Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Патофизиология папилломавирусной инфекции . 13
1.2. Патофизиологическая роль врожденного иммунитета в защите от вируса папилломы человека 18
1.3. Роль половых инфекций в патогенезе персистенции высокоонкогенных типов вируса папилломы человека 22
1.4. Роль полиморфизмов рецепторов врожденного иммунитета в патогенезе персистенции вируса папилломы человека 27
1.5. Роль цитокинов и их полиморфизмов в патогенезе персистенции вируса папилломы человека 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1 Дизайн исследования 38
2.2 Методы исследования 40
2.2.1 Выявление ДНК ВПЧ 16, 18 типов и урогенитальных инфекций 40
2.2.2 Цитологическое исследование цервикальных мазков 41
2.2.3 Генотипирование SNP полиморфизма (TLR-9 (Т-1237С и G-2848A), TLR-3 Leu-412Phe, IL-28 rs8099917 T G, IL-10 (G-1082A и С-819Т) на примере IL-10 42
2.2.4 Статистический анализ 45
Глава 3. Результаты исследования 46
3.1. Характеристика инфекционного статуса обследованных женщин 46
3.2. Результаты цитологического исследования мазков из шейки матки 51
3.3. Результаты оценки полиморфизма генов рецепторов врожденного иммунитета и цитокинов у обследованных женщин 53
3.3.1 Результаты оценки полиморфизма гена TLR-9 53
3.3.2 Результаты оценки полиморфизма гена TLR-3 55
3.3.3 Результаты оценки полиморфизма гена IL-10 57
3.3.4 Результаты оценки полиморфизма гена IL-28 59
Глава 4. Обсуждение результатов 60
Заключение 74
Выводы 76
Практические рекомендации 77
Список условных сокращений 79
Список литературы 80
- Патофизиология папилломавирусной инфекции
- Роль цитокинов и их полиморфизмов в патогенезе персистенции вируса папилломы человека
- Характеристика инфекционного статуса обследованных женщин
- Обсуждение результатов
Патофизиология папилломавирусной инфекции
Актуальность проблемы диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека, определяется резким ростом инфицированности населения, значительной его контагиозностью и способностью вызывать злокачественную патологию (Забелев А.В. и др., 2005; Роговская С.И., Прилепская В.Н., 2005; Куценко И.И. и др., 2009; Шперлинг Н.В. и др., 2010; Staley E., 2016; Ali A.N. et al., 2017; Thomas R. et al., 2017). В настоящее время вирус папилломы человека рассматривается как этиологический фактор дисплазии шейки матки, с высоким риском последующего озлокачествления, при этом главным условием выступает длительная персистенция онкогенных типов вируса (Brebi P. et al., 2017; Huang S.S. et al., 2017; Orbegoso C. et al., 2018; Krzowska-Firych J. et al., 2019). Папилломавирусы высокого онкогенного риска обнаруживаются в 95-100% случаев неоплазий (Шперлинг Н.В. и др., 2010; Нарвская О.В., 2011; Хачатурян А.Р., Марютина Л.В., 2011; Андосова Л.Д., 2013; Чуруксаева О.Н., 2012; Cheng M.A. et al., 2018). Открытие механизмов канцерогенеза, индуцированного вирусом папилломы, принадлежит немецкому исследователю Харальду цур Хаузену (Harald zur Hausen), который в 1983 году обнаружил ДНК ВПЧ в биопсии РШМ (Должиков А.А. и др. 2012; Walboomers J.M. et al., 1999; Von Knebel Doeberitz M., 2002; Zur Hausen Н., 2002). РШМ занимает ведущее место в структуре онкологической женской заболеваемости и смертности (Полонская Н.Ю., Юрасова И.В. 2016). В Российской Федерации, как и во всем мире заболеваемость цервикальным раком постоянно растет, что свидетельствует о недостаточной эффективности профилактических мероприятий (Ключарева С.В. и др. 2007; Бахидзе Е.В., Аршавская И.Л., 2012). При этом увеличилась доля молодых пациенток репродуктивного возраста, заболевших РШМ (Рудакова Е.Б., Цыганкова О.Ю., 2008; Цыганкова О.Ю., Новиков А.И. 2009; Хачапуридзе Д.Р. и др., 2010; Унанян А.Л. и др., 2012; Каприн А.Д. и др. 2015; Хрянин А.А., Бовыкина Г.А., 2015). Таким образом, дальнейшее многогранное изучение ПВИ имеет медицинскую и социальную значимость, что заставляет искать новые пути решения проблемы профилактики, диагностики и лечения, ассоциированных с ВПЧ заболеваний.
