Взаимодействие кобаламинов с аминокислотами Буй Тхи Тху Тхуи

Содержание к диссертации

Введение

1. Литературный обзор 8

1.1 Строение и важнейшие химические свойства аминокислот, цианамида и глутатиона 8

1.2 Строение и важнейшие химические свойства аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот 16

1.3 Строение и важнейшие химические свойства кобаламинов и их производных 18

1.4 Взаимодействие кобаламинов с аминокислотами и аскорбиновой кислотой 36

2. Экспериментальная часть и обсуждение результатов 38

2.1 Характеристика объектов и методов исследования, расчет констант равновесия 38

2.2 Результаты и их обсуждение 41

2.2.1 Взаимодействие аквакобаламина и диаквакобинамида с аминокислотами и цианамидом 41

2.2.2 Взаимодействия в системе аскорбиновая (дегидроаскорбиновая) кислота / кобаламин (кобинамид) / аминокислота (пептид) или тиоцианат 62

Заключение 92

Список литературы

• Строение и важнейшие химические свойства аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот
• Взаимодействие кобаламинов с аминокислотами и аскорбиновой кислотой
• Взаимодействие аквакобаламина и диаквакобинамида с аминокислотами и цианамидом
• Взаимодействия в системе аскорбиновая (дегидроаскорбиновая) кислота / кобаламин (кобинамид) / аминокислота (пептид) или тиоцианат

Введение к работе

Актуальность и степень разработанности темы. Одной из важнейших незаменимых аминокислот является метионин, который, однако, может регенерироваться в организме из гомоцистеина. Промежуточным переносчиком метильной группы в этой реакции служит метилкобаламин (одна из форм витамина B₁₂, MeCbl). Другая серосодержащая аминокислота – цистеин, обладающая, в отличие от метионина, восстановительными свойствами, существенно влияет на стабильность витамина B₁₂ в водных растворах. Важную роль в биосинтезе аденозил- и метилкобаламинов играет комплекс кобаламина с серосодержащим трипептидом – глутатионом. В 2015 г. показано, что взаимодействие глутатиона с окисленной формой витамина C – дегидроаскорбиновой кислотой вызывает окислительный стресс. Эти данные вызвали очень большой интерес, поскольку они могут быть использованы при лечении рака. Влияние кобаламинов и их восстановленных форм на реакцию глутатиона и других пептидов или аминокислот с дегидроаскорбиновой кислотой, однако, до настоящего времени не изучено. Не исследованы также взаимодействия в системе аминокислота – дегидроаскорбиновая кислота/аскорбиновая кислота – Cbl(III)/Cbl(II). Неизученными остаются взаимодействия в аналогичной системе, содержащей вместо кобаламина его производное, не содержащее диметилбензимидазольный нуклеотид – кобинамид (Cbi). Между тем известно, что кобинамид проявляет значительно большую эффективность в качестве антидота на цианид и имеет перспективы использования в качестве антидота на сероводород. В связи с вышеизложенным определена цель исследования.

Цель работы – определение кинетических параметров и механизмов процессов взаимодействия аквакобаламина и диаква(аквагидроксо)кобинамида с аминокислотами и цианамидом, а также реакций в системе SH-аминокислота (глута-тион) – дегидроаскорбиновая кислота (аскорбиновая кислота) – Cbl(III)/Cbl(II) (Cbi(III)/Cbi(II)). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать кинетику реакций аквакобаламина и диак-ва(аквагидроксо)кобинамида с аспарагиновой и глутаминовой кислотами, аспараги-ном, глутамином, а также цианамидом.

2. Исследовать кинетику и механизмы стехиометрических и каталитических реакций в системе цистеин (N-ацетилцистеин, глутатион) - дегидроаскорбиновая кислота (аскорбиновая кислота) – Cbl(III)/Cbl(II) (Cbi(III)/Cbi(II)).

3. Выявить влияние диметилбензимидазола (ДМБИ) на кинетику и механизмы указанных выше реакций корриновых комплексов кобальта.

