Ингибиторы протеиназ в регуляции плазменного и внутриклеточного протеолиза Акбашева, Ольга Евгеньевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1. Ингибиторы протеиназ плазмы крови и тканей 12

1. Протеиназный ингибитор 12

2. Макроглобулин 19

3. Кислотостабильные ингибиторы 27

1.2. Система протеолиза плазмы крови и тканей 32

1.3. Протеолиз при патологических процессах 34

ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 43

2.1. Объем исследований и характеристика групп 43

2.2. Методики исследования 62

2.2.1. Определение активности ингибиторов протеиназ 62

2.2.2. Фенотипирование а і-ПИ методом изоэлектрического фокусирования 64

2.2.3. Определение активности протеиназ 64

2.2.4. Определение показателей обмена коллагена и костной ткани 68

2.2.5. Определение показателей липидного обмена 70

2.2.6. Определение показателей перекисного окисления липидов 71

2.2.7. Измерение окислительной модификации белков 73

2.2.8. Определение концентрации белка 74

2.2.9. Биохимические показатели плазмы крови 74

2.3. Статистическая обработка результатов 76

ГЛАВА 3. Результаты исследований 78

1. Активность ингибиторов плазмы крови практически здоровых лиц 78

1.1. Активность ингибиторов протеиназ в плазме крови 78

1.2. Активность ингибиторов протеиназ в биологических жидкостях 83

1.3. Влияние курения на активность ингибиторов 85

1.4. Активность ингибиторов протеиназ в экологически неблагоприятных районах 87

2. Ингибиторы плазмы крови при патологических процессах 94

2.1. Активность ингибиторов при заболеваниях бронхо-легочной системы

2.1.1. Ингибиторы протеиназ при хронической обструктивной болезни легких 95

2.1.2. Активность ингибиторов при бронхиальной астме 100

2.2. Активность ингибиторов протеолиза при заболеваниях желудочно-кишечного тракта 104

2.2.1. Ингибиторы протеиназ при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки 104

2.2.2. Ингибиторы протеиназ при язвенном колите и болезни Крона 115

2.2.3. Ингибиторы протеолиза при фиброзе печени 122

2.3. Активность ингибиторов протеиназ при травмах опорно-двигательного аппарата 127

2.3.1. Активность ингибиторов, протеиназ и перекисное окисление липидов при травмах кости 127

2.3.2. Влияние контрикала на активность ингибиторов и перекисное окисление липидов при травмах кости 132

2.3.3. Зависимость ингибиторов плазмы крови от состояния внутриклеточного метаболизма 134

2.4. Активность ингибиторов протеиназ при онкологических заболеваниях 137

2.4.1. Активность ингибиторов при раке легкого и желудка 137

2.4.2. Активность ингибиторов при опухолях опорно-двигательного аппарата 139

2.4.3. Активность ингибиторов при опухолевом росте в условиях in vitro и in vivo 143

3. Результаты статистического моделирования 148

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 155

Выводы 190

Список литературы 192

Список сокращений 235

• Кислотостабильные ингибиторы
• Определение активности протеиназ
• Активность ингибиторов протеиназ в экологически неблагоприятных районах
• Активность ингибиторов, протеиназ и перекисное окисление липидов при травмах кости

Введение к работе

Актуальность проблемы. Изучение общих патогенетических механизмов развития заболеваний, типовых патологических процессов и реакций организма на воздействие патогенного фактора является одной из актуальных медико-биологических проблем. Протеолиз представляет особую форму биологического контроля, включает протеолитические ферменты, их неактивные предшественники, активаторы и ингибиторы, обеспечивает гомеостаз в норме и при развитии адаптационно-защитных реакций организма [Локшина Л.А., 2001; Carretero O.A., 2005; Purkayastha P. et al., 2005]. При неуправляемом протеолизе происходит деструкция клеток, активация систем свертывания, фибринолиза, комплемента и кининогенеза [Веремеенко К.Н., 1994; Яровая Г.А., 2001; Abboud R.T., 2008; Steinhoff M.L. et al., 2005]. Протеолитические ферменты плазмы крови и тканей организма, как правило, способны усиливать действие на организм патогенных факторов: бактерий, вирусов [Alcorn J.F. et al., 2004], токсических веществ окружающей среды [Букреева Е.Б., 2003; Fehrenbach H., 2003], что сопровождается патологией бронхо-легочной системы [Shapiro S.D. et al., 2003; Onclinx C. et al., 2006; Davies P.L. et al., 2010], желудочно-кишечного тракта [Harada N. et al., 2001; Исламова Е.А., 2004], развитием онкологических заболеваний [Yang P. еt al., 2004; Michael I. P. et al., 2005; Lindner I. et al. 2010].

