Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Фенилкарбоновые кислоты при нарушениях иммунореактивности и бактериальных инфекциях (обзор литературы)
1.1 Актуальность проблемы инфекции при критических состояниях 9
1.2 Роль нейтрофилов в защите от инфекции 12
1.3 Фенилкарбоновые кислоты и их биологические свойства
1.3.1 Предпосылки к исследованию 19
1.3.2 Источники фенилкарбоновых кислот 23
1.3.3 Нарушение выведения фенилкарбоновых кислот 30
1.3.4 Биологические свойства фенилкарбоновых кислот 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
ГЛАВА 3. Модификация и адаптация методики определения фенилкарбоновых кислот (результаты собственных исследований)
3.1 Подбор инструментальных параметров анализа 40
3.2 Модификация пробоподготовки 41
3.3 Апробация адаптированной методики 45
ГЛАВА 4. Концентрации фенилкарбоновых кислот (ФКК) в норме и их изменение при бактериальных воспалительных процессах разной степени тяжести (результаты собственных исследований)
4.1 ФКК в группе контроля (здоровые доноры) 49
4.2 ФКК при локальных (амбулаторные больные) и тяжелых (больные отделения реаниматологии) инфекциях
4.3 ФКК у больных с разной степенью органных нарушений 57
ГЛАВА 5. Влияние фенилкарбоновых кислот на фагоцитарную функцию нейтрофилов (результаты собственных экспериментальных исследований) 63
Заключение 71
Выводы 73
Список литературы
- Фенилкарбоновые кислоты и их биологические свойства
- Модификация пробоподготовки
- ФКК при локальных (амбулаторные больные) и тяжелых (больные отделения реаниматологии) инфекциях
- ФКК у больных с разной степенью органных нарушений
Введение к работе
Актуальность
Актуальность проблемы инфекции в отделениях реаниматологии остается стабильно высокой, несмотря на прогресс в области медицины и техники. По данным эпидемиологических исследований у 30-50% больных в критическом состоянии документируется инфекционный процесс [Alberti С, 2002; Vincent J.L., 2009], в основном бактериальной этиологии [Vincent J.L., 2009; Руднов В.А., 2011]. Повышенный риск развития инфекции у больных в критических состояниях связан с высокой степенью бактериальной контаминации окружающей среды, использованием большого количества инвазивных процедур [Хорошилов С.Е., 2013], проведением длительной искусственной вентиляции легких [Голубев A.M., 2015], ослаблением защитной функции организма, нарушениями метаболизма на фоне стрессовой реакции организма [Заржецкий Ю.В., 2014] и риском развития стрессовых язв и транслокации микробиоты кишечника [Мороз В.В., 2004; Vincent J.L., 2009]. Нейтрофилы являются первой линией защиты организма от бактериальных агентов [Косицкий Г.П., 1985; Borregaard N., 2010]. Несостоятельность первичного звена иммунитета приводит к развитию инфекционных процессов и их длительному течению [Vento S., 2003; Сурков А.Н., 2012]. Данные литературы свидетельствуют о нарушении защитной функции нейтрофилов у больных в критическом состоянии, что связано с неблагоприятным исходом [Черневская Е.А., 2008; Danikas D.D., 2008].
Бактериальная этиология жизненно опасных осложнений [Vincent J.L., 2009; Мороз В.В., 2013] указывает на необходимость поисковых исследований, в том числе направленных на изучение роли микробных метаболитов. В последние годы растет число публикаций, в которых особое внимание уделяется фенилкарбоновым кислотам - производным фенилаланина и тирозина, а также полифенолов растительного происхождения, продуцируемым бактериями из состава микробиоты человека [Gonzalez-Barrio R.,2011; Russell W.R., 2013]. Наибольший интерес привлекают фенилмолочная, фенилуксусная, фенилпропионовая, п-гидроксифенилуксусная и п-гидроксифенилмолочная кислоты (ФМК, ФУК, ФПК, п-ГФУК и п-ГФМК соответственно), так как их уровень значительно изменен у больных с сепсисом по сравнению с нормой [Khodakova А., 2007; Белобородова Н.В., 2009]. Существует связь между метаболическим профилем фенилкарбоновых кислот и исходом
заболевания, а также их участием в развитии полиорганной недостаточности [Белобородова Н.В., 2012].