Вирус папилломы – ДНК содержащий вирус, имеющий тропизм к эпителиальным клеткам. Идентифицировано и введено в таксономию более 140 различных типов папилломавирусов, 40 из которых могут присутствовать в аногенитальном тракте человека (Фоляк Е.В. и др., 2010; Thomas R. et al., 2017). Наиболее часто встречающиеся типы ПВИ были подразделены на генотипы ВОР (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 и др.) и низкого риска опухолевой трансформации эпителия (6, 11, 42, 43, 44, 73 и др.) (Роговская С.И. и др., 2010; Беляев В.В., 2011; Назарова Н.М. и др., 2012). По результатам Международного агенства по исследованию рака (2004), в 98% случаев РШМ в мире выявляются всего 13 типов ВПЧ. Наиболее онкогенными являются вирусы типов 16 и 18 (Маянский А.Н., 2010; Роговская С.И., 2014), при этом ВПЧ 18 типа, который выявляется примерно в 20% случаев РШМ и вульвы, достоверно чаще, чем ВПЧ 16 типа, ассоциируется с быстрой прогрессией опухоли (Вишневский А.С., Сафронникова Н.Р. 2002; Чуруксаева О.Н., Коломиец Л.А., 2013). Однако инфицирование эпителиальных клеток ВПЧ – необходимое, но недостаточное событие в инициации опухолевого процесса (Абрамовских О.С., 2011; Унанян А.Л. и др., 2012), канцерогенез протекает на фоне персистенции инфекции (Короленкова Л.И., 2011; Бакшеев С.Н., Руднева О.Д., 2012). До сих пор ученые не могут точно определить, сколько должен находиться вирус в организме женщины для развития рака, так в некоторых случаях неоплазии могут возникать после короткого периода персистирования, а в других вирус самопроизвольно регрессирует после многих лет нахождения в организме (Киселев В.И. и др., 2008). В среднем, время, которое проходит между развитием инфекции и появлением предраковых заболеваний, около 5 лет, латентный период трансформации в РШМ – 15 лет (Куевда Д.А. и др., 2009; Watson R.A., 2005). Таким образом, переход из одной стадии атипии эпителия в другую происходит достаточно долго, давая возможность врачу предпринять все необходимые для предотвращения необратимой онкологической патологии (Гуменюк Е.Г., 2001; Горобцова В.В., Ковалев А.А., 2016).
Исследования показали, что у 90% женщин до 30 лет, инфицированных низкоонкогенными штаммами ВПЧ, и 70% инфицированных высокоонкогенными штаммами ПВИ, может происходить спонтанный регресс инфекции (Вишневский А.С., Сафронникова Н.Р., 2002; Гайворонская А.Г. и др., 2014). Инфицированность ВПЧ уменьшается с увеличением возраста (Bontkes H. et al., 1999), но возрастает вероятность вирусной персистенции (Chen H.C. et al., 2011; Thomason A. et al., 2015). Так у молодых женщин (до 30 лет) происходит более быстрое самопроизвольное очищение (элиминация) от вируса и регрессия имеющейся патологии, чем у женщин более позднего возраста (Акопова Е.С. и др. 2011; Роговская С.И. 2014). Доказано, что персистенция онкогенных типов ВПЧ в течение 5—20 лет повышает риск развития рака шейки матки более чем в 100 раз (Lorinez A.T., Richart R.M. 2003). Таким образом, склонность к персистирующему течению, спонтанной регрессии и развитие лишь у одной пятой женщин РШМ дают возможность предположить, что наличие ВПЧ ВОТ является не достаточным, но необходимым условием мультистадийного процесса канцерогенеза.
