и перспективы применения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в медицине 24
1.2.3. Механизм терапевтического действия мультипотентных мезенхимных стромальных клеток на облученные организмы 26
1.2.4. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки как котрансплантат при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток 27
1.2.5. Терапевтическое действие мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в зоне повреждения 28
1.2.6. Паракринный механизм терапевтического эффекта мультипотентных мезенхимных стромальных клеток 29
1.3. Внеклеточные везикулы как механизм межклеточной коммуникации и сигналинга, их участие в физиологических и патофизиологических процессах организма 31
1.3.1. История открытия и изучения внеклеточных везикул 31
1.3.2. Классификация, биогенез и выделение внеклеточных везикул 32
1.3.3. Особенности состава и функции внеклеточных везикул 33
1.3.4. Терапевтический и диагностический потенциал внеклеточных везикул 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Выделение и ведение клеточных культур 39
2.2. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга человека 40
2.3. Консервация и подготовка клеток для последующих манипуляций 41
2.4. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани крысы и человека 42
2.5. Характеристика культур стволовых клеток 43
2.6. Выделение внеклеточных везикул 44
2.7. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) 45
2.8. Анализ траекторий наночастиц (NTA) 45
2.9. Экспериментальные группы 2.10. Измерение веса животных 48
2.11. Поведенческий тест «Открытое поле» 48
2.12. Лазерная корреляционная спектроскопия (ЛКС) 48
2.13. Исследование изменений в картине крови 49
2.14. Оценка миграции ММСК 50
2.15. Гистологическое исследование селезенки, печени и поджелудочной железы 50
2.16. Индекс повреждения тканей исследуемых органов 54
2.17. Статистическая обработка данных 55
Глава 3. Исследование действия мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека на лабораторных животных после острого экспериментального облучения 56
3.1. Исследование изменений физиологических параметров после действия гамма излучения и введения ММСК КМ на организменном уровне 59
3.2. Исследование особенностей клеточных реакций после действия гамма излучения и введения ММСК КМ 62
3.3. Исследование сдвигов в субфракционном составе сыворотки крови после действия гамма-излучения и введения ММСК КМ 65
3.4. Гистологическое исследование изменений на органном уровне после действия гамма-излучения и введения ММСК КМ 68
3.5. Оценка миграции ММСК в облученном организме 74
Глава 4. Выделение и характеристика внеклеточных везикул, продуцируемых стволовыми клетками 76
Глава 5. Исследование внеклеточных везикул в качестве эффекторов терапевтического действия ММСК КМ человека на облученных животных 82
5.1. Изменение прироста массы тела животных после воздействия гамма излучения и введения внеклеточных везикул 82
5.2. Реакция системы кроветворения на облучение и после введения внеклеточных везикул 83
5.3. Сдвиги в субфракционном составе сыворотки крови животных после воздействия гамма-излучения и введения внеклеточных везикул 85
5.4. Изменения на органном уровне после воздействия гамма-излучения и введения внеклеточных везикул 87
5.5. Оценка роли внеклеточных везикул в реализации терапевтического эффекта мезенхимных стромальных стволовых клеток костного мозга человека 89
Заключение 94
Выводы 99
Список сокращений 100
Список литературы 102
- Повреждающее действие ионизирующего излучения на органы и ткани организма
- Гистологическое исследование селезенки, печени и поджелудочной железы
- Выделение и характеристика внеклеточных везикул, продуцируемых стволовыми клетками
- Оценка роли внеклеточных везикул в реализации терапевтического эффекта мезенхимных стромальных стволовых клеток костного мозга человека
Повреждающее действие ионизирующего излучения на органы и ткани организма
Эффекты воздействия ионизирующего излучения на живой организм по времени их проявления принято делить на две основные группы: детерминированные и стохастические. Детерминированные эффекты (непосредственные) проявляются в короткие сроки и после воздействия сравнительно высоких доз радиации (более 1 Зв) (Цыб А.Ф. и др., 2005). Эти эффекты выражаются в клеточной гибели и, следовательно, в массовом клеточном опустошении жизненно важных органов. Выживаемость организма будет зависеть в этом случае от многих факторов, но главное от того, сохранилось ли достаточное количество клеток-предшественников, способных восполнить клеточные потери организма. Детерминированные эффекты зависят от величины полученной дозы радиации, они являются пороговыми, т.е., существует некая минимальная доза при воздействии которой этот эффект точно будет проявляться. Увеличение дозы ведет к усилению выраженности эффекта (Christensen D.M., Iddins C.J., Sugarman S.L., 2014).