Научная новизна. Впервые определены кинетические параметры и константы равновесия реакций аквакобаламина и диаква(аквагидроксо)кобинамида с глутами-ном, аспарагином, аспарагиновой и глутаминовой кислотами, а также цианамидом. Впервые показано, что в присутствии SH-аминокислот (цистеина, N-ацетилцистеина) и глутатиона восстановленные формы кобаламина (Cbl(II)) и кобинамида (Cbi(II)) взаимодействуют с дегидроаскорбиновой кислотой с образованием аскорбиновой кислоты. Установлено также, что в присутствии дополнительного восстановителя – цистеина, а также глутатиона кобаламин проявляет каталитические свойства в реакции образования аскорбиновой кислоты. В случае кобинамида использование допол-

нительного восстановителя не обязательно, поскольку глутатион, присутствующий в избытке, одновременно выполняет роль и реагента, и катализатора.

Теоретическая и практическая ценность. Предложены механизмы стехиометри-ческих и каталитических редокс реакций в системе SH-аминокислота (глутатион) – дегидроаскорбиновая кислота/аскорбиновая кислота – Cbl(III)/Cbl(II). Обоснована перспективность использования кобаламина и особенно кобинамида совместно с де-гидроаскорбиновой кислотой при создании препаратов, вызывающих окислительный стресс в раковых клетках.

Работа выполнена в соответствии с «Основными направлениями научных исследований Ивановского государственного химико-технологического университета» по теме «Термодинамика, строение растворов и кинетика жидкофазных реакций», а также в соответствии с научной программой гранта Российского научного фонда, соглашение № 14-23-00204.

Методология и методы диссертационного исследования. Методологической основой исследования являются синтез, эксперимент, анализ и сравнение. Для достижения цели работы использовались современные методы исследования – спектрофотометрия, в том числе использующая метод остановленной струи (stopped-flow), циклическая вольтамперометрия, крио-ESI-MS (электроспрей масс-спектрометрия), хроматография.

Для обоснования результатов исследований использованы обзорные и оригинальные статьи отечественных и зарубежных авторов в области координационной химии кобаламинов и их аналогов.

Положения, выносимые на защиту:

4. Результаты исследования кинетики реакций аквакобаламина и диаква (аквагид-роксо)кобинамида с аминокислотами и цианамидом.

5. Результаты исследования кинетики реакций SH-аминокислот и глутатиона с дегидроаскорбиновой кислотой в присутствии кобаламинов и кобинамидов.

6. Механизмы стехиометрических и каталитических реакций в системах SH-аминокислота (глутатион, тиоцианат)/дегидроаскорбиновая (аскорбиновая) кисло-та/кобаламин(кобинамид).

Степень достоверности полученных результатов обеспечивается использованием комплекса независимых методов исследования, подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, полученных на современном высокоточном оборудовании и публикациями в профильных журналах из Перечня рецензируемых научных изданий.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях: XII Всероссийской конференции с международным участием «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах. От эффектов в растворах к новым материалам» (Иваново, 2015); Восемнадцатой конференции молодых учёных – химиков Нижегородской области (Нижний Новгород, 2015); Международном конгрессе по химии гетероциклических соединений, «КОСТ-2015» (Москва, 2015); International conference «Organometallic and Coordination Chemistry: Achievements and Challenges» (Нижний Новгород, 2015); XII Международной конференции «Синтез и применение порфиринов и их аналогов» (ICPC-12) (Иваново, 2016); 8th International Symposium on Bioorganometallic Chemistry (Moscow, 2016).

Личный вклад автора заключается в изучении и анализе литературных источников, проведении экспериментальных исследований, анализе и интерпретации полу-

ченных результатов, формулировке выводов. Постановка цели, задач исследования и обсуждение результатов проводились совместно с научным руководителем.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы полностью отражены в 8 научных работах: двух статьях в профильных журналах из Перечня рецензируемых научных изданий и в тезисах 6 докладов, представленных на конференциях различного уровня.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов и заключения, а также списка цитируемой литературы (193 ссылки). Общий объем работы составляет 115 страниц, в том числе 8 таблиц, 20 схем и 51 рисунок.