Вероятно, одной из важнейших причин длительной персистенции вируса, устойчивости к терапии, высокого показателя рецидивирования и прогрессирования цитопатологических изменений может быть способность ВПЧ «уклоняться» от иммунного распознавания. Для этого у ВПЧ есть несколько механизмов иммуносупрессивного действия. Так, поскольку размножение вируса происходит в кератиноцитах, а эпителиальные клетки имеют короткий срок жизни, то это избавляет вирус от необходимости разрушать пораженные клетки. Отсутствие цитопатических свойств у вируса папилломы снижает его воспалительный потенциал, а значит и силу иммунного ответа. В цикле развития ПВИ отсутствует фаза виремии, поэтому антитела к ВПЧ либо не продуцируются, либо определяются в очень низкой концентрации, которая не способна обеспечить длительную и надежную защиту от развития заболевания (Андросова Л.Д., 2014; Hasan U., 2014). Иммуносупрессия опосредована и действием вирусных белков ВПЧ. Во-первых, синтез белков с хорошей иммуногенностью протекает медленно, тормозя развитие противовирусного иммунитета (Ghittoni R. et al., 2010). Во-вторых, белки Е6 и Е7 вируса тормозят созревание антигенпрезентирующих клеток, при этом затрудняется распознавание инфицированных клеток иммунной системой хозяина и блокируется активность эндогенных интерферонов (Сухих Г.Т. и др., 2008; Ключарева С.В. и др., 2010; Кизей И.Н. и др., 2010; Курмышкина О.В. и др., 2011; Андросова Л.Д., 2014; Hasan U., 2014; Westrich J.A. et al., 2017). Но даже при данных особенностях вируса, организм подавляющего большинства людей способен успешно бороться с ПВИ. Таким образом, наличие дисбаланса в иммунной системе является основной причиной клинических проявлений ПВИ, её рецидивирующего и персистирующего течения (Елисеева М.Ю., Мынбаев О.А., 2011; Абрамовских О.С. и др., 2012; Соловьев А.М. и др., 2013; Alves D.B. et al., 2010).
Механизмы антиинфекционной защиты слизистой половых органов менее изучены, чем иммуннитет кишечника, бронхолегочной системы или полости рта, невзирая на ее особую значимость для воспроизводства человека (Лебедева О.П. и др., 2012). Роль иммунореактивности в протекции от ВПЧ исследована у пациентов с иммунодефицитами: установлено, что степень поражения шейки матки напрямую зависит от уровня иммунного статуса ВИЧ-инфекцированных пациенток (Гафуров Ю.Т. и др., 2014). Заболеваемость цервикальной дисплазией и генитальными бородавками у женщин возрастает в 16 раз на фоне иммуносупрессии после трансплантации почки, а скорости прогрессии CIN в 17 раз по сравнению с общей популяцией (Савочкина А.Ю. и др., 2001; Хрянин А.А. и др., 2009). Последствием иммунных нарушений, сопровождающихся снижением контроля над репликацией вируса, является манифестация или рецидивирование заболевания (Шперлинг Н.В. и др., 2010).
Известно, что ВПЧ инициирует и поддерживает хронические воспалительные процессы нижнего отдела гениталий. При этом развиваются иммунодефецитные состояния, обусловленные недостаточностью разных звеньев иммунной системы: отмечается снижение показателей Т-клеточного иммунитета, понижена функциональная активность NK-клеток и концентрация основных классов иммуноглобулинов (Исаков В.А. и др., 2007; Долгушин И.И. и др., 2010; Савченко А.А. и др., 2014). При увеличении антигенных влияний на слизистую оболочку шейки матки у больных с хроническим воспалением прогрессируют деструктивные изменения эпителиальных клеток, снижается герметизация эпителия, нарушаются межклеточные контакты. При этом развивается вторичный местный иммунодефицит, который и предопределяет исход патологического процесса (Абрамовских О.С., 2010; Андросова Л.Д., 2014).
Роль цитокинов и их полиморфизмов в патогенезе персистенции вируса папилломы человека
Для наилучшего понимания патогенеза различных болезней необходимо изучать патогенетические механизмы на клеточном и молекулярно генетическом уровнях. Исследование генов, контролирующих активность цитокинов одна из важных задач в раскрытии патогенетических звеньев инициации и течения заболеваний, и выявлении на ранних сроках предрасположенности к ним (Ризванова Ф.Ф. и др., 2010). Одним из ключевых моментов, способствующих персистенции ПВИ и, как результат, прогрессии патологического процесса являются изменения цитокинового статуса. Цитокины являются ведущими медиаторами воспаления и формирования адаптивного иммунитета, ответственного за клиренс вируса. По результатам многих исследований было установлено, что элиминация ВПЧ иммунологически опосредована, при этом важен баланс между клеточным Тh1 и гуморальным Тh2 звеньями иммунитета (Долгушин И.И. и др., 2010; Росстальная М.Л. и др., 2016). Нарушение данного равновесия проявляется в преобладании противовоспалительных цитокинов над провоспалительными.
Превалирование гуморального звена является неблагоприятным прогностическим признаком для развития персистирующей инфекции и в дальнейшем формирования неопластического процесса (Кубанов А.А., 2005). IL-10 выступает в качестве основного супрессорного цитокина, ингибирует функциональную активность цитотоксических клеток и способствует реализации гуморальных иммунных реакций (Скиданенко-Левина О.В., Махмутходжаев А.Ш., 2013).