В ряде исследований отмечается повышенное содержание некоторых фенилкарбоновых кислот у больных с хронической почечной и печеночной недостаточностью различного генеза, что свидетельствует о накоплении этих веществ в организме больных при нарушении их связывания и выведения [Leibich Н.М., 1985; Scholze А., 2007; Aronov P.А., 2011]. Экспериментальные и клинические исследования подтверждают наличие биологической активности у фенилкарбоновых кислот, особый интерес вызывает их способность влиять на: функции митохондрий [Fedotcheva N.I., 2008], нейтрофилов [Cohen G., 2013], транспортные белки [Jankowski J., 1998] и вегетативную нервную систему [Beppu Y., 2013].
В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение роли фенилкарбоновых кислот в развитии бактериальных инфекционных процессов.
Цель исследования
Установить взаимосвязь уровня ароматических метаболитов фенилкарбоновых кислот и тяжести гнойно-воспалительного процесса для обоснования использования количественного анализа фенилкарбоновых кислот в клинической практике.
Задачи
-
Модифицировать и адаптировать методику газохроматографического определения фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови человека к использованию в условиях клинических лабораторий
-
Изучить качественное и количественное содержание фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови здоровых людей (доноров)
-
Изучить закономерности изменения уровня фенилкарбновых кислот (ФКК) в сыворотке крови больных в зависимости от степени тяжести гнойно-воспалительного процесса
-
Выявить способность ключевых фенилкарбоновых кислот влиять на фагоцитарную функцию нейтрофилов человека в исследовании in vitro.
Научная новизна работы Впервые показано, что фенилкарбоновые кислоты всегда присутствуют в сыворотке крови здоровых людей.
Установлено, что уровень фенилкарбоновых кислот отражает тяжесть течения гнойно-воспалительного процесса, повышается при легком течении инфекции и может достигать значений, превышающих норму более чем в 100 раз при крайне тяжелом течении бактериального воспалительного процесса.
Установлено, что фенилкарбоновые кислоты в клинически значимых концентрациях способны подавлять фагоцитарную активность нейтрофилов.
Практическая значимость
Определение уровня фенилкарбоновых кислот методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием (ГХ-ПИД) применяется в научно-исследовательской работе ФГБНУ «НИИОР» и МГУ им. М.В. Ломоносова.
Установлены нормальные значения фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови здоровых доноров, что будет использовано в дальнейшем при проведении научно-исследовательских и прикладных работ.
Результаты настоящего исследования использованы для разработки «Способа лабораторной оценки эффективности лечения интоксикации у реаниматологических больных» (получен Патент РФ № 2522877) и «Способа лабораторной оценки эффективности антибактериальной терапии» (получен Патент РФ № 2543335). Основные положения, выносимые на защиту
-
Фенилкарбоновые кислоты всегда присутствуют в сыворотке крови человека и в норме поддерживаются организмом в стабильно низких концентрациях.
-
Уровень фенилкарбоновых кислот повышается при развитии неспецифического гнойно-воспалительного процесса и связан с его тяжестью.
-
Некоторые фенилкарбоновые кислоты (фенилуксусная, фенилмолочная, п-гидроксифенилуксусная, п-гидроксифенилмолочная кислоты) способны подавлять фагоцитарную активность нейтрофилов.
Публикации Материалы данной работы были представлены в докладах на российских и международных конференциях, в том числе: на XV Всероссийской конференции с международным участием «Жизнеобеспечение при критических состояниях» Москва, 2013г., XVII форуме «Национальные дни лабораторной медицины России» Москва, 2013г., Научно-практических конференциях молодых ученых «Современные методы диагностики и лечения в реаниматологии», Москва, 2013 и 2014 гг., IX и X
Ежегодных конференциях с международным участием «Проблема инфекции при критических состояниях», Москва, 2013 и 2014 гг., Fifth Congress of the European Shock Society, Vienna, Austria, 2013 г., 24th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Barcelona, Spain 2014 г., 34th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine, Brussels, Belgium 2014 г. и др.
По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, из них 3 статьи в российских рецензируемых журналах, включенных в перечень ВАК, получено 2 Патента на изобретение.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, представляющей материалы и методы исследования, 3 глав с изложением и обсуждением результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами и 13 рисунками. Библиографический список включает 181 источник (из них 57 работ отечественных авторов и 124 зарубежных).