В регуляции протеолитических процессов принимают участие ингибиторы внутриклеточных и внеклеточных протеиназ, действие которых достаточно хорошо изучено [Веремеенко К.Н., 1994; Локшина Л.А., 2001; ., 2008]. Ингибиторы протеиназ обладают противовоспалительным, антибактериальным, противовирусным и противоопухолевым действием [Na G.Y., 2004; He S.H., 2004]. Выявлено большое количество вариантов реагирования ингибиторов протеолиза: от повышения их активности [. et al., 2007; . et al., 2007; . et al., 2007; . et al., 2008; . et al., 2008], до снижения [Crowther D.C. et al., 2004; B. et al., 2008] и разнонаправленной реакции [Осипов В.Д., 2006; Петросян А.М. с соавт., 2007; Zelvyte I. et al., 2003]. Длительное повышение экспрессии ингибиторов протеиназ способствует старению организма [. et al., 2002]. Неоднозначность оценки роли ингибиторов протеолиза в реакциях адаптации и развития патологических процессов приводит к значительным трудностям при использовании их в качестве диагностических и прогностических критериев.

Установлено, что ингибиторная активность плазмы крови на 95% представлена ₁-протеиназным ингибитором (a₁-ПИ) и a₂-макроглобулином (a₂-МГ). a₁-ПИ относится к серпинам, известны полиморфные варианты гена [Пузырев В. П., Савюк В. Я., 2002; Silverman G.A. et al., 2001]. Генетический дефект a₁-ПИ способствует развитию эмфиземы, хронической обструктивной болезни легких, фиброза печени с прогрессией к циррозу [Fumagalli M., 2008; R.T., 2008; ., 2008; Fregonese L., 2008]. Тем не менее, в ряде случаев обнаружены бессимптомные варианты дефицита a₁-ПИ с поздней манифестацией заболеваний легких и печени [Головюк Е.Л., 2002; Sotcan M., 2006; Hogarth D.K., 2008 Ferrarotti I., 2008]. Известны также многочисленные функции a₂-МГ: ингибирование протеиназ, активация внутриклеточных путей сигнальной трансдукции, регуляция иммунной системы [Зорин Н.А., 2004; Misra U.K. et al., 2005; ., 2007]. Однако функция a₂–МГ четко не определена: его иногда относят к белкам острой фазы воспаления, про-, антиапоптотическим факторам, белкам теплового шока, внеклеточным шаперонам, радиопротекторам [Зорин Н.А. и др., 2004; . et al., 2005; . , 2007; Mihailovic M. et al., 2009].

Тканевые кислотостабильные ингибиторы (КСИ) представляют альтернативный путь регуляции внутриклеточного протеолиза по отношению к высокомолекулярным, плазменным ингибиторам [Оглоблина О.Г., 2000; Doumas S. et al., 2005; Zhuo L., 2004]. КСИ обнаружены во многих тканях, обладают антибактериальными, противовирусными и противоопухолевыми свойствами [Doumas S. et al., 2005; Bellemare A. et al., 2008; Reviglio V.E. et al., 2009]. Приводятся противоречивые данные о функциях КСИ при патологических процессах: их рассматривают как положительно, так и отрицательно реагирующими белками острой фазы [de la Motte et al., 2003; Opal S.M. et al., 2007; Wang Z. et al., 2008].

В последние годы большое внимание уделяется изучению роли ингибиторов протеолиза в биологических жидкостях [Nie J. et al., 2004; Zelvyte I. et al., 2004; . et al., 2008]. Плазменные ингибиторы обнаруживаются в секрете бронхов, желчи, спинномозговой и околоплодной жидкостях, дуоденальной слизистой [Hettinger A.M. et al., 2001; Vila N. et al., 2003; Doumas S. et al., 2005; Lea R.G. et al., 2007]. Значимость ингибиторов в регуляции внутриклеточного протеолиза при развитии патологических процессов остается не изученной.

В связи с этим актуальным является комплексное исследование активности a₁–ПИ, a₂–МГ и КСИ, их взаимосвязи с клеточным метаболизмом, процессами адаптации к действию повреждающих факторов.

Цель исследования: изучить активность a₁–ПИ, a₂–МГ, КСИ биологических жидкостей, взаимосвязь с показателями метаболизма клетки, охарактеризовать варианты реагирования ингибиторов протеиназ при адаптивных и патологических процессах, сопровождающихся активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза.

Задачи исследования:

1. Изучить активность a₁-ПИ, a₂-МГ, КСИ в плазме крови, секретах слюнных желез, индуцированной мокроты, межтканевой жидкости практически здоровых лиц, связь с активностью протеиназ и биохимическими маркерами состояния внутренних органов: аспартат-, аланинаминотрансферазами, -амилазой, 5-нуклеотидазой, мочевиной, липидами, окислительными процессами, синтеза и деградации белков соединительной ткани.

2. Охарактеризовать ингибиторную активность плазмы крови, индуцированной мокроты, кожного экссудата, а также активность эластазо-, трипсиноподобных протеиназ, состояние кининогенеза, перекисного окисления липидов при заболеваниях бронхо-легочной системы: хронической обструктивной болезни легких и атопической бронхиальной астме.

3. Оценить активность ингибиторов на фоне активации плазменного и внутриклеточного протеолиза слюнных желез, слизистой кишечника, ткани печени и окислительной модификации белков при заболеваниях желудочно-кишечного тракта: синдроме раздраженного кишечника, язвенной болезни, язвенном колите, болезни Крона и фиброзе печени.