Отмечено, что при наличии L-SIL преобладают противовоспалительные цитокины, а у пациенток с латентным течением ВПЧ чаще встречается провоспалительный генотип цитокинового статуса. Также установлено, что при наличии CIN у женщин угнетен синтез Th1-звена цитокинов в виде снижения соотношения уровней ИЛ-12/ИЛ-10. В ряде исследований показано, что ФНО- ингибирует пролиферацию здоровых эпителиальных клеток шейки матки, а в случае инфицирования эпителия ВПЧ 16 и 18 типами, тот же ФНО- уже стимулирует пролиферацию пораженных клеток (Абрамовских О.С. и др., 2012; Колесникова Е. В. и др., 2018).
Избыток IL-10 ведет к снижению противоинфекционной защиты и развитию хронической инфекции, а в результате подавления клеточного иммунитета, способствует стимуляции роста опухоли (Абрамовских О.С. и др., 2012; Прилепская В.Н., Довлетханова Э.Р., 2013). Кроме этого, ВПЧ препятствует созданию провоспалительного микроокружения и активации антиген презентирующих клеток, что ведет так же к продукции IL-10 (Курмышкина О.В. и др., 2011).
Особенностью цитокинового профиля у больных с CIN III является достоверное повышение уровня IL-10 в цервикальной слизи, что является неблагоприятным прогностическим признаком прогрессирования патологического процесса (Абрамовских О.С. и др., 2012).
В общем, Тh1 и Тh2 ответы при хронических процессах часто являются взаимно исключающими, а относительные уровни IL-10 и IFN-, продуцированные Т-лимфоцитами играют важную роль в балансе между клиренсом и персистенцией инфекции (Ахматова Н.К., Киселевский М.В., 2008; Арсентьева Н.А. и др., 2012). Установлено, что аллельные варианты генов цитокинов оказывают влияние на восприимчивость организма к ВПЧ и особенности течения заболевания. Полиморфизмы генов цитокинов, их промоторов могут приводить к изменению конечного продукта, к модификации уровня экспрессии самих генов цитокинов, тем самым оказывать влияние на иммунный ответ.
Полиморфизмы гена С-819T, G-1082A (IL-10) (rs1800896 и rs1800871) располагаются в области промотора. Данные литературы о роли snp-мутаций гена IL-10 и риске развития РШМ разноречивы. Полиморфный вариант rs1800871 влияет на уровень продукцию IL-10, так установлено, что генотип AA ассоциирован с низким синтезом IL-10, в то время как генотипы GG и GA связаны с высокой и умеренной продукцией, соответственно (Torres-Poveda K. et al., 2016). Исследования проведенные в Зимбабве и Японии подтвердили связь полиморфизма G1082A гена IL-10 с РШМ (Stanczuk G.A. et al., 2001; Matsumoto K. еt al., 2010), в то время как исследования в Нидерландах, Южной Африке, Венгрии и Китае сообщают об отсутствии такой связи (Zoodsma M. et al., 2005; Wang J. et al., 2012; Ni J. et al., 2013; Torres-Poveda K. et al., 2016). Согласно исследованиям Torres-Poveda K. и Zidi S. существует значимая связь полиморфизма С-819T гена IL-10 с РШМ (Torres-Poveda K. et al., 2016; Zidi S. et al., 2015), в то время как Singh H. сообщают об отсутствии такой связи (Singh H., Jain M., Sachan R., 2009). Механизм влияния SNP С-819T (IL-10) на канцерогенез до сих пор неизвестен (Yu Z. et al., 2013).