Фенилкарбоновые кислоты и их биологические свойства
Актуальность проблемы инфекции при критических состояниях Защитные функции организма у больных в критических состояниях ослаблены, что повышает риск развития инфекционных процессов. С одной стороны, это связано с выраженными нарушениями метаболизма на фоне стрессовой реакции организма на хирургическое вмешательство, ожоги, травму, ишемию, что ослабляет существующие функциональные барьеры, препятствующие развитию инфекционного процесса. Отсутствие сдерживающих факторов в условиях нарушения микроциркуляции способствует транслокации бактерий, как собственной микробиоты, так и представителей нозокомиальных штаммов, колонизирующих слизистые больных, находящихся в отделениях реаниматологии и интенсивной терапии (ОРИТ) [29; 3]. С другой стороны, лечение больных в критических состояниях сопряжено с использованием большого количества инвазивных процедур, таких как катетеризация магистральных сосудов, мочевого пузыря, проведение искусственной вентиляции легких; применением лекарственных препаратов, приводящих к подавлению активности иммунной системы, что повышает риск инфицирования организма полирезистентными штаммами [29, 7]. На этом фоне развитие локальных инфекционных процессов имеет тенденцию к быстрой генерализации [29, 7, 173]. Таким образом, актуальность проблемы инфекции у больных, находящихся в критическом состоянии, чрезвычайно высока, и механизмы развития инфекционного процесса у этой категории больных требуют дальнейшего изучения.
Ряд зарубежных многоцентровых эпидемиологических исследований демонстрирует, что у больных отделений реаниматологии инфекционный процесс выявляется в 30-50 процентах случаев [54, 172, 173]. При этом чаще всего (47-68% случаев) очаг инфекции документируется в легких [171-173], далее по частоте встречаемости (20-22% случаев) следует абдоминальная локализация [171, 173], инфекции мочевыводящих путей (14-18%) [172, 173] и катетер-ассоциированные инфекции (в 12-15% случаев) [172, 173]. В результате микробиологических исследований чаще всего обнаруживаются грамотрицательные (Ps. Species, Е. Coli, Ps. Aeruginosa) и грамположительные бактерии (Е. Faecium, St. Aureus, St. Epidermidis, Streptococcus pneumoniae), реже определяются грибы (рода Candida) [171-173]. По данным этих исследований летальность среди больных отделений реаниматологии с инфекционными процессами в 2-3 раза выше, чем среди больных без инфекции [54, 172, 173]. Также, в одном из исследований показано, что неблагоприятный исход не связан с госпитализацией в ОРИТ в регионе с высоким уровнем резистентности к антибиотикам [90, 173].
Масштабы Российских эпидемиологических исследований не столь велики. Однако, по данным однодневного многоцентрового исследования (62 ОРИТ 29 городов России) из 521-го больного, находившегося в ОРИТ, у 178-ми имелся инфекционный процесс (34,1%). В 53% из 178-ми описанных случаев инфекция развилась вне стационара, в 47% - в госпитальных условиях. Ведущими возбудителями инфекции были грамотрицательные бактерии. Летальность среди больных с инфекцией составила 30%, в то время как средний уровень общей летальности составил 13% [37].
Сотрудниками Научно-исследовательского института общей реаниматологии имени В. А. Неговского - головного учреждения, занимающегося проблемами анестезиологии и реаниматологии в России, ведется постоянный поиск новых методов профилактики, диагностики и лечения инфекционных осложнений у больных в критических состояниях. Особая роль отведена решению проблемы развития нозокомиальных пневмоний, являющихся лидирующими инфекционными процессами у больных в критических состояниях во всем мире [23, 31, 49]. Так, благодаря предложенным мерам профилактики, ученым-клиницистам удалось снизить частоту развития гнойных трахеобронхитов и вентилятор-ассоциированных пневмоний в группах больных высокого риска развития нозокомиальных инфекций более чем в два раза [23].