Строение и важнейшие химические свойства аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот

Образование пептидов из аминокислот может инициировать цианамид. Он был обнаружен в межзвездных облаках, и рассматривается как важная молекула в предбиологической химии. Под действием УФ-облучения или в жидкой воде процесс изомеризации цианамида (NH2CN) может привести к образованию карбодиимида (HNCNH) [16], который способен индуцировать присоединение аминокислот в пептиды [17] и даже реакцию репликации [18].

Цианамид является важным нитрилом, в котором аминогруппа непосредственно соединяется с нитрильным углеродом [19]. Цианамид используют в лечении алкогольной зависимости в Канаде, Европе и Японии [20]. Установлено, что его биоактивирование через окисление ферментом каталаза приводит к образованию интермедиата N-гидроксицианамида. Последний самопроизвольно разлагается на цианид и HNO (схема 3), который взаимодействует с тиолсодержащим ферментом альдегиддегидрогеназой, участвующим в метаболизме этанола [21, 22].

Выделение цианида ограничивает использование цианамида и его производных в биологических условиях. Тем не менее, исследуются возможности клинического использования этого соединения в качестве донора HNO, а также реагента, способного селективно взаимодействовать с тиольными протеинами [23]. Цианамидная группа также является ключевым фрагментом более сложных молекул, проявляющих биологическую активность. Например, N-ацилцианамид ингибирует протеазы NS3 вируса гепатита С [24]. Разработаны ингибиторы катепсина К на основе цианамида [25], которые могут использоваться для лечения остеопороза. Аминокислоты в организме участвуют не только в синтезе белков, но и в некоторых других превращениях, таких, как дезаминирование, трансаминирование и декарбоксилирование. Эти превращения являются экзотермическими и снабжают организм энергией.

Процессы комплексообразования ионов металлов с аминокислотами играют важную роль в поддержании металло-лигандного баланса (гомеостаза) в живых организмах. Аминокислоты образуют стабильные пятичленные хелатные соединения с различными ионами металлов через амино- и карбоксильную группы (N, О-комплексообразование) [26, 27]. Некоторые аминокислоты имеют дополнительные места для связывания металла в боковой цепи и поэтому могут образовывать металлокомплексы различной структуры. Такие группы, как имидазольная в гистидине, фенольная в тирозине, тиольная в цистеине, Р- иу-карбоксилатная в аспарагиновой и глутаминовой кислотах, тиоэфирная в метионине являются важными металлосвязывающими участками в белках [28]. Боковые цепи аминокислот образуют микросреду вокруг металлоцентра, которая необходима для распознавания и фиксации субстратов и проявления каталитических функций [29].

Среди макробиогенных элементов стоит отметить значимую и особенную роль атома серы. Соединения, в состав которого входит сера, выполняют различные жизненно важные роли в организме. К ним относится, в частности, тиоцианат, концентрация которого в организме человека достигает 6 ммоль/л (в жидкостях, продуцируемых слизистыми оболочками; его содержание в крови - на порядок ниже) [30]. По реакции с пероксидом водорода, катализируемой миелопероксидазой, лактопероксидазой [30], пероксидазой слюны [31], а также при взаимодействии с гипохлоритом [32] тиоцианат окисляется до гипотиоцианита (OSCN"). OSCN" является селективным окислителем, подавляющим рост микроорганизмов в дыхательных путях человека [30].

К наиболее важным серосодержащим аминокислотам относятся цистеин, цистин (продукт окисления цистеина), N-ацетилцистеин, гомоцистеин, метионин и таурин (рис. 2). Все они, за исключением таурина, участвуют во многочисленных редокс реакциях. Исключительно важные функции серосодержащих аминокислот обусловлены присутствием в их составе атома серы [33]. Рассмотрим основные свойства главной редокс активной серосодержащей аминокислоты – L-Цистеин (Cys, или CysSH) представляет собой бесцветные кристаллы, легко растворимые в воде; при 25 С имеет рКа (СООН) = 1.71; pKa(SH) = 8.3; pKa(NH2) = 10.8; рI = 5.1 [12]. В щелочной среде цистеин неустойчив и разлагается на H2S, NH3 и пировиноградную кислоту. Цистеин легко окисляется на воздухе, образуя цистин (CysSSCys), который встречается в большинстве белков, но в особенно больших количествах — в белках покровных тканей (рог, шерсть, волос, перья). Цистин очень трудно растворим в воде. Дисульфидная группа цистина легко восстанавливается до сульфгидрильной группы (реакция 1). При этом цистин превращается в цистеин, который при окислении может быть вновь превращен в цистин. При окислении цистеина может также образовываться цистеиновая кислота HO3SCH2CH(NH2)COOH. Декарбоксилирование цистеина приводит к цистамину HSCH2CH2NH2. Цистеин легко ацилируется и алкилируется по группе SH, но S-ацильные производные неустойчивы, особенно в щелочной среде, и претерпевают S,N-ацильную перегруппировку. COO-2H C CH2 SH NH3+ [О] [2Н] COO-H C CH2 S NH3+ S COO-CH2 C H NH3+ (!)