Основной противовирусной активностью среди цитокинов обладают интерфероны, которые бывают 3 типов: интерфероны I типа включают IFN, IFN, IFN, IFN и 13 вариантов IFN; интерфероны II типа - IFN. Не так давно стало известно о новом – III типе интерферонов – интерферонах- (IFN), которые представлены семейством из трех генов: IL-29 (интерферон-1), IL-28 (интерферон-2) и IL-28 (интерферон-3). Все они располагаются на хромосоме 19 и являются ключевыми факторами местного противовирусного ответа (Хаитов М. Р. и др., 2010; Акимов И.А. и др., 2015). Представители семейства IFN III типа функционально близки к интерферонам I типа, но по структуре напоминают семейство IL-10 (Арсентьева Н.А. и др., 2012; Николаева Л.И. и др., 2015; Ge D. et al., 2009; O Brien T.R. et al., 2014). Рецепторы IFN представлены только на определенных типах эпителиальных клеток (бронхиальный эпителий, эпителий желудочно-кишечного такта, кератиноциты) и не экспрессируются на гемопоэтических клетках, что отличает их от рецепторов IFN I типа, которые представлены на всех клетках (Dickensheets H. et al., 2013; O Brien T.R. et al., 2014). Взаимодействие лиганда с рецептором стимулирует противовирусный сигнальный путь JAK-STAT, который приводит к активации интерферон-стимулирующих генов (ISG) (Zhou Z. et al., 2007). IFN повышает уровнь экспрессии ISG, в то время как IFN вызывает резкое возрастание уровня экспрессии ISG и быстрое его снижение. Установлено, что IL-29 осуществляет противовирусное действие относительно вируса гепатита С, усиливая эффект IFN. IFN участвуют в созревании и дифференцировке Т-лимфоцитов в сторону Тh1, влияют на продукцию цитокинов и хемокинов, следовательно, запускают не только противовирусный иммунитет, но и в принципе играют важную роль в иммунорегуляции (Арсентьева Н.А. и др., 2012; Николаева Л.И. и др., 2015).
В настоящее время точно установлено, что изменения в секторе генов цитокинов (IL-29, IL-28 и IL-28) оказывают большое влияние на особенности противовирусной защиты организма. В литературе активно обсуждается влияние на эффективность противовирусной терапии генетической вариабельности в области, прилегающей к гену ИЛ-28 (Жданов К.В. и др., 2014; Акимов И.А. и др. 2015).
В 2009–2010 гг. несколько групп исследователей установили ассоциацию полиморфизма около гена IL-28 в локусе rs12979860 (C T) и rs8099917 (C G) с самопроизвольным выздоровлением при первичном вирусном гепатите С, а также ответом на противовирусную терапию (Ge D. et al., 2009; Suppiah V. et al., 2009; Tanaka Y., et al., 2009; Rauch A. et al., 2010). Полиморфизмы rs8099917 и rs12979860 располагаются до рамки считывания гена, поэтому, возможно, что эти мутации связаны с транскрипцией и определяют функциональную активность цитокина IL-28 (Арсентьева Н.А. и др., 2012).
Cannella F. et al. выявили изменение продукции IFN при инфицировании ВПЧ и установили, что синтез этого интерферона был значительно выше при отсутствии ВПЧ или при ВПЧ низкого онкогенного риска. Уровень продукции IFN III был значительно снижен при диспластических изменениях в цитологических мазках, в связи с чем было высказано предположение, что низкий уровень IFN может быть предиктором прогрессирования поражений шейки матки, ассоциированных с ВПЧ ВОТ (Cannella F. et al., 2014, 2018).
Можно заключить, что за короткий промежуток времени появилось достаточно много сообщений о связи между SNP IL-10 и РШМ, однако имеющиеся данные неоднозначны. А учитывая важную иммуносупрессорную роль IL-10, можно предположить, что гиперпродукция цитокина, обусловленная аллельным полиморфизмом, может снижать эффективность противоинфекционной защиты и способствовать развитию хронической инфекции. Еще одним важным цитокином, с точки зрения влияния на патогенез ВПЧ-инфекции, представляется IFN. Так, получены убедительные данные об ассоциации полиморфизмов IFN с патогенезом ряда вирусных инфекций, но на сегодняшний день, исследований посвященных влиянию SNP IL-28 на течение ПВИ не проводилось.
Характеристика инфекционного статуса обследованных женщин
Вирус папилломы человека 16 и 18 типов выявлялся в шейки матки у 13,8% женщин (группа ВПЧ+). При анализе течения ВПЧ-инфекции за период 2010 - 2015 годы нами отмечена как спонтанная элиминация, так и прогрессирование инфекции. Клиренс вируса за период наблюдения произошел у 41,8% женщин (группа ВПЧ+/-) из впервые положительных по ВПЧ, персистенция инфекции отмечалась у 58,2% (группа ВПЧ+/+).
Причина обращения женщин с ПВИ к врачу была обусловлена различными жалобами воспалительного характера со стороны мочеполовой системы, из которых: наличие белей у 45,6%, тянущие боли внизу живота у 34,3%, нарушения менструального цикла у 16,7%, зуд и жжение вульвы, дискомфорт у 3,6%, обследование по поводу бесплодия у 3,6%, наличие разрастаний на половых органах у 1,5%, дизурические расстройства у 0,7%. Клинические проявления ПВИ наблюдались у 6,5% женщин. Среди клинических форм экзофитные кондиломы промежности выявлены у 1,7% женщин, экзофитные кондиломы шейки матки обнаружены у 4,8% женщин. Субклинические (плоские) папилломавирусные поражения шейки матки и влагалища, включая кондиломатозный вагинит выявлены у 1,7% женщин, цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN) различной степени выявлены у 15,5%.