Развитие сепсиса является апофеозом инфекционных процессов, согласно одному из последних Международных руководств Surviving Sepsis Campaign: 2012, сепсис определяют как наличие инфекции (документированной или предполагаемой) одновременно с проявлениями системной манифестации инфекции [79]. Однако на основании предложенных клинических признаков невозможно отличить изменения, развивающиеся при неинфекционных и инфекционных процессах, так как в основе лежат одни и те же реакции активации иммунитета, нарушений коагуляции, повреждения и регенерации тканей. В связи с чем, сепсис является не только лечебной, но и диагностической проблемой [30].
В двух ретроспективных исследованиях с использованием МКБ 9 (ICD-9-СМ) оценивалась частота встречаемости сепсиса в США. В первой работе, Martin G.S. с соавторами показали, что в проанализированном интервале времени (1979-2000 гг.) частота диагностики септических процессов прирастала на 8,7% ежегодно. При пересчете на 100000 населения в 1979 году зарегистрировано 83 случая сепсиса, а в 2000 году 240 случаев [119]. Dombrovskiy V.Y. с соавторами показали, что за период в десять лет частота развития тяжелого сепсиса (осложненного полиорганной недостаточностью) во всех случаях сепсиса выросла с 25,6% в 1993 г. до 43,8% в 2003 г. (р 0,001). Авторы отметили ежегодный рост частоты госпитализаций и неблагоприятных исходов, связанных с возрастом [82].
По данным исследования, проведенного в Кемеровской области, среднемноголетний показатель заболеваемости сепсисом за период с 1993г. по 2004 г. составил 9,97±0,73 случаев на 100000 населения. Наблюдалась устойчивая тенденция к росту заболеваемости за этот период - в 4,7 раза (р 0,01). Было показано, что каждый 4-й случай сепсиса завершался летальным исходом, а в 18% случаев заболевание не диагностировалось прижизненно. У мужчин сепсис развивался в 1,3 раза чаще, чем у женщин. Для мужчин максимальные уровни заболеваемости установлены в возрасте от 40 до 59 лет, для женщин - в возрасте 20-29 лет. К группам высокого риска были отнесены лица, страдающие инъекционной наркоманией, больные сахарным диабетом и люди, профессиональная деятельность которых сопряжена с частыми травмами кожных покровов - шахтеры, работники транспорта, а также больные после операций на желудочно-кишечном тракте и магистральных сосудах [47].
С целью снижения частоты инфекционных осложнений в отделениях реаниматологии и интенсивной терапии во всем мире непрерывно ведется поиск оптимальных способов предоперационной подготовки больных, разрабатываются рациональные режимы антибиотикопрофилактики и терапии, внедряются в клиническую практику новые диагностические подходы, совершенствуется инфекционный контроль. Однако, несмотря на все предпринимаемые меры, летальность среди данной группы больных, остается стабильно высокой, что указывает на необходимость новых поисковых исследований.
Модификация пробоподготовки
Таким образом, повышение концентрации фенилкарбоновых кислот (ФУК, ФПК, ФМК, п-ГФУК и п-ГФМК) в организме человека может быть связано с их поступлением в свободном виде в составе продуктов питания, в результате метаболизма собственной микробиотой кишечника природных полифенолов и аминокислот, поступающих с пищей, а также с эндогенным метаболизмом фенилаланина и тирозина.
В организме человека фенилкарбоновые кислоты подвергаются связыванию в клетках почек и печени с образованием метилированных производных, сульфоконъюгатов, глюкуронидов [121], конъюгатов глицина и глютамина [125], и/или выведению в связанном и свободном виде с мочой [94].
У больных с циррозом печени наблюдается повышенная экскреция с мочой п-ГФМК, п-ГФУК, п-гидроксифенилпировиноградной, п-гидроксибензойной кислот [113]. Muting D. и соавторы, основываясь на клинических данных, предложили использовать п-ГФМК в моче как маркер печеночной недостаточности [128]. Manna S.K. с соавторами, основываясь на результате эксперимента на крысах, предложили использовать ФМК и индол-3-молочную кислоту как маркеры алкоголь-индуцированных заболеваний печени [117]. Описанные работы могут свидетельствовать о нарушении связывания ФКК клетками печени, что приводит к повышению их экскреции в свободном виде с мочой.