4. Выявить взаимосвязь ингибиторной активности с фенотипом a₁-ПИ, типом конституции больных, показателями деградации соединительной ткани и коллагенообразования, перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков.

5. Изучить роль ингибиторов при травмах кости, их взаимосвязь с активностью трипсиноподобных протеиназ, содержанием липидов, а также влияние контрикала на состояние протеолиза, перекисное окисление липидов, резорбцию костной ткани и остеогенез.

6. Оценить особенности реакции ингибиторов при онкологических заболеваниях человека. В условиях экспериментального опухолевого роста in vivo и in vitro выявить эффект контрикала по отношению к протеолитическим ферментам клеток мастоцитомы Р-815, печени, тимуса.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование активности a₁-ПИ, a₂-МГ и КСИ в биологических жидкостях в норме при адаптивных реакциях и заболеваниях, сопровождающихся активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза. В рамках концепции согласованного действия ингибиторов протеиназ выявлены варианты их реагирования: адаптивный, дефицит и дисбаланс ингибиторов, коррелирующие со степенью активации протеолиза, перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков и деградацией соединительной ткани. Впервые установлено, что адаптивный вариант характеризуется увеличением активности ₁-ПИ, ₂-МГ, КСИ и сопровождается умеренной активацией протеолиза. Дефицит ₁-ПИ и ₂-МГ приводит к более выраженной активации протеолитических процессов при хронических заболеваниях бронхо-легочной системы, желудочно-кишечного тракта. Дисбаланс ингибиторов с повышением коэффициента ₁-ПИ/₂-МГ и низкой активности ₂-МГ характерен для фиброза печени и онкологических заболеваний. Ингибирование плазменного протеолиза путем внутривенного введения контрикала увеличивает активность ₁-ПИ, ₂-МГ, снижает липолиз, перекисное окисление липидов, резорбцию и стимулирует остеогенез, приводит к торможению опухолевого роста.

Впервые дана оценка роли ингибиторов в индуцированной мокроте, являющейся секретом бокаловидных клеток, слюны, кожного экссудата, представляющего межтканевую жидкость, слизистой кишечника, ткани печени. Ингибиторная активность a₁-ПИ и a₂-МГ в биологических жидкостях значительно ниже, чем в плазме крови. Активность КСИ кожном экссудате практически не отличается от активности ингибитора в плазме крови. Установлено, что активность ₁–ПИ и КСИ плазмы крови коррелирует с показателями в слюне и кожном экссудате, в то время как активность ₂–МГ плазмы крови не зависит от ингибиторных свойств других биологических жидкостей.

Новыми являются данные о том, что при хронических воспалительных заболеваниях с активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза в первую очередь развивается дефицит ₁–ПИ. Одновременное снижение активности ₁–ПИ и ₂–МГ плазмы крови и тканей сопровождается тяжелыми заболеваниями бронхо-легочной системы и деструктивными повреждениями кишечника. Универсальной реакцией при сдвиге метаболизма в сторону катаболических процессов является увеличение активности КСИ, которые в условиях дефицита антипротеиназных, защитных факторов осуществляют контроль плазменного и внутриклеточного протеолиза.

Теоретическая и практическая значимость. Получены данные фундаментального характера, расширяющие представления о роли ингибиторов протеолиза в регуляции метаболических процессов плазмы крови и тканей организма. Выявление вариантов реагирования ингибиторов при заболеваниях бронхо-легочной системы и желудочно-кишечного тракта может быть использовано для оценки состояния больных, хронизации патологического процесса. Перспективным является изучение активности ингибиторов и протеиназ индуцированной мокроты в качестве неинвазивных показателей при заболеваниях бронхо-легочной системы. Снижение активности ₁–ПИ индуцированной мокроты курящих лиц рекомендовано использовать как маркер прогрессирования хронической обструктивной болезни легких. Дефицит ₂–МГ плазмы крови является фактором риска фиброза и развития цирроза печени.

Полученные результаты являются основой для разработки новых подходов к лечению хронических воспалительных заболеваний с использованием лекарственных средств, обладающих способностью снижать активность внутриклеточных и плазменных протеиназ и повышать активность их ингибиторов. Возможность практического использования полученных данных подтверждена патентами РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Активация плазменного и внутриклеточного протеолиза при патологических процессах сопровождается разными вариантами реагирования ингибиторов протеиназ: адаптивный, дефицит и дисбаланс. Адаптивный вариант с увеличением активности ₁-ПИ, ₂-МГ, КСИ проявляется при умеренной активации катаболических процессов. Дефицит ₁-ПИ и ₂-МГ связан с выраженной активацией протеолиза, окислительной модификацией белков, деградацией соединительной ткани. Дисбаланс ингибиторов характеризуется повышением активности ₁-ПИ и снижением активности ₂-МГ. При дефиците и дисбалансе ₁-ПИ и ₂-МГ протеолиз находится под контролем КСИ.