В результате исследования ассоциации ВПЧ с другими видами инфекций, передаваемых половым путем, было установлено, что сопутствующая генитальная инфекция была выявлена у 73,9% женщин с папилломавирусной инфекцией, при этом моноинфекция наблюдалась у 42,4% пациенток, два и более инфекционных агента у 57,6% пациенток. У пациенток с персистирующей ПВИ и пациенток с транзиторным течением встречаемость генитальных инфекций была примерно одинаковой 73,5% и 74,5%, соответственно.
Общее распределение инфекционных возбудителей по количеству выявления не отличалось у пациенток группы ВПЧ+/+ и ВПЧ+/-.
Инфицирование одним инфекционным агентом у пациенток с персистирующей ПВИ и женщин с транзиторным ВПЧ составило 41% и 44,3%, соответственно, двумя и более инфекционными агентами – 59% и 55,7%, соответственно (таблица 3).
Таким образом, при различных вариантах течения папилломавирусной инфекции, сопутствующие патогены обнаруживали одинаково часто.
При более детальном изучении микробных ассоциаций не обнаружено достоверных отличий в распределении отдельных инфекционных агентов между обследуемыми группами. Чаще всего инфицированность ВПЧ сочеталась со следующими инфекциями: Ureaplasma species в 64,6% случаев; Gardnerella vaginalis в 53,7%; CMV в 24,6%; Mycoplasma hominis в 23,9%; Candida albicans в 12,5%; Chlamydia trachomatis в 9,9%; Mycoplasma genitalium в 5,9%. Доминирующими по частоте встречаемости в нашем исследовании оказались Ureaplasma species и Gardnerella vaginalis, которые обнаружили у 62,8% и 57,3% участниц с персистирующей ПВИ и у 67% и 49,3% с транзиторным течением, соответственно (таблица 4).
Анализ микробных ассоциаций с цитологическими изменениями эпителия шейки матки показал, что у пациенток с персистирующей ПВИ достоверно чаще выявлялась дисплазия при наличии сопутствующей инфекции (69,6%), по сравнению с пациентками, у которых ВПЧ элиминировал (37,5%) (р 0,0001). Обращает на себя внимание, что при выраженных инраэпителиальных поражениях (H-SIL) микробные ассоциации выявлялись у 70% женщин в группе ВПЧ+/+, что значимо выше, чем в группе ВПЧ+/- – у 28,6% пациенток (р=0,001) (таблица 5).
В структуре инфекционных агентов при H-SIL и персистенции ВПЧ достоверно чаще выявлялись Ureaplasma species – у 56,3% пациенток по сравнению с пациентками группы ВПЧ+/- (33,3%).
Проведенные исследования позволили установить частоту распространения ВПЧ инфекции среди женщин в Волгоградской области, которая составила 13,8%. При характеристике сопутствующей инфекционной патологии у обследуемых женщин определена высокая частота ассоциации ВПЧ с ИППП - 73,9%, при этом чаще патология носила характер микст инфекции. При этом хронизация ВПЧ или клиренс от вируса за период наблюдения не были связаны с наличием определенной генитальной инфекцией или группой инфекционных возбудителей. Однако, установлена взаимосвязь между наличием сопутствующих ИППП и цитологическими изменениями шейки матки в исследуемых группах. Так, дисплазия значительно чаще выявлялась при хронической ВПЧ-инфекции, ассоциированной с ИППП, в то время как большая часть (установленные случаи) цервикальных неоплазий в группе с транзиторной ПВИ не была связана с наличием генитальных инфекций. Таким образом, сопутствующие генитальные инфекции способны оказывать влияние на развитие патологических признаков в цитологических мазках, только в присутствии ВПЧ ВОТ, при этом установлено влияние определенных микробных ассоциаций. Прогрессирование до выраженных интраэпителиальных поражений наблюдалось чаще при наличии Ureaplasma species, что сопоставимо с данными литературы.
Обследование на ИППП поможет верифицировать случаи микст-инфицирования, что является важным для ВПЧ-инфицированных пациентов. Хроническая микробная генитальная инфекция нарушает местный иммунитет, что может способствовать ускорению проявления неопластического потенциала ВПЧ. Таким образом, считаем целесообразным при обследовании женщин на ВПЧ ВОТ одновременно определять наличие других инфекционных возбудителей, в особенности Ureaplasma species.