Kopple J.D. обнаружил накопление метаболитов фенилаланина и тирозина (ФМК, п-ГФУК и п-гидроксибензойной кислоты) в плазме крови больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН) [104]. Niwa Т. с соавт. зафиксировали рост сывороточной концентрации девяти гидроксифенольных кислот у больных с ХПН, одна из которых п-ГФУК [132]. Itoh Y. с соавт. обнаружили пятикратное повышение свободной ФУК у больных с ХПН в сравнении с донорами, но особый интерес вызывает обнаруженное более чем двухсоткратное повышение уровня глютамин-связанной ФУК в сыворотке больных ХПН [148]. Aronov Р. А. с соавт. при сопоставлении уровня глютамин-связанной ФУК в сыворотке больных, нуждающихся в гемодиализе, с сохранным кишечником и после колэктомии, пришли к выводу о важной роли метаболической активности микробиоты толстого кишечника человека, так как у больных после колэктомии уровень связанной ФУК был ниже почти в 15 раз [57]. Описанные работы указывают на связь уровня ФКК с функцией выведения почек, а также подтверждают микробное происхождение ФКК.
Таким образом, повышение концентрации ФКК в организме человека может быть связано с нарушением функций органов детоксикации и выведения.
В царстве растений фенилкарбоновые кислоты (ФУК, п-ГФУК и ФМК) играют очень важную роль, они являются ауксинами - стимуляторами роста побегов и плодов растений [53, 105]. В то же время, в царствах грибов и бактерий присваивается ФКК противоположный эффект. Считается, что они участвуют в аллелопатии — явлении, при котором один вид организма выделяет в биологическую среду соединения, способные замедлять или подавлять размножение другого вида. В микробиологических исследованиях установлено, что ФМК и п-ГФМК обладают противогрибковой и бактерицидной активностью [80, 111], а ФУК и ФПК в большей степени подавляют рост Escherichia coli и Staphylococcus aureus, чем их гидроксилированные производные [75, 118].
Эффекты, оказываемые ФКК на животных и человека, остаются не до конца изученными, однако встречаются отдельные публикации, заслуживающие особого внимания.
В экспериментальном исследовании на крысах Beppu Y. с соавт. документировали снижение артериального давления через 15 минут после трансдуоденального введения 100 мкг ФМК [62]. При введении D-изомера показатель снижался не более чем на 10%, в то время как L-изомер приводил к снижению артериального давления более чем на 25%. Также авторами выявлена способность ФМК воздействовать на вегетативную нервную систему. Документировано повышение симпатической нервной активности почек при введении 10 мкг D-ФМК (при этом L-ФМК практически не влияла), а при введении 100 мкг оба изомера приводили к снижению симпатической нервной активности почек. Выявлено повышение парасимпатической нервной активности при транс дуоденальном введении 100 мкг L-ФМК - по изменению активности вагуса желудка [62].
Исследуя бластомогенные свойства ФМК и п-ГФМК на мышах, Раушенбах М.О. с соавт. продемонстрировали, что подкожное введении п-ГФМК в дозе 2,5 мг 2 раза в неделю приводит к более частому развитию опухолей в сравнении с контролем, а для ФМК такого эффекта не обнаружено [141].
В исследовании на клеточных культурах мышей Duke P.S. с соавт. выявили способность ФМК ингибировать рост клеток меланомы и не оказывать эффекта на рост здоровых клеток сердца в тех же концентрациях [83]. Аналогичные свойства были выявлены у ФУК. Первая фаза клинических исследований по изучению фармакокинетики инфузионного препарата ФУК у онкологических больных показала, что при внутривенном введении болюсных доз препарата практически сразу начинается процесс его конъюгации с глютамином. Максимальные концентрации свободной ФУК в сыворотке наблюдаются в момент окончания инфузионной процедуры (3919±691дМ). Практически полное связывание с глутамином документировано через 10 часов после введения 150 мг/кг ФУК, и полная конъюгация через 6,5 часов после введения 60 мг/кг. Анализ суточной мочи подтвердил, что около 99% препарата выводится в виде фенилацетилглутамина. Одежда и кожа больных имели аромат фенилуксусной кислоты, что свидетельствует о частичной экскреции ФУК с потом. У двоих больных исследованы одновременно образцы сыворотки крови и спинномозговой жидкости (Табл. 4) [163].