Особенная роль цистеина в белках обусловлена его способностью образовывать при окислительной димеризации дисульфидную связь с другим остатком цистеина. Внеклеточные белки особенно богаты этими дисульфидными связями, играющими фундаментальную роль в повышении стабильности белков [34]. Цистеин принимает участие во многих биохимических процессах, включая образование дисульфидных связей, связывание металлов, многочисленные окислительно-восстановительные реакции [35]. Очень важную роль в природе играют Fe-S кластеры белков. Они участвуют в процессах фиксации азота, переноса электронов, катализе гомолитических реакций [36, 37].

Взаимодействие кобаламинов с аминокислотами и аскорбиновой кислотой

Этот интерес обусловлен высоким сродством кобинамида к цианиду, что позволяет применять его в качестве антидота [92] и хемосенсора на цианид [93]. Высокую эффективность в обнаружении цианида проявили также производные кобинамида - метильные эфиры кобириновой кислоты (кобэстеры) [93,94]. Недавние исследования [95,11] показали также, что кобинамид с высокими скоростями реагирует с сульфидом, что определяет перспективы его использования в качестве антидота на сероводород.

Кобинамид используется как вспомогательное средство совместно с нитропруссидом в терапии гипертонии и сердечно-сосудистой недостаточности, способствуя снятию токсического эффекта выделяющегося цианида без влияния на процесс образования NO [96]. Показано также, что Cbi-NO является эффективным донором NO [97].

Во многих реакциях с участием кобаламина и их производных ключевым процессом являются окислительно-восстановительные переходы между Co(III), Co(II) и Co(I) формами этих комплексов. Рассмотрим свойства и механизмы реакции Co(III), Co(II) и Co(I) кобаламина и кобинамида.

Восстановление аква-Co(III)–корриноидов в Co(II) комплексы протекает сравнительно легко. С одной стороны, это объясняется достаточно высоким потенциалом пары Co(III)/Со(II). С другой стороны, высокая подвижность воды облегчает ее замену восстановителем. Окислительно-восстановительные потенциалы H2OCbl(III)base-on/Cbl(II)base-off и (H2O)2Cbi(III)/Cbi(II) пар составляют +0.20 и +0.51 В (22C, отн. стандартного водородного электрода, СВЭ ) [98], что выше, чем потенциал многих других биологически важных соединений. Окислительно-восстановительный потенциал H2OCbl(III) сильно зависит от рН: значение +0.20 В (22С) не меняется только в интервале рН 2.9-7.8 и становится более отрицательным при рН выше 7.8 и более положительным при рН ниже 2.9 [98]. Указанные эффекты объясняются изменениями природы аксиальных лигандов в зависимости от кислотности среды: при рН 7.8 аква лиганд депротонируется, образуя гидроксид, а при рН 2.9 к диметилбензимидазолу присоединяется протон, образуя Cbl(II) и Cbl(III) base-off формы. Известно много соединений, способных восстанавливать аква-Cbl(III) и Cbi(III)-формы в соответствующие Co(II) комплексы, в том числе аскорбиновая кислота [99], моносахариды [100], борогидрид натрия [101], формиат натрия [102], тиолы [103].

На примере восстановления H2OCbl(III) формиатом было показано, что скорость реакции зависит от кислотно-основных свойств реагентов. Наблюдаемое снижение скорости при рН 5 вызвано протонированием формиата (рКа = 3.53 [102]) а при рН 7 – переходом H2OCbl(III) в Cbl(III)-OH- (рКа = 7.75 [104]). Так как гидроксид является инертным по отношению к замещению, восстановление Cbl(III)-OH- требует предварительного протонирования (схема 8).