Стохастические или вероятностные эффекты проявляются при воздействии доз облучения менее 1 Зв и чаще всего представляют собой злокачественные трансформации облученных клеток и/или их потомков, которые приводят к фиброзу органов, лейкозам и другим онкологическим заболеваниям в случае облучения соматических клеток организма. Проявление стохастических эффектов радиации в половых клетках приводит к нежизнеспособности, появлению пороков развития и наследственных заболеваний у потомков облученных родителей, что в целом можно описать развитием геномной нестабильности организма (Иванова Е.В., Рамзаева П.В., Архангельской Г.В., 1997; Яблоков А.В, 1997; Цыб А.Ф. и др., 2005; Mukherjee D. et al., 2014). С увеличением дозы облучения повышается только вероятность, но не степень проявления стохастических эффектов действия облучения. Воздействие высоких доз ионизирующего излучения, приводящее к острой лучевой болезни, проявляется в пагубных системных эффектах на органы репродуктивной системы, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), печени, кожи, почек, центральной нервной системы, органов дыхания и сердечно-сосудистой системы. Причем, проявление эффектов в остро реагирующих тканях (ЖКТ, эпидермис, костный мозг) наблюдается в течение короткого периода после облучения (нескольких дней), а в случае малочувствительных органов (легкие) последствия могут быть отсрочены до многих месяцев (Gaberman E. et al., 2013).
Термин «острая лучевая болезнь» (ОЛБ) объединяет несколько типов проявлений радиационно-индуцированных болезней: костномозговой синдром, желудочно-кишечный, цереброваскулярный, и в последнее время к ним причисляют, так называемый, кожный синдром. Костномозговой синдром проявляется при более низких дозах, чем другие синдромы ввиду высокой радиочувствительности гемопоэтической системы (Chang P. et al., 2015). Даже у людей с отсутствием выраженных симптомов лучевой болезни могут наблюдаться изменения в количестве клеток крови. При более высокой дозе радиационного воздействия имеют место нарушения желудочно-кишечного тракта из-за гибели быстро пролиферирующих клеток тонкого кишечника, разрушения слоя слизистой оболочки и, как следствие, развития патогенной флоры. Очень высокие дозы облучения (20-80 Гр и более 80) могут привести к сердечно-сосудистой и церебральной формам острого лучевого синдрома, вызывая смерть в течение нескольких дней. Кожный синдром может возникать параллельно с другими синдромами (Черешнев В.А., Юшков Б.Г., 2014).
Основным направлением лечения острого лучевого синдрома является борьба с проявлениями костномозговой формы. При остром облучении лимфоидная ткань обедняется клеточными элементами раньше, чем ткань костного мозга. Причем, лимфопения – снижение общего числа лимфоцитов – развивается сразу после острого воздействия даже низких доз излучения, в то время как зрелые гранулоциты, эритроциты и тромбоциты могут переносить более высокие дозы (Sugrue T. et al., 2013). Параллельно с процессом клеточного обеднения лимфоидной ткани в результате глубокого торможения процессов клеточного деления происходит опустошение костного мозга (Медведева Ю.С. и др., 2013; Ланге К., 2015).
В случае облучения всего тела даже в относительно невысокой дозе повреждению будут подвергнуты многие органы и системы организма. Даже при удачной терапии и стабилизации состояния гемопоэтической системы может возникнуть отсроченный радиационно-индуцированный полиорганный отказ. В патофизиологии развития этого крайне опасного явления задействовано много механизмов как клеточного, так и системного ответа на лучевое повреждение.