ФКК при локальных (амбулаторные больные) и тяжелых (больные отделения реаниматологии) инфекциях
В успешном результате анализа сложных многокомпонентных матриц пробоподготовка играет ведущую роль. Очистка аналита от посторонних компонентов повышает качество проводимого исследования, снижая вероятность ошибочных результатов, обусловленных мешающим влиянием примесей (наложение/неполное разделение пиков, увеличение времени анализа, загрязнение аналитической системы, низкое значение сигнал/шум, повышение предела обнаружения).
Для определения ФКК используют нативную сыворотку крови, получаемую путём естественного свёртывания. В ее состав входит 90-92% воды и 8-10% органических и неорганических веществ [2]. В связи с отсутствием фибриногена сыворотка является более стабильной матрицей, чем плазма. Этапы пробоподготоеки при определении фенилкарбоновых кислот: У Разведение образца. В пробирку отбирают 200 мкл сыворотки крови и разбавляют 800 мкл воды для инъекций. Введение внутреннего стандарта. Так же как и в запатентованной методике определения ФКК [9] для учета потерь при экстракции в исходный образец необходимо добавить внутренний стандарт, по отношению к которому производится количественное определение компонентов. Основными требованиями к внутреннему стандарту являются: принадлежность к тому же классу веществ, что и определяемые компоненты; отсутствие в анализируемом объекте. В разработанной ранее методике пробоподготовки в качестве внутреннего стандарта используется 05-бензойная кислота. Ее выбор обусловлен особенностью масс-спектрального детектора, позволяющего по масс-спектру идентифицировать дейтерированные производные веществ. Пламенно-ионизационная детекция не имеет возможности разделения дейтерированных и недейтерированных соединений, что не позволяет провести разделение бензойной кислоты, содержащейся в сыворотке, и 05-бензойной кислоты. С учетом специфики объекта и метода определения в качестве внутреннего стандарта выбрана 3,4-дигидроксибензойная кислота, которая соответствует вышеуказанным требованиям.
Подкисление. Подкисление раствора сыворотки крови сильными неорганическими кислотами способствует переходу определяемых ФКК в недиссоциированную форму и, следовательно, их преимущественному переходу в органическую фазу при жидкость-жидкостной экстракции. Кроме того, при уменьшении рН среды происходит коагуляция белков, что облегчает работу с пробой при экстракции и уменьшает количество нецелевых компонентов, переходящих в органическую фазу.
Высаливание. Предложенная ранее методика определения ФКК [9] дополнена стадией высаливания, которая позволяет усилить эффекты, описанные в этапе подкисления (переход целевых компонентов в органическую фазу и осаждение белков). Проведены эксперименты по определению ФКК в сыворотке с высаливанием и без него (табл. 7). Так, разброс 50 % значений с использованием процедуры высаливания меньше по отношению к аналогичному, полученному без нее.
Дериватизация. В связи с полярностью целевых компонентов прямое хроматографическое детектирование исследуемых соединений затруднительно даже на модельных смесях. Пики целевых ФКК на хроматограммах не симметричны, что не позволяет производить их количественное определение. Одним из приемов, используемых для улучшения хроматографических параметров компонентов, является их дериватизация. Дериватизация - это получение производных анализируемого вещества, обладающих иными (лучшими с точки зрения используемого метода определения) аналитическими свойствами [52]. В нашем случае целевые соединения содержат две функциональных группы с подвижным водородом: гидроксильную и/или карбоксильную, а значит получение, например, триметилсилильных (ТМС) производных позволит снизить их полярность и повысить термическую устойчивость по отношению к исходным соединениям. Упрощенно этот процесс может быть описан уравнением: R-H + XSi(CH3)3 -+ RSi(CH3)3 + НХ где R-H - соединение с подвижным водородом, X-Si(CH3)3 -силилирующий агент, a R-Si(CH3)3 - ТМС производное исходного соединения. Наиболее часто в качестве силилирующего агента биоорганических соединений используется (М,0-бис-триметилсилил)илтрифторацетамид (БСТФА). В результате реакции получаются ТМС-производные как по гидроксильной, так и по карбоксильной группам.