2. Максимальная активность a₁-ПИ и a₂-МГ характерна для плазмы крови, в кожном экссудате, слюне, индуцированной мокроте она составляет от 0,4% до 11% от показателей плазмы крови. Согласованное действие ингибиторов направлено на регуляцию активности как плазменных, так и внутриклеточных протеиназ: трипсиноподобных, эластазы, коллагеназы, катепсина D.

3. Наиболее значимыми показателями являются a₁-ПИ и a₂-МГ, которые имеют определяющее значение для прогнозирования заболеваний бронхо-легочной системы и желудочно-кишечного тракта. Нарушение баланса между a₁-ПИ и a₂-МГ увеличивает риск развития фиброза печени, рака легких, желудка. Повышение активности a₂-МГ под действием контрикала определяет его противоопухолевый эффект.

4. Внедрение в практику. Основные результаты работы используются в учебном процессе кафедр патологической физиологии, биохимии и молекулярной биологии, терапии, госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России. По результатам работы получено 3 патента на изобретение «Способ диагностики стадии хронизации гепатита» (№ 2291440, 10.01.2007); «Способ диагностики цирроза печени» (№ 22914441, 10.01.2007); «Способ прогнозирования риска развития хронической обструктивной болезни легких у длительно курящих лиц» (№ 2359618, 27.06. 2009). Отдельные фрагменты работы поддержаны грантом ФЦП № 02.740.11.0083 «Разработка научно-технологической основы применения лазерных технологий в биомедицинских исследованиях, эффективных методов экспресс-диагностики основных социально-значимых заболеваний респираторной системы человека с использованием методов лазерной спектроскопии».

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на ежегодных конференциях «Национальные дни лабораторной медицины» 1997-2008 гг., конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 1998), межрегиональной научно-практической конференции «Медицина и экологические проблемы Северных районов Сибири» (Стрежевой, 1998), на 3-4 съездах физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997, Томск, 2000, 2002), на 5 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2005), 6 международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в ХХ1 веке» (Москва, 2005), 12 Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2006), 8 Международном Славяно-Балтийском научном гастроэнтерологи-ческом форуме (Санкт-Петербург, 2006), III конгрессе евроазиатского респираторного общества (Астана, 2007), IV съезде и конференции Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008, Челябинск, 2009).

Результаты работы обсуждались на научных семинарах кафедр биохимии и молекулярной биологии СибГМУ, патологической физиологии, на проблемных комиссиях «Актуальные проблемы патологической физиологии и общей патологии» и «Фундаментальные проблемы физиологии, биофизики, биохимии" Сибирского государственного медицинского университета (Томск, 2005, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликована 61 работа, в том числе 1 монография и 22 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций результатов исследований на соискание степени доктора медицинских наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 235 страницах, содержит 82 таблицы, 29 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 461 источников, из них 95 отечественных и 366 иностранных.

Личный вклад автора. Автором определены цель, задачи, объём исследований, выбраны объекты и методы исследования, проведен аналитический обзор литературы. Более 90% фактического материала получено непосредственно автором. Анализ и обобщение полученных данных, формирование выводов и положений полностью выполнено лично автором.

Кислотостабильные ингибиторы

Кислотостабильные ингибиторы (КСИ) - группа низкомолекулярных белков, имеющих 5-6 дисульфидных связей, устойчивых к нагреванию в кислой среде, что отличает их от лабильных ингибиторов плазмы крови. Выделяют две группы КСИ: плазменные и местносинтезируемые тканевые ингибиторы, отличающиеся по биохимическому строению [62].

Плазменные КСИ являются производными протеолитической деградации интер-а-ингибитора трипсина (ИссИ), проявляют ингибиторную активность в отношении трипсина, химотрипсина, плазмина [62, 141, 15]. По электрофоретической подвижности КСИ плазмы крови подразделяются на две фракций с подвижностью осрПИ и преальбумина. У здоровых лиц содержание КСИ в плазме крови мало, но увеличивается при воспалении и коррелирует с содержанием С-реактивного белка [340].

При гидролизе ИаИ плазмы крови образуются легкая и тяжелые цепи [460]. Легкая цепь содержит предшественник бикунина, который по химическому строению аналогичен ингибитору Кунитца [445]. С бикунином через хондроитинсульфат связаны тяжелые цепи, взаимодействующие с гиалуроновой кислотой (ГК) и стабилизирующие ВКМ [282, 405]. Перенос тяжелых цепей на ГК обусловлен белком SHAP (serum-derived hyaluronan-associated protein), требует присутствия TNFAIP6 (tumor necrosis factor alpha induced protein 6), ионов кальция [165, 435] и бикунина как SHAP-представляющей молекулы [460, 442]. Дефект бикунина приводит к нарушению оплодотворения и эмбриогенеза. Внутрибрюшинное введение предшественника бикунина полностью устраняет дефекты соединительной ткани [185].

Кроме плазмы крови бикунин обнаружен в печени, почках, эндометрии, ооцитах, плевральной, бронхоальвеолярной жидкостях [354, 442]. Считают, что в респираторном тракте он является одним из основных ингибиторов калликреина и выполняет защитную функцию при активации протеолиза на воздействие аллергена. В почечных канальцах бикунин препятствует кристаллизации оксалатов [416].