Схема 8. Общий механизм восстановления аквакобаламина Механизмы реакций аква-Cbl(III) и Cbi(III) с тиолами достаточно сложны и зависят от природы исходных реагентов. Взаимодействие H2OCbl(III) с глутатионом [105,104], N-ацетилцистеином [106], гомоцистеином [106], у-глутамилцистеином [3] и каптоприлом [107] приводит к образованию достаточно стабильных Cbl(III)-SR" комплексов, структура которых была установлена с помощью рентгеноструктурного анализа. Данные ЭПР свидетельствуют об эффективности взаимодействия Co(II) -комплексов с тиильными радикалами [108]. Восстановление производных кобаламина, содержащих прочно связанные лиганды в р-положении (например, CN", СН3\ Ado" и другие), протекает намного медленнее, чем восстановление аквакомплексов. Электрохимическое восстановление цианокобаламина наблюдается при -0.76 В (в смеси ДМСО/пропанол), что соответствует необратимому двухэлектронному процессу, продуктом которого является Cbl(I) [98]. Лимитирующей стадией процесса является диссоциация ДМБИ, после которой протекает реакция образования комплекса с восстановителем и перенос электронов (схема 9). С Co(II) корринами цианид связывается слабо и, следовательно, покидает комплекс [98].

В отличие от других Co(III)-комплексов, Co(III)-кобаламины довольно легко вступают в реакцию замещения лигандов, что свойственно лабильным комплексам Co(II). Сравнение констант скорости реакций замещения лигандов в ряду тетраамино-, кобалоксимовых, порфириновых и корриновых Co3+-комплексов дает приблизительное соотношение 1: 104 : 106 : 109 [75]. Необходимо отметить, что ненасыщенность при переходе от тетрааминовому к порфириновому экваториальному лиганду увеличивается. Однако коррин характеризуется меньшей ненасыщенностью, чем порфирин. Увеличение цис-эффекта корринового лиганда может быть связано с ростом поляризуемости макроцикла и уменьшением размера полости тетрапиррола, ведущим к увеличению перекрывания между его орбиталями и орбиталями иона кобальта [75].

Взаимодействие аквакобаламина и диаквакобинамида с аминокислотами и цианамидом

Результаты, изложенные в данном параграфе, рассматриваются в работах автора [160-162]. Исследовано взаимодействие аквакобаламина (Н2ОCbl(III)) с аспарагином, глутамином, аспарагиновой и глутаминовой кислотами. Поскольку известно, что Н2ОCbl(III) разрушается в сильнощелочных и сильнокислых средах, реакция Н2ОCbl(III) с аминокислотами изучена в диапазоне рН 5.7 - 11.4.

Взаимодействие Н2ОCbl(III) с избытком аспарагина (Asn) сопровождается спектральными изменениями, показанными на рис. 9, аналогичными изменениям при образовании комплекса кобаламина с глицином [151], в котором аминокислота связана с кобаламином через аминогруппу. Такие же спектральные изменения наблюдаются при введении в раствор аквакобаламина глутамина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Электронные спектры поглощения аквакобаламина (спектр 1) и продукта его взаимодействия с аспарагином при рН 7.5 (спектр 2); [Сbl(III)]0 = 5 Ю-5 моль/л, [Asn]0 = 0.1 моль/л, 35 C Спектрофотометрическое титрование аквакобаламина аспарагином показало, что зависимость оптической плотности при 360 нм от начальной концентрации аминокислоты нелинейна (рис. 10). Это свидетельствует об образовании комплекса между кобаламином и аминокислотой (АК): HO CoIir N (24) 2 AK + AK N + H20 Аналогичные результаты были получены и для остальных аминокислот. Расчет констант равновесия реакций аминокислот с аквакобаламином проводился с использованием уравнения (22) на основе зависимости поглощения при 360 нм от начальной концентрации лиганда в растворе (пример такой зависимости представлен на рис. 10).