Радиационно-индуцированный полиорганный отказ может быть обусловлен системным воспалительным ответом на образование токсических веществ из-за массовой гибели клеток или повреждения отдельных биологических мембран, что в свою очередь вызывает усиленную продукцию провоспалительных цитокинов, усугубляя воспалительный процесс. Дальнейшему развитию поражения тканей способствуют нарушения иммунологического статуса организма вследствие повышения проницаемости тканей, подавления бактерицидных свойств кожи и сыворотки крови, формирования аутоиммунных реакций из-за распада тканей, а также образование активных форм кислорода и азота неповрежденными клетками в ответ на воспаление и продукцию цитокинов (Аклеев А.В., 2014). Повышает вероятность возникновения отдаленных последствий облучения общая радиочувствительность иммунной системы организма, а также необратимость отдельных изменений, вызванных пагубным воздействием радиации (Аклеев А.В., Овчарова Е.А., 2007; Утегенова А.М. и др., 2014). Наличие дополнительных травм, таких как раны и ожоги при аварии или взрыве (так называемые комбинированные радиационные поражения), значительно ухудшает прогноз течения болезни и повышает вероятность возникновения радиационно-индуцированного полиорганного отказа (Drr H., Meineke V., 2011; Williams J.P., McBride W.H., 2011).
Гистологическое исследование селезенки, печени и поджелудочной железы
В каждой контрольной точке эксперимента у части животных после декапитации также выделяли печень, поджелудочную железу и селезенку для оценки морфологических изменений, вызванных повреждающим действием облучения в исследуемых органах. Препараты готовили согласно принятой методике (Меркулов Г.А., 1969), в качестве фиксатора использовали 4% раствор нейтрального формалина. Степени изменения морфологии клеток и органов были распределены по степеням тяжести повреждения. Основные принципы такого деления были описаны ранее в работах нашей лаборатории (Медведева Ю.С., 2017; Alchinova I. et al., 2015). Опираясь на эти принципы, мы характеризовали полученные нами гистологические препараты и присваивали соответствующие степени повреждения в зависимости от наблюдаемых изменений в тканях исследованных нами органов.
Так, степени тяжести повреждения селезенки были присвоены, исходя из следующих критериев:
0 степень. Белая и красная пульпы хорошо различимы. Красная пульпа умеренно кровенаполнена, наблюдали умеренное диффузное скопление лейкоцитов и макрофагов. Фолликулы среднего размера с четко выраженными
3 Гистологическое исследование тканей проводили совместно с А.А. Антиповым, ассистентом кафедры общей патологии им. В.М. Коропова ФГБОУ ВО «МГАВМиБ – МВА им. К.И. Скрябина». границами, округлой или овальной формы, их герминативные центры отличались небольшими размерами, стенки центральных артерий изменены не были. Средняя площадь фолликула составляла 44726,02±20380,025 мкм2.
1 степень. Белая и красная пульпы хорошо различимы. Основная масса органа была представлена белой пульпой, фолликулы которой характеризовались крупными (иногда гигантскими) размерами, неправильной формой, нечетко выраженными границами, часто сливавшимися друг с другом, и крупными светлыми герминативными центрами. Стенки центральных артерий изменены не были. Средняя площадь фолликула составляла 187049,15±77346,23 мкм2. Красная пульпа умеренно кровенаполнена, в ней наблюдали умеренное скопление лейкоцитов и макрофагов, которые располагались диффузно или отдельными островками.
От предыдущей степени повреждения данная морфологическая картина органа отличалась нарушением строения белой пульпы.
2 степень. Орган не имел четкого разделения на красную и белую пульпу. Основная масса органа была представлена лимфобластами – относительно мономорфными тесно лежавшими клетками мелкого и среднего размера с крупным округлым или овальным гиперхромным ядром и скудной цитоплазмой. Обнаруживаемые следы белой пульпы были представлены лимфоидными фолликулами с отсутствовашими границами и с выделявшимися герминативными центрами округлой или овальной формы. Красная пульпа была слабо выражена, представлена группами эритроцитов и лимфоцитоподобных клеток, которые располагались небольшими скоплениями неправильной формы среди преобладавшей массы лимфоидных клеток. В некоторых случаях наблюдали периваскулярный отёк.