Местносинтезируемые ингибиторы, в отличие от плазменных, имеют меньшую молекулярную массу, от 4000 до 18000 Да [209, 62]. Местносинтезируемые ингибиторы относятся к белкам семейства WAP (whey acidic protein) гена trappin (transglutaminase substrate and wap domain-containing protein). Белки этого семейства характеризуются наличием N-концевого трансглутаминазного домена и С-концевого домена с четырьмя дисульфидными связями [175].

Исследования КСИ в 80-90 годах прошлого века обнаружили широкое распространение местносинтезируемых ингибиторов в тканях организма. КСИ присутствуют в бронхиальных секретах - BMPI (bronchial mucus proteinase inhibitor) [134]. В слизистых найдены ингибитор протеиназ слизистой (mucus protease inhibitor), антилейкопротеиназа (antileukoprotease), бронхиальный секреторный ингибитор (bronchial secretory inhibitor), ингибитор I семинальной жидкости человека (human seminal inhibitor I), секреторный ингибитор шейки матки (cervix uteri secretion inhibitor) и секреторный лейкопротеиназный ингибитор (secretory leukoprotease inhibitor) [цит. по 201]. При изучении химического строения этих ингибиторов оказалось, что они представлены одним веществом, названным секреторным лейкоцитарным протеиназным ингибитором (SLPI - secretory leukocyte protease inhibitor). Местносинтезируемым белком специфически ингибирующим активность эластазы является элафин (elafin, elastase-specific inhibitor) [210, 233].

КСИ, выделенные из различных источников, ингибируют нейтрофильную эластазу, катепсин G, трипсин и химотрипсин, химазу и триптазу тучных клеток [244]. КСИ бронхиального секрета (BMPI, SLPI) способны тормозить активность протеиназ связанных с осг-МГ [154]. Соотношение ВМРІ/агПИ в бронхоальвеолярном лаваже достаточно высокое и составляет 0,7 [106].

КСИ плазмы крови могут быть как положительно, так и отрицательно реагирующими белками острой фазы при панкреатите, колите, сепсисе, остром репираторном дистресс-синдроме [207, 316, 300, 99]. Степень дисбаланса протеиназы-ингибиторы зависит от тяжести заболевания [23].

КСИ обладают антибактериальными, противогрибковыми и антивоспалительными свойствами [201, 233, 256, 134, 394]. Эти белки ингибируют ЛПС-индуцированное высвобождение медиаторов воспаление макрофагами, блокирует образование ИЛ-1 бета и IL-6, ингибирует фосфорилирование МАРК, деградацию 1-кВ и NF-KB [389, 142, 264J, секрецию хемокинов MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2) и МСР-1 (monocyte chemotactic protein-1), экспрессию катепсина S [384, 388]. SLPI снижает продукцию оксида азота [251], активацию NF-KB [384] и транскрипцию CCAAT/enhancer binding protein Р, увеличивает продукцию фактора роста гепатоцитов HGF, оказывающего антивоспалительный и регенераторный эффект [393]. Предполагают, что антивоспалительные свойства элафина и SLPI определяются их способностью проникать в клетку и воздействовать на убиквитин-протеасомный путь активации NF-KB иАР-1 [235,242].

Для КСИ выявлена антивирусная активность в отношении саркомы Капоши, иммунодефицита и гепатита Е [443, 133]. SLPI слюны в физиологической концентрации ингибирует проникновение вируса иммунодефицита 1 и 2 в клетки [392, 391]. Анти-HIV-l активность SLPI проявляется на монокулеарах периферической крови, Т лимфоцитах, клетках опухоли [269]. Механизм антивирусного действия SLPI связан с нарушением взаимодействия вируса с рецепторами хемокинов CCR5 и CXCR4 клеток-мишеней, его интернализацией на этапе связывания с мембраной и обратной транскрипции [443, 160]. Кроме того, SLPI увеличивает уровень глутатиона, уменьшая оксидант-обусловенное повреждение ткани, содержание простагландина Е2 и активность матриксных металлопротеиназ [251, 389], ограничивая повреждение ткани.

Антивоспалительные свойства КСИ определяют их присутствие в репродуктивном тракте. Молекулярная масса этих КСИ составляет 15-17 кДа. Функция КСИ при оплодотворении и эмбриогенезе заключается в защите половых путей от патогенных микроорганизмов [350]. КСИ могут стимулировать пролиферацию эпителия эндометрия и способствовать имплантации эмбриона [292].

Определение активности протеиназ

Активность определяли методом Т.С. Пасхиной, А.В. Кринской [67] по скорости гидролиза БАЭЭ, после получения неадсорбированной фракции белков, содержащей калликреин и калликреиноген, гель-фильтрацией на ДЭАЭ-сефадексе А-50. К 0,25 мл плазмы крови (0,5 мл мокроты, кожного экссудата) добавляли 0,75 мл (0,25 мл) 0,02 М фосфатным буфером (рН=7.0) и наносили на колонку из полистирола объемом 3x0.8 см, заполненную ДЭАЭ-сефадексом А-50. Белки элюировали 0,02 М фосфатным буфером (рН=7,0), содержащим 0.05 М NaCL, собирая 5 мл фильтрата.