Обсуждение результатов
Актуальность проблемы диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека, определяется резким ростом инфицированности населения, значительной его контагиозностью и способностью вызывать злокачественную патологию (Зыкова Т.А. и др., 2018; Ali A.N. et al., 2017; Thomas R. et al., 2017; Krzowska-Firych J. et al., 2019). Однако инфицирование эпителиальных клеток – необходимое, но недостаточное событие в инициации опухолевого процесса (Абрамовских О.С., 2011; Унанян А.Л. и др., 2012). Несмотря на высокую потенциальную опасность ВПЧ, остается непонятным, почему только у небольшого процента женщин инфекция приобретает персистирующий характер, создавая предпосылки для неогенеза (Минаев Н.Н. и др., 2016; Брико Н.И., Лопухов П.Д., 2017; Тихомиров А.Л. и др., 2018). Согласно литературным данным, течение и исход ПВИ зависит от генотипа хозяина, во многом определяются состоянием иммунной реактивности организма и наличия провоцирующих факторов.
Общепризнанно, что цервикальные дисплазии чаще развиваются на фоне предшествующего хронического воспалительного процесса в шейке матки и наличия дисбиоза влагалища (Куделькина С.В., 2016). Наличие бактериального вагиноза, является одним из факторов риска развития ВПЧ-инфекции и задержки его элиминации (Прилепская В.Н., Назарова Н.М., 2014; Хрянин А.А., Решетников О.В., 2015), а сочетание ВПЧ с различными возбудителями инфекций, передающихся половым путем способствуют развитию цервикального рака (Байрамова, Г.Р. и др., 2017; Зыкова, Т.А. и др., 2018). При этом высокий уровень распространенности урогенитальных инфекций у женщин, инфицированных ВПЧ позволяет предположить, что ИППП может являться как триггерным фактором, так и условием хронизации папилломавирусной инфекции. Учитывая мультифакторность механизмов развития патологического процесса, обусловленного ВПЧ, нами было принято решение исследовать взаимосвязь между наличием генитальных инфекций, спектром возбудителей, наличием полиморфных вариантов генов и течением папилломавирусной инфекции. В качестве обследуемых были выбраны женщины, инфицированные ВПЧ 16, 18 типа. Для оценки хронизации инфекции, обследованные с впервые выявленной ПВИ, наблюдались на протяжении 3-5 лет с ежегодным исследованием на наличие ВПЧ. Вирус папилломы человека 16 и 18 типов выявлялся в шейке матки у 13,8% женщин. При анализе течения ВПЧ инфекции отмечено, что клиренс вируса за три года наблюдения отмечался у 41,8% женщин из впервые положительных по ВПЧ, персистенция инфекции выявлена у 58,2%.
Общепринятым методом выявления патологии шейки матки является цитологическое исследование цервикальных мазков, с целью оценки клеточного состава и обнаружения атипичных клеток эпителия. Цитологическое исследование в настоящее время является самым экономически выгодным методом. Согласно результатам наших исследований, у пациенток с транзиторным течением ВПЧ мазки соответствовали норме у 97,2% женщин, что значимо выше, чем у пациенток с хронической ВПЧ-инфекцией – у 79,0% пациенток. Слабовыраженные интраэпителиальные поражения (L-SIL), отмечались у 1,68% пациенток с персистирующим течением и у 1,4% пациенток с транзиторным течением и не имели достоверной разницы. Прогрессирование заболевания до HSIL зафиксировано у 1,4% пациенток в группе ВПЧ +/- и достоверно чаще наблюдалось у пациенток в группе с персистирующим течением – у 16,8%. Атипичные клетки железистого эпителия были обнаружены только при персистирующем течении папилломавирусной инфекции – у 0,84% пациенток (риснок 1). Признаки цервицита выявлялись у 88,89% пациенток в группе ВПЧ +/- и у 91,59% группы ВПЧ +/+, что достоверно не отличалось.
При характеристике сопутствующей инфекционной патологии у обследуемых исследовали отделяемое влагалища и цервикального канала методом ПЦР на наличие Chlamydia trachomatis, Ureaplasma species, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Cytomegalovirus, Gardnerella vaginalis, Candida albicans. В результате, была определена высокая частота ассоциации ВПЧ с урогенитальными инфекциями (73,9%), при этом моноинфекция выявлялась у 42,4% пациенток, два и более инфекционных агента у 57,6% пациенток (рисунок 2).