От предыдущей степени повреждения данная морфологическая картина органа отличалась отсутствием выраженной красной пульпы и полным отсутствием границ между фолликулами.
3 степень. Отсутствовали типичные структурные элементы органа. Сосуды были сдавлены, имели суженный просвет, фолликулы редуцированы. Основная масса органа была представлена лимфобластами. Нередко встречались крупные макрофаги, в цитоплазме которых содержался ядерный детрит фагоцитированных лимфобластов, и гигантские неправильной формы клетки, по морфологии похожие на мегакариоциты.
От предыдущей степени повреждения данная морфологическая картина органа отличалась отсутствием типичных структур органа. Паренхима органа была представлена лейкозными клетками.
4 степень. Отсутствовали типичные структурные элементы органа. Основная масса органа была представлена лимфобластами. Часто можно было наблюдать периваскулярный отёк. Встречались многочисленные очаги скопления плотного аморфного эозинофильного вещества, дававшего положительную окраску конго красным на амилоид. Вещество располагалось преимущественно по окружности, можно было предположить, что оно лежит на границе между белой и красной пульпой, вокруг бывших фолликулов. Иногда амилоид располагался диффузно.
От предыдущей степени повреждения данная морфологическая картина органа отличалась наличием амилоида.
Изменения органов, описанные во второй, третьей и четвертой степени характерны для лимфоидного или миелоидного лейкоза разной степени тяжести.
Степени тяжести повреждения поджелудочной железы:
0 степень. Нормальная ткань. Экзокринная часть органа была представлена панкреатическими ацинусами округлой, овальной или неправильной формы и разного размера (преимущественно среднего), состоявшими из одного слоя средних и мелких ациноцитов с округлыми ядрами, располагавшимися ближе к базальной части клеток. Клетки с зернистой цитоплазмой, оксифильно окрашивались в апикальной части. Базальная часть клетки окрашивалась базофильно, цитоплазма гомогенная. Ацинусы были сгруппированы в дольки, которые разделялись тонким слоем соединительной ткани с проходившими в ней умеренно кровенаполненными сосудами. Эндокринная часть паренхимы органа была представлена разного размера островками крупных слабоокрашенных клеток (островки Лангерганса) округлой формы, со средней площадью 37560,93±10349,22 мкм2.
1 степень. Иногда наблюдали липоматоз – замещение отдельных ацинусов жировой тканью. При изучении междольковой интерстициальной ткани встречали скопления лимфоцитоподобных клеток, образовывавшие узелки округлой формы с хорошо сформированной капсулой. Эндокринная часть паренхимы была представлена небольшими атрофированными островками крупных слабоокрашенных клеток (островки Лангерганса) округлой формы, со средней площадью 11181,13±3016,67 мкм2.
От предыдущей степени повреждения данная морфологическая картина органа отличалась более мелким размером ацинусов, эпителия и островков Лангерганса, с развитием липоматоза, что свидетельствовало об атрофии паренхимы органа.
Степени тяжести повреждения печени:
0 степень. Нормальная ткань печени с незначительными изменениями морфологии клеток. Сохранено балочное строение органа. Плохо выражена дольчатость, строма органа была представлена тонкими прослойками междольковой соединительной ткани с хорошо выраженными междольковыми венами и артериями. Диаметр центральных вен не увеличен, синусные капилляры не расширены. Гепатоциты округлой формы со слегка зернистой, мутной цитоплазмой и четкими, неравномерно окрашенными ядрами, по периферии которых располагались глыбки хроматина. Между клетками были отчетливо выражены границы.
1 степень. Резко набухшие клетки с равномерно окрашенными ядрами, мутной, пенистой цитоплазмой и сглаженными границами. Синусные сосуды на периферии долек были незначительно расширены, а в центральных участках сужены. Отмечали слабое развитие междольковой соединительной ткани.
2 степень. Клетки набухшие с мутной, пенистой цитоплазмой и неравномерно окрашенными ядрами, в которых наблюдали кариопикноз и кариорексис. Состояние клеток было характерно для белковой и жировой дистрофии. Наблюдали расширение синусных сосудов органа, увеличенный диаметр центральных вен (гиперемия органа). Междольковая соединительная ткань была слабо развита.