Для определения активности калликреина (КФ 3.2.21.8) к 1 мл элюата добавляли 1 мл 0,1М фосфатного буфера рН=8,0 и 1 мл 1,5мМ раствора БАЭЭ в этом же буфере. Контроль содержал 2 мл буфера и 1мл БАЭЭ. Измеряли прирост оптической плотности при 253 нм в течение 15 минут.

При определении активности калликреиногена к 1 мл неадсорбированной фракции добавляли 0,8 мл 0,1М фосфатного буфера рН=8,0 и 0,1 мл 0,1% раствора трипсина в 2 мМ растворе HCL. Пробу выдерживали в течение 2 мин при 25С, после чего добавляли 0,1 мл 2% раствора овомукоида в 0,1 М фосфатном буфере рН=8,0 для удаления избытка трипсина. Через 15 мин в пробу вносили 1 мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ и измеряли прирост оптической плотности при 253 нм за минуту. Активность выражали в мЕ/мл. Референтные значения для активности калликреина составляют 0-34 мЕ/мл, для калликреиногена 230-300 мЕ/мл.

Определение активности трипсиноподобных протеиназ Активность трипсиноподобных протеиназ (КФ 3.4.21.4 - КФ 3.4.21.8) определяли с использованием двух синтетических субстратов N-бензоил-Ь аргинин-р-нитроанилида (БАПНА) и БАЭЭ [8, 37]. БАЭЭ-эстеразную активность трипсиноподобных протеиназ измеряли по приросту оптической плотности при 253 нм [37]. К 0,1 мл плазмы крови, разведенной в 10 раз (или 0,1 мл мокроты), добавляли 1,9 мл 0,05 М трис HCL буфера (рН=7,8), 1 мл 1,5 ммоль/л раствора БАЭЭ, измеряли оптическую плотность при 253 нм в течение 6 минут. Активность трипсиноподобных протеиназ выражали в нмоль БАЭЭ/мин на 1 мл биологической жидкости. Для определения активности трипсина (КФ 3.4.21.4) смешивали 0,5 мл плазмы крови, разведенной в 2 раза физиологическим раствором и 4 мл 0,02% раствора БАПНА, инкубировали 30 мин при 37С и добавляли 1 мл 30% раствора уксусной кислоты. Затем измеряли оптическую плотность опытной пробы против контроля при 410 нм. В контрольной пробе реакцию останавливали до инкубации. Активность трипсина выражали в миллиединицах (мЕ). 1мЕ соответствует расщеплению 1 мкмоль субстрата за 1 мин. Для расчета использовали формулу: Еі-Е2/АхЗЗ,3(мЕ/мл), где Еь Е2 -оптическая плотность опытной и контрольной проб; 33,3-расчетный коэффициент; А - концентрация р-нитроанилида, соответствующая 1 единице оптической плотности. Референтные значения для активности трипсина составляют 0-4 ед/мл (субстрат БАПНА), трипсиноподобных протеиназ 90-100 нмоль БАЭЭ/мин-мл. 3. Определение активности пепсиноподобных протеиназ Метод основан на спектрофотометрическом определении тирозина, образующегося при ферментативном гидролизе гемоглобина под действием пепсиноподобных протеиназ (КФ 3.4.23.1 - КФ 3.4.23.5) [42]. Для этого к 0,5 мл 1 % раствора гемоглобина, приготовленного на 0,1 М ацетатном буфере (рН=5,0), прибавляли 0,2 мл плазмы крови и инкубировали в течение 1 часа при 37С, затем добавляли 3 мл 3% раствора ТХУ. В контрольную пробу ТХУ добавляли до инкубации. После инкубации пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 280 нм. Расчет активности проводили по калибровочному графику 1,65 ммоль/л тирозина. В норме активность пепсиноподобных протеиназ плазмы крови составляет 0-0,2 нмоль тир/мин-мл. В гомогенатах тканей определяли активность катепсина D (КФ 3.4.23.5): свободную как описано выше и общую, предварительно обрабатывая пробу тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,1%. Активность эластазоподобных протеиназ (КФ 3.4.21.37 и КФ 3.4.21.11) измеряли по скорости гидролиза р-нитрофенилового эфира Ы-бутилоксикарбонил-Ь-аланина (БАНЭ) при 347,5 нм [37]. В кювете спектрофотометра смешивали 0,2 мл плазмы крови разведенной в 10 раз (или 0,2 мл мокроты) и 2,7 мл 0,05 М натрий-фосфатный буфер, рН=6,5. Добавляли 0,1мл раствора 0,01М раствор БАНЭ в ацетонитриле, перемешивали и измеряли прирост оптической плотности в течение 5 минут при длине волны 547,5 нм. Активность выражали в нмоль БАНЭ/ мин на 1 мл биологического материала. Референтные значения составляют 90-100 нмоль БАНЭ/мин мл. 5. Определение коллагеназоподобной активности плазмы крови Активность коллагеназоподобных протеиназ (ММП1 - КФ 3.4.24.7; ММП8 - КФ 3.4.24.34) определяли по содержанию гидроксипролина, образующегося при гидролизе коллагена I типа [88]. В две пробирки (одна из них - контроль) вносили по 10 мг коллагена, 0,5 мл 4 мМ раствора СаС12 в боратном буфере (рН=8,0). В опытную пробирку добавляли 0,5 мл плазмы крови. Содержимое пробирок инкубировали при 37С в течение 4 часов. Затем в контрольную пробирку добавляли 0,5 мл холодной плазмы крови. В обе пробирки вносили по 0,5 мл 6% раствора ТХУ и 57% раствора хлорной кислоты, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. 1 мл надосадочной жидкости переносили в мерные пробирки и проводили гидролиз при 100С в течение 40 минут. Охлаждённые гидролизаты нейтрализовали 24% едким натром до рН=8,0, объём доводили до 4 мл дистиллированной водой.