Чаще всего инфицированность ВПЧ сочеталась со следующими инфекциями: Ureaplasma species в 64,6% случаев; Gardnerella vaginalis в 53,7%; CMV в 24,6%; Mycoplasma hominis в 23,9%; Candida albicans в 12,5%; Chlamydia trachomatis в 9,9%; Mycoplasma genitalium в 5,9% (рисунок 3).
Доминирующими по частоте встречаемости в нашем исследовании оказались Ureaplasma species и Gardnerella vaginalis, которые обнаружили у 62,8% и 57,3% участниц с персистирующей ПВИ и у 67% и 49,3% с транзиторным течением, соответственно. При этом хронизация ВПЧ или клиренс от вируса за период наблюдения не были связаны с наличием определенной генитальной инфекцией или группой инфекционных возбудителей.
Анализ микробных ассоциаций с цитологическими изменениями эпителия шейки матки показал, что у пациенток с персистирующей ПВИ достоверно чаще выявлялась дисплазия при наличии сопутствующей инфекции (69,6%), по сравнению с пациентками, у которых ВПЧ элиминировал (37,5%). Обращает на себя внимание, что при выраженных инраэпителиальных поражениях микробные ассоциации выявлялись у 70% женщин в группе ВПЧ+/+, что значимо выше, чем в группе ВПЧ+/- – у 28,6% пациенток. Прогрессирование до выраженных интраэпителиальных поражений наблюдалось чаще при наличии Ureaplasma species.
Таким образом, результаты наших исследований показали, что влияние такого внешнего фактора, как сопутствующая генитальная инфекция не является основной причиной хронизации ВПЧ, но играет важную роль в патогенезе прогрессирования цитологических неопластических изменений цервикального эпителия на фоне нестерильного иммунитета против ВПЧ, усиливая онкогенный потенциал ВПЧ.
Возможно, ведущую роль в патогенезе инфекционного процесса принадлежит внутренним факторам организма-хозяина. При этом, перспективным является изучение генов иммунной системы (Романова С.В. и др., 2013). Накоплены доказательства того, что индивидуальное разнообразие манифестации инфекционного заболевания является результатом генетической предрасположенности пациентов. При этом общепризнано, что восприимчивость к инфекциям является высокополигенной и зависит от вариабельности генов медиаторов иммунного ответа (Ризванова Ф.Ф. и др., 2010; Камилова Т.А., Иванов А.М., 2011). Основу индивидуальной изменчивости генома человека составляют одноточечные полиморфизмы (snp) (Баранов В.С., 2011). Система врожденного иммунитета является первой линией защиты организма от проникновения патогенов и осуществляет быстрый запуск иммунного ответа. Реализацию защитных свойств осуществляют в основном рецепторы семейства TLR (Toll-like receptors). Распознавание микробных структур TLR запускает путь сигнальной передачи и активации генов, продукты которых контролируют врожденный иммунитет и инициируют развитие специфического иммунного ответа. TLR-сигнальный путь регулируется TIR доменсодержащими адапторами, такими как MyD88, TIRAP/Mal, TRIF и TRAM. Каждый из адаптеров обеспечивает специфичность индивидуальных TLR-опосредованных сигнальных путей (рисунок 4).
Известно, что ВПЧ может влиять на продукцию TLR, изменять внутриклеточный сигналинг и способствовать персистенции вируса. Функциональный полиморфизм генов, кодирующих рецепторы врожденного иммунитета, может быть ассоциирован с предрасположенностью и тяжестью инфекционного процесса (Лемякина Е.В., Гумилевский Б.Ю., 2013). Снижение экспрессии TLR на клеточной поверхности вследствие генетического дефекта приводит к иммунодепрессии, проявляющейся повышенной чувствительностью к инфекциям, а повышенный по сравнению с нормой уровень экспрессии TLR является патогенетическим механизмом хронического воспаления. Недавние исследования показали, что TLR могут способствовать развитию, прогрессированию и метастазированию опухоли. Опухолеобразование связывают с повышенным по сравнению с нормой уровнем поверхностной экспрессии TLR, являющейся патогенетическим механизмом хронического воспаления (Yang X. et al., 2017).
Для того, чтобы оценить роль факторов врожденного иммунного ответа в патогенезе ПВИ, мы исследовали мутации генов основных медиаторов противовирусного иммунитета – TLR-9 (Т-1237С и G2848A), TLR-3 (Leu-412 Phe).