3 степень. Наблюдали все вышеперечисленные изменения, описывающие 2 степень повреждения, а также очаги некроза гепатоцитов, что характерно при тяжелой токсической дистрофии печени.
4 степень. Междольковая соединительная ткань была слабо развита. Состояние клеток характерно для белковой и жировой дистрофии. Отмечали значительный некроз гепатоцитов, гиперемию и инфильтрацию лимфоподобными клетками.
5 степень. Междольковая соединительная ткань была слабо развита. Состояние клеток характерно для белковой и жировой дистрофии. Отмечали значительный некроз гепатоцитов, гиперемию и инфильтрацию лимфоподобными клетками, выявлено присутствие аморфных полупрозрачных масс.
Выделение и характеристика внеклеточных везикул, продуцируемых стволовыми клетками
В предыдущей части работы нами было показано, что даже однократная внутривенная инъекция ММСК КМ человека облученным мышам способствовала частичному восстановлению их физиологических параметров. Однако механизм реализации такого терапевтического эффекта до сих пор полностью не изучен. В настоящее время в качестве эффекторов паракринного механизма терапевтического действия ММСК на облученный организм интенсивно изучают внеклеточные везикулы (ВВ), которые секретируются практически всеми клетками организма (Colombo M., Raposo G., Thry C., 2014). Полагают, что эти частицы являются активными участниками процессов межклеточной коммуникации и взаимодействия клеток с микроокружением. Задачей второй части работы было выделить и охарактеризовать внеклеточные везикулы, продуцируемые стволовыми клетками различной природы.
Исследуемыми клетками в данной работе были ММСК костного мозга. В качестве сравнения было решено взять также культуру мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. В последнее время в качестве альтернативного источника этих клеток все чаще рассматривают жировую ткань ввиду более легкого способа получения исходного материала. В доступных нам международных базах данных Exocarta и Vesiclepedia на тот момент внеклеточные везикулы из культур клеток мышей охарактеризованы были в гораздо меньшей степени, чем из крысиных клеток. Характеристики внеклеточных везикул непосредственно из ММСК жировой ткани не было ни для одного, ни для другого вида. Однако для крысиных адипоцитов секретируемые везикулы охарактеризованы были, и это было признано нами достаточным основанием для того, чтобы в качестве сравнения выбрать ММСК жировой ткани крысы.
Исследуемые культуры экспрессировали характерные поверхностные маркеры культуры ММСК и не экпрессировали маркеры клеток гемопоэтического и лимфоцитарного рядов (Пулин А.А., Сабурина И.Н., Репин B.C., 2008). Результаты иммунофенотипирования представлены в таблице 1.
Внеклеточные везикулы выделяли из 15 мл культуральной жидкости, собранной с культивируемых в течение 72 часов 1-2 млн ММСК КМ 2-го пассажа, исследуемых в первой части в качестве терапии последствий действия облучения на животных. Для изучения специфики секреции были взяты также ММСК, но из жировой ткани крысы 4-го пассажа. Выделение проводили по модифицированному в нашей лаборатории протоколу (Lsser C., Eldh M., Ltvall J., 2012) с учетом поставленных задач и имеющегося оборудования. Дополнительно методом ЛКС были исследованы суспензии везикул, выделенных из культуральной жидкости от ММСК жировой ткани человека 2-го и 4-го пассажей и ММСК КМ человека 2-го пассажа. В ходе анализа выделенных ВВ с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) в КЖ-1 (от ММСК КМ человека) были выявлены частицы с формой, близкой к сферической, и размерами в диапазоне от 36 до 45 нм (Рис. 12A). Других частиц в этом образце обнаружено не было. В КЖ-2 (от ММСК ЖТ крысы) присутствовало два типа частиц: размером от 79 до 106 нм с морфологическими признаками внеклеточных везикул и более мелких размеров, от 37 до 53 нм (Рис. 12Б).