Активность ингибиторов протеиназ в экологически неблагоприятных районах

Снижение активности ингибиторов выявлено у 19-27% лиц, проживающих в экологически загрязненных районах Томской области. Следует отметить, что на территории признанной экологически чистой (Лоскутово, Кар гала) снижение активности а і-ПИ обнаружено почти у половины населения, включенного в исследование. Дефицит а і-ПИ, как известно, является патогенетическим фактором развития заболеваний бронхо-легочной системы. Высокое распространение дефицита агПИ, наблюдаемого у жителей Томской области, связано с тем, что 64% обследованных были дети, наиболее подверженные частым простудным заболеваниям.

Для оценки состояния здоровья населения определяли биохимические показатели функции органов: активность амилазы (поджелудочной железы), аминотрансфераз (печень), содержание мочевины (почки). Кроме того, изучали активность 5 -нуклеотидазы, мембранного фермента, отражающего степень повреждения клеток. Результаты представлены в табл.34. У жителей пос. Наумовка и Георгиевка (зона І), у которых было выявлено увеличение акивности а2-МГ, активность АЛТ и ACT повышена по сравнению с населенными пунктами IV зоны. Увеличение активности аминотрансфераз является одним из показателей повреждения гепатоцитов, в том числе радиационно-химического генеза. В зоне II (Бундюр, Чаинск, Коломенские Гривы) была высокая активность 5 -нуклеотидазы. Известно, то активность 5 -нуклеотидазы зависит от дозы радиации. Дозовая зависимость наблюдается в пределах 0,5-1,1 Гр. Следует отметить, что в этой зоне наблюдалось увеличение активности а і-ПИ - биоиндикатора радиационного воздействия и развития онкологических заболеваний. Кроме того, в зоне II обнаружено снижение активности амилазы, свидетельствующее о недостаточности поджелудочной железы. Низкая активность амилазы выявляется также при гипотиреозе, расстройстве питания и нарушении веса, интоксикации. У лиц, проживающих в населенных пунктах зоны III, представляющей водный путь распространения радиационно-химических загрязнений, обнаружено увеличение содержания мочевины. Возрастание уровня мочевины выше 6,6 ммоль/л рассматривают как признак патологии почек и развития токсемии. Таким образом, увеличение активности а і-ПИ характерно для населения, проживающего на территории с повышенной радиационной нагрузкой, сопровождается возрастанием активности 5 -нуклеотидазы поврежденных клеток, снижением активности амилазы и нарушением функции поджелудочной железы. Повышение активности ос2-МГ выявлено у лиц, проживающих в 30-километровой зоне радиационно-химического воздействия СХК, связано с увеличением активности аминотрансфераз, нарушением функции печени. У части населения Томской области, в основном у детей, обнаружено снижение активности ингибиторов плазмы крови, что может являться предрасполагающим фактором развития простудных заболеваний бронхо-легочной системы. В целом, при условиях физиологической нормы существует баланс между активностью ингибиторов и протеолитическими ферментами. Активность ингибиторов протеиназ можно использовать как биоиндикатор воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, оценки состояния организма и прогнозирования развития заболеваний. В связи с этим, в следующих разделах диссертации рассматривается роль ингибиторов протеиназ при заболеваниях бронхо-легочной системы, желудочно-кишечного тракта и онкологических заболеваниях. Снижение активности а і-ПИ имеет большое значение для развития заболеваний печени, бронхо-легочной системы. Генетический дефицит приводит к возникновению эмфиземы легких, ювенильного цирроза печени. Снижение активности ингибиторов может быть приобретенным, развивающимся, как правило, на фоне активации протеолиза. Комплексная оценка ингибиторов плазмы крови и тканей, их взаимосвязь с плазменным и внутриклеточным протеолизом ранее не проводилась. Между тем изучение реакции ингибиторов при патологических процессах может иметь не только теоретическое, но и практическое значение для мониторинга и прогнозирования исходов заболеваний. Значение ингибиторов в функционировании бронхо-легочной системы заключается в регуляции активности нейтрофильной эластазы, которая секретируется при дегрануляции нейтрофилов в очаге воспаления. В основе заболеваний легких лежит хроническое воспаление, для которого характерно нарушение баланса между эластазой и ингибиторами, повреждение альвеолярной стенки, развитие обструктивного синдрома. В настоящем разделе приведены данные изучения активности ингибиторов плазмы крови, индуцированной мокроты, кожного экссудата при обструктивных заболеваниях бронхо-легочной системы: хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астме.