Первый шаг на пути к количественному анализу в хроматографии выявление вида зависимости отклика от содержания определяемого соединения. В нашем случае откликом является отношение площади пика определяемого вещества к площади пика внутреннего стандарта - Si/Sst. С этой целью приготовлены модельные растворы пяти ФКК и внутреннего стандарта в диэтиловом эфире. Рассчитанные аликвоты модельных растворов (содержание компонентов 0,3-7 дМ) упаривали досуха, сухой остаток дериватизировали, пробу разбавляли гексаном и анализировали. Для трех концентраций делали по четыре пробы с тремя параллельными измерениями. На основе полученных данных в Microsoft Excel 2010 по средним были построены градуировочные графики; для всех пяти ФКК в исследуемом диапазоне выявлена линейная зависимость относительного отклика от содержания компонентов. О линейной зависимости можно судить по близости к единице коэффициентов корреляций соответствующих градуировочных графиков (табл. 9).
ФКК у больных с разной степенью органных нарушений
В отделениях реаниматологии самым опасным осложнением при наличии инфекции является развитие полиорганной недостаточности. Поэтому для разделения больных группы ОРИТ на подгруппы по степени тяжести инфекционного процесса были использованы показатели шкалы SOFA - Sepsis-related Organ Failure Assessment (шкала оценки органной недостаточности, связанной с сепсисом) [174], зафиксированные в медицинских картах больных.
Подгруппа SOFA 0-2 балла - бактериальный воспалительный процесс средней степени тяжести. Включено 10 больных - 4 женщины и 6 мужчин, медиана возраста составила 59 (ИР 50-76) лет. Тяжесть состояния обусловлена течением гнойно-воспалительного процесса, оценка по шкале APACHE II составила 6 (ИР 4—9) баллов. У больных верифицированы следующие очаги бактериальной инфекции: пневмония (п=3), перитонит (п=6), перитонит в сочетании с пневмонией (п=1). В одном случае инфекционный процесс сопровождался развитием двух общеклинических признаков воспаления.
Подгруппа SOFA 3-7 баллов - тяжелое течение бактериального воспалительного процесса. Включено 14 больных - 7 женщин и 7 мужчин, медиана возраста в группе составила 69 (ИР 63-77) лет. Оценка тяжести состояния больных по шкале APACHE II составила 14 (ИР 9-16) баллов. Документированные очаги бактериальной инфекции: пневмония (п=8), перитонит (п=4), перитонит в сочетании с пневмонией (п=2). В восьми случаях бактериальный воспалительный процесс сопровождался развитием двух и более общеклинических признаков воспаления.
Подгруппа SOFA 8 баллов - крайне тяжелое течение бактериального воспалительного процесса. В группу включено 18 больных - 9 женщин и 9 мужчин, медиана возраста в группе составила 63 (ИР 57-74) года. По шкале APACHE II оценка тяжести состояния больных на момент забора образца крови составила - 26 (ИР 24-29) баллов. Верифицированы следующие очаги инфекции: пневмония (п=14), перитонит (п=2), перитонит в сочетании с пневмонией (п=2). В шестнадцати случаях бактериальный воспалительный процесс сопровождался развитием двух и более общеклинических признаков воспаления.
Подробная характеристика подгрупп представлена в таблице 4.2.1. По возрасту подгруппы не различались, показатели лейкоцитоза оказались значительно выше в подгруппе SOFA 8, чем в подгруппах SOFA 0-2 и 3-7. По показателям температуры тела и частоты сердечных сокращений достоверное повышение обнаружено в подгруппе SOFA 8, в сравнении SOFA 0-2. Как и ожидалось, подгруппы значительно различались по значению шкалы APACHE II, характеризующей тяжесть состояния, что подтверждает адекватность разделения выборки на подгруппы. Концентрации ФУК, ФМК, п-ГФУК и п-ГФМК во всех подгруппах достоверно различались, и в каждой последующей были практически в два раза выше, чем в предыдущей. -p 0.05 в сравнении с другими подгруппами Рис. 9. Сопоставление показателей фенилкарбоновых кислот между подгруппами Аналитический обзор источников литературы позволил выбрать клинико-лабораторные показатели наиболее интересные для выявления корреляционных взаимосвязей с ФКК, результаты отражены в таблице 17.