В контрольном образце (фосфатно-солевой буфер), подвергнутом такой же процедуре, микрочастиц близких размеров не обнаружили (Рис. 12В). Мелкая зернистость, которая присутствует и в препаратах, и в контроле, вероятно, представляет собой структуру формваровой подложки. Полученные нами результаты согласовались с результатами Naohito Aoki и соавторов. В их исследовании везикулы, выделенные из культуральной жидкости адипоцитов крысы, были двух размеров около 100 и 50 нм, как и в нашей работе (Aoki N. et al., 2007).
По результатам NTA (анализ траекторий наночастиц) средний размер частиц в образце КЖ-1 составил 86 нм при концентрации 6,61010 частиц/мл, что соотносится с данными других авторов (Haga H. et al., 2017), а в образце КЖ-2 – 101 нм при концентрации 7,91010 частиц/мл (Рис. 13). В контрольных образцах сред (без культивирования в них клеток), а также в образце буфера, используемого для разведения, концентрация микрочастиц не превышает 108 частиц/мл (данные не представлены).
Исследуя такой объект как внеклеточные везикулы, необходимо помнить, что получаемые данные о размере микрочастиц не являются истинной величиной. Для проведения ПЭМ исследуемый образец необходимо предварительно фиксировать и дегидратировать, а сам процесс получения изображения проводится в условиях вакуума. Многоступенчатая пробоподготовка и условия проведения наблюдений могут вызывать изменения формы и размеров исследуемых частиц (Szatanek R. et al., 2017). Однако данный метод находит широкое применение, позволяя проводить анализ структурных и биологических характеристик внеклеточных везикул. В случае NTA-анализа имеет место обратная ситуация. Вокруг везикул, находящихся в водном растворе, образуется гидратная оболочка, поэтому методы, основанные на детекции частиц в подобных условиях (NTA, методы динамического светорассеяния), позволяют определить только теоретический гидродинамический размер исследуемых микрочастиц. Большое значение также имеют температура исследуемой пробы, которая определяет вязкость среды, а, следовательно, скорость перемещения частиц в ней и их среднеквадратичное смещение. Тем не менее, эти методы позволяют получить довольно точную информацию о концентрации и распределении частиц по размеру в анализируемой суспензии (Sokolova V. et al., 2011).
В нашем исследовании размеры микрочастиц, определенные методом NTA, были несколько большими, чем полученные при исследовании методом просвечивающей электронной микроскопии. Подобные различия также характерны для размеров биомолекул, определяемых в сухом и растворенном состоянии, например, с помощью рентгеноструктурного анализа и лазерной корреляционной спектроскопии (Karganov M. et al., 2012; Paulaitis M., Agarwal K., Nana-Sinkam P., 2018).
После получения результатов предыдущих анализов было решено провести дополнительное исследование внеклеточных везикул методом лазерной корреляционной спектроскопии (Рис. 14). Оценивали распределение микрочастиц по размерам в суспензиях ВВ, выделенных из культуральных жидкостей ММСК КМ человека 2-го пассажа, ММСК ЖТ человека 2-го и 4-го пассажей и ММСК ЖТ крысы 4-го пассажа.
Результаты ЛКС показали, что распределение частиц по размерам в суспензии везикул, выделенных из культуры ММСК человека одинакового пассажа, но разного тканевого происхождения (костный мозг и жировая ткань), различалось в диапазоне от 67,75 до 165,57 нм (Рис. 14). В то же время наблюдали изменение в распределении микрочастиц из ММСК жировой ткани человека в зависимости от пассажа, пройденного культурой, хотя в работе Patel D.B. и соавторов методом NTA не было показано различий в размерах секретируемых ММСК КМ человека везикул для культур с 1 по 5 пассажи (Patel D.B. et al., 2017). Везикулы, выделенные из ММСК ЖТ крысы, обладали сходными теоретическими гидродинамическими радиусами по сравнению с ВВ из ММСК ЖТ человека соответствующего пассажа.
Полученные результаты позволяют утверждать, что различия в соотношении ВВ разных размеров в суспензиях, выделенных из культуральной среды от ММСК одного биологического вида (человек) обусловлено тканевым источником клеток, продуцирующих исследуемые везикулы.