Активность ингибиторов, протеиназ и перекисное окисление липидов при травмах кости

В плане изучения взаимосвязи плазменного и тканевого протеолиза проводили определение активности ингибиторов в слюне и кожном смыве. Выбор слюны как объекта исследования ингибиторной активности определяется тем, что по химическому составу слюны можно судить о патологических процессах, происходящих не только в слюнных железах, но и в других органах организма. Считается доказанной взаимосвязь изменения состава слюны с развитием заболеваний пищеварительной системы. Изучение слюны и кожного смыва обусловлено тем, что эти жидкости находятся в состоянии обмена с плазмой крови и их биохимический состав зависит от процессов метаболизма в организме. Активность ингибиторов определяли в стадии обострения язвенной болезни при госпитализации детей в стационар и после курса стандартного лечения. Лечение включало применение ранитидина, антацидных препаратов (маалокс, альмагель, кальция гидрокарбонат и др.), репарантов (метилурацил), антимикробных (де-нол, трихопол), цитопротекторных (вентер) средств, соблюдение диеты.

Активность а і-ПИ в слюне и кожных смывах практически здоровых детей была ниже, чем в плазме крови. При язвенной болезни активность а\-ПИ повышалась: в плазме крови в 1,5 раза, в слюне в 2,0 раза, а в кожных смывах в 3,0 раза, по сравнению с контролем. После курса лечения активность агПИ снижалась в плазме крови, слюне и кожных смывах, соответственно, на 47%, на 50%, 67% и не отличалась от контроля.

В отличие от активности а і-ПИ, активность а2-МГ плазмы крови, слюны и кожных смывах существенно не менялась при язвенной болезни (табл. 47). Однако после лечения в кожных смывах больных активность а2-МГ возросла в 1,8 раз по сравнению с контролем. Отличие реакции аг ПИ и а2-МГ в исследуемых биологических жидкостях, вероятно, объясняется молекулярной массой и разной ролью этих белков. Активность а і-ПИ в большей степени связана с его содержанием в плазме крови, в то время как на активность а2-МГ, возможно, влияют такие факторы как биохимический состав кожных покровов, липофильной пленки и присутствие бактерий.

В кожных смывах активность КСИ практически не отличалась от контроля. После лечения активность КСИ в плазме крови и кожных смывах снижалась, соответственно, на 38% и 56% по отношению к показателю до лечения. В слюне активность КСИ после лечения возрастала в 1,6 раза по отношению к показателям до лечения и в 4,3 раза по сравнению с контролем.

При проведении корреляционного анализа выявлена зависимость между активностью КСИ в плазме крови, слюне и в кожных смывах. Более выраженная взаимосвязь наблюдается между активностью КСИ в плазме крови и смыве с коэффициентом корреляции 0,96. Наряду с увеличением активности КСИ плазмы крови больных детей в общей группе были выявлены больные с низкой активностью этого ингибитора. У ребенка К. низкая активность КСИ была также в слюне и в кожных смывах. Кроме язвенной болезни у этого ребенка установлено ожирение 3 степени, увеличение щитовидной железы, печени по типу жирового гепатоза. У пациента Р. дефицит КСИ сопровождался частым обострением заболевания, трудно поддающегося лечению, замедлением рубцевания язвы. Таким образом, активность а і-ПИ в плазме крови, слюне, кожном смыве возрастает при язвенной болезни и снижается после лечения. Активность КСИ в плазме крови коррелирует с ингибиторной активностью в кожном смыве и уменьшается при ремиссии заболевания. После лечения наблюдается повышение ингибиторной активности биологических жидкостей: в слюне возрастает активность КСИ, в кожном смыве увеличивается активность а2-МГ. Выше было показано, что у 30% детей и у 44% взрослых с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки наблюдается дефицит ингибиторов в частности а і-ПИ в плазме крови. Снижение активности а і-ПИ может быть связано с нарушением пострансляционного процессинга белка и появлением ингибитора с модифицированной структурой и измененными ингибиторными свойствами. В связи с этим было проведено фенотипирование а і-ПИ методом изоэлектического фокусирования в полиакриламидном геле. Результаты представлены в табл. 49. При язвенной болезни двенадцатиперстной кишки выявлен нормальный фенотип oti-ПИ - ММ, и три его субтипа МіМ3 (33 % больных), МіМ (24%), М2М2 (43% больных). От фенотипа агПИ зависела активность ингибитора в плазме крови. При ММ3 фенотипе активность а і-ПИ была в 1,8 раза выше, при МіМі - не отличалась от контроля, а при М2М2 - была на 40% ниже контрольных значений (24,1+1,1 ИЕ/мл). Следует отметить, что у двух больных с фенотипом М2М2 через 12 месяцев после лечения зарегистрирован рецидив заболевания.