В соответствии со шкалой Чеддока коррелляционная взаимосвязь в диапазоне от 0,1 до 0,3 интерпретируется как слабая; 0,3 - 0,5 - умеренная; 0,5 - 0,7 - заметная; 0,7 - 0,9 - высокая; 0,9 - 0,99 - весьма высокая. Хизирев Э.А. в работе, посвященной диагностике и прогнозированию течения деструктивного панкреатита, описывал ФКК как показатели возможности развития системной воспалительной реакции организма [46]. Проведенный корреляционный анализ подтверждает наличие взаимосвязи ФКК с клинико-лабораторными показателями, характеризующими течение воспалительной реакции, происходящей в организме (лейкоцитоз, температура тела и ЧСС). Для ФМК обнаружена высокая корреляция с количеством зафиксированных общеклинических признаков воспаления (Табл. 17).
Ряд работ свидетельствует о повышении уровня ФУК в крови и моче больных с ХПН [57, 104, 132, 148]. Креатинин является одним из маркеров, используемых в клинике для оценки функции почек. Для ФУК, ФМК и п-ГФУК выявлена умеренная корреляция с уровнем креатинина, а для п-ГФМК - высокая. Полученные данные свидетельствуют о прямой взаимосвязи уровня ФКК с уровнем креатинина (Табл. 17).
В связи с наличием в литературе данных о повышенной экскреции ФМК, п-ГФУК и п-ГФМК с мочой у больных с циррозом печени [113, 128], проведена оценка связи сывороточных уровней ФКК и общего билирубина -косвенного маркера печеночной недостаточности. Умеренная взаимосвязь обнаружена с уровнем ФМК. На данном этапе, полученные результаты не позволяют делать выводов о взаимосвязи уровней ФКК с функцией печени (Табл. 17).
В эксперименте Beppu Y. с соавторами показано снижение артериального давления у крыс при транс дуоденальном введении ФМК [62]. С учетом известного факта, что критически низкие показатели артериального давления фиксируются у больных с инфекцией в состоянии септического шока, нами проведен корреляционный анализ, который выявил обратную взаимосвязь уровней ФКК с показателями систолического и диастолического артериального давления. При этом заметная обратная корреляция обнаружена с уровнем п-ГФМК (Табл. 17).
С целью выявления взаимосвязи уровня фенилкарбоновых кислот и тяжести гнойно-воспалительного процесса проведен корреляционный анализ с показателями шкал SOFA и APACHE II, характеризующих тяжесть состояния больных. Выявлена высокая прямая корреляция уровней ФКК с показателями шкал оценки тяжести состояния больных (Табл. 17).
Таким образом, установлены референсные значениям ФКК в сыворотке крови здоровых людей методом ГХ-ПИД, которые могут служить основой для оценки изменений профиля ФКК в сыворотке крови больных с различными заболеваниями. Обнаружено, что развитие локального гнойно-воспалительного процесса мягких тканей сопровождается повышением уровня фенилкарбоновых кислот (ФУК, ФМК, п-ГФУК, п-ГФМК) в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами (р 0,02)
Более тяжелые формы течения бактериального воспалительного процесса сопряжены с многократным увеличением концентраций ФКК в сыворотке крови больных. Обнаружена взаимосвязь уровня ФКК с показателями лейкоцитоза, температуры тела и ЧСС, а также с количеством документированных общеклинических признаков воспаления.
Обнаружена обратная корреляционная взаимосвязь концентраций ФКК с показателями артериального давления у больных в критическом состоянии, возможно участие ФКК в патогенезе септического шока.
Тяжелое течение гнойно-воспалительного процесса у больных в критических состояниях зачастую сопровождается развитием синдрома полиорганной недостаточности. Обнаружена тесная связь уровня ФКК с показателями шкалы SOFA. Учитывая, что ФКК являются низкомолекулярными соединениями, их повышение у больных с нарушением функции почек ожидаемо [48, 104, 132, 148]. Нами выявлена тесная корреляционная связь уровней ФКК с креатинином. Выявленные закономерности позволяют утверждать, что у больных в критических состояниях с гнойно-воспалительными процессами важную роль в механизмах накопления ФКК в организме играет не только их гиперпродукции, но и нарушение естественных механизмов детоксикации и выведения, т.е. ретенция. Среди больных с развившейся острой почечной недостаточностью летальность в разы выше, по сравнению с больными с сохранной функцией почек [158]. Известно, что при использовании эфферентных методов лечения, также снижаются концентрации ФКК в крови [48, 86], что требует дальнейшего изучения.