Оценка роли внеклеточных везикул в реализации терапевтического эффекта мезенхимных стромальных стволовых клеток костного мозга человека
С целью выяснения роли внеклеточных везикул в реализации терапевтического эффекта ММСК КМ человека на облученный организм было необходимо сравнить степень изменения физиологических параметров организма при введении непосредственно исследуемых клеток и выделенных из их культуральных жидкостей внеклеточных везикул.
При оценке изменений в субфракционном составе сыворотки крови мышей было отмечено различие в динамике распределения мелких частиц. При введении ММСК КМ человека через 3 недели наблюдали увеличение процентного вклада в светорассеяние мелких частиц, на 6-ой неделе содержание мелких частиц снижалось. После введения ВВ повышение вклада в светорассеяние мелких частиц наоборот наблюдали на 6-ой неделе, а на 3-ей неделе подобного повышения не фиксировали (Рис. 20). В литературе имеются данные об усилении поглощения клетками внеклеточных везикул под действием гамма-излучения (Hazawa M. et al., 2014). Возможно, что разница в содержании мелких частиц на ранних сроках после облучения обусловлена первоначальным активным поглощением клетками введенных везикул, способствовавших нормализации метаболических процессов на первых этапах, но недостаточных для долговременной реализации своего эффекта на этом уровне системной организации.
Подсчет лейкоцитарной формулы крови также показал, что ВВ и клетки оказывают разное влияние на содержание лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови (Рис. 21). В крови животных, которым были введены клетки, через 3 недели после облучения было повышено содержание нейтрофилов и понижено содержание лимфоцитов по сравнению с контролем, в то время как содержание клеток в крови мышей с введенными ВВ не отличалось от интактной группы. Данная ситуация сохраняется к 6-ой неделе, хотя показатели группы с введенными ММСК КМ человека несколько улучшились по сравнению с предыдущей временной точкой и с облученной группой.
У группы с введением ВВ различий в содержании B-лимфоцитов с показателями интактной группы не было ни на 3-ей, ни на 6-ой неделе, в то время как у облученной группы этот показатель был ниже, чем у контроля. В группе с введением ММСК КМ человека продукция лимфоцитов была значительно снижена по сравнению с контрольной группой (так же, как и у облученной группы). Ситуация сохранилась к 6-ой неделе, хотя наблюдали выход новых лимфоцитов в кровь у всех групп (Рис. 22). Как уже было отмечено, данное наблюдение может объясняться способностью ММСК КМ человека задерживать пролиферацию и созревание лимфоцитов. В случае внеклеточных везикул данный аспект до сих пор остается спорным моментом.
Чтобы оценить эффективность воздействия вводимых препаратов на органном уровне, было решено вычислить индекс повреждения тканей исследуемых органов. Этот индекс позволяет учесть вклад каждой степени повреждения и ее распространенности в общую картину морфологических изменений тканей по группе.
Большую эффективность на органном уровне показало введение клеток, так как в этом случае индекс повреждения опытной группы был существенно ниже данного показателя облученной группы при исследовании трех целевых органов в каждой временной точке (Рис. 23). Меньшую эффективность действия продуцируемых изучаемыми клетками ВВ на органном уровне по сравнению с самими ММСК мы объясняем тропностью клеток исследуемых органов к везикулам из ММСК костно-мозгового происхождения, несущих на своей поверхности маркеры родительской клетки.
Таким образом, полученные результаты показывают, что внеклеточные везикулы, очевидно, обладают неким терапевтическим потенциалом, скорее всего, реализуемом за счет переносимого содержимого (Jelonek K., Widlak P., Pietrowska M., 2016), которое влияет на выживаемость клеток-реципиентов и экспрессию ими определенных цитокинов, что, в свою очередь, сказывается на состоянии органов и систем организма в целом (Темнов А.А. и др., 2018; Wen S. et al., 2016; Schoefinius J.-S. et al., 2017). Проведенное сравнение двух аналогичных исследований клеточной и везикулярной терапий позволяет утверждать, что эффекты ММСК КМ на облученных животных частично обусловлены секрецией внеклеточных везикул.