Зависимость оптической плотности при 360 нм от начальной концентрации Asn для реакции аквакобаламина с аспарагином: [Сbl(III)]0 = 5 10-5 моль/л, рН = 7.5, 35 C Константы равновесия могут быть рассчитаны с использованием уравнения (23) с учетом концентрации не участвующих во взаимодействии частиц (протонированных аминокислот, гидроксокобаламина), присутствующих в растворе при данном значении pH. Полученные результаты представлены в таблице 1. Из нее видно, что константы равновесия реакции в случае аминокислот превышают таковые для амидов.

Таблица 1. Константы равновесия реакции (24) (pH = 7.5, 35C) Аминокислоты Kнабл, л/моль K, л/моль Asn 34.0 + 2.0 (2.5 +0.1) x 103 Gin 45.5 + 2.9 (7.2 +0.4) x 103 Asp 31.2 + 2.1 (1.5+ 0.1) x 104 Glu 37.0 + 2.4 (2.0 +0.1) x 104 Типичная кинетическая кривая реакции аквакобаламина с аминокислотами представлена на рис. 11. Обработкой кинетических данных в полулогарифмических координатах показано, что порядок по аквакобаламину равен единице.

Кинетическая кривая реакции аквакобаламина с аспарагином, [СЬ1(Ш)]о = 5х10"5 моль/л, [Asn]0 = 0.12 моль/л, рН = 7.5, 35 C При увеличении концентрации аспарагина скорость реакции линейно возрастает (рис. 12). Идентичные результаты получены для других аминокислот. Наличие отрезка, отсекаемого на оси ординат, свидетельствует об обратимости реакции.

Зависимость, представленная на рис. 12, может быть описана уравнением (25) (АK – аминокислота): кнабл к і [АК] + к_! (25) k, с-1 набл. 0,04 55С 0,03 0,02-/ 45С 0,01 35С 25С 0,00 0,02 0,04 0,06 [Asn]0, моль/л 0,08 Рис. 12. Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции аквакобаламина с аспарагином от концентрации последнего при различных температурах, [СЬ1(Ш)]0 = 5 х 10"5 моль/л, рН= 6.1 Установлено, что k`1 - наблюдаемая константа скорости второго порядка, определяемая по тангенсу угла наклона зависимости kнабл – [АK]0, зависит от рН (рис. 13), а k-1, определяемая по отсекаемому на оси ординат отрезку – нет.

Из рис. 13 видно, что зависимости k`1 от pH проходят через максимум. Такая зависимость характерна для реакций, скорость которых определяется кислотно-основными свойствами двух и более реагентов. Известно, что кобаламин в растворе существует в аква- и гидроксо формах [163]. Поскольку OH- лиганд в кобаламине инертен в реакциях замещения [164], можно полагать, что во взаимодействии с аминокислотами участвует аквакомплекс.

Кислотно-основные свойства аминокислот характеризуются несколькими pKa [165]. Поскольку в щелочных средах (в области pKa аминогруппы) скорость реакции увеличивается, можно предложить следующую схему реакции аквакобаламина с аминокислотами (в этой и последующих схемах общие заряды корриновых комплексов опущены):

С использованием литературных данных о Ka1 (pKa(H2OCbl) = 7.8) [163] и Ka2 (табл. 2) по уравнению (26) были определены значения k1 при 350С (константы не зависящей от рН) для реакций с участием аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, соответственно: 3.2 ± 0.2, 2.9 ± 0.2, 3.3 ± 0.2, 3.9 ± 0.3 л/(моль с). Полученные значения констант близки между собой и к константам для первичных аминов (например, для NH2CH2CO2CH3 k = 3.47 ± 0.02 л/(моль с) при рН = 7.4, 350С, NH2(CH2)2OH k = 2.62 ± 0.09 л/(моль с) при рН = 9.05, 300С) [164] и для гистидина (k = 2.02 л/(моль с) при рН = 7.5, 370С) [152]. Таблица 2. Константы кислотно-основного равновесия для аминокислот

Взаимодействия в системе аскорбиновая (дегидроаскорбиновая) кислота / кобаламин (кобинамид) / аминокислота (пептид) или тиоцианат

Зависимость константы скорости реакции окисления кобаламина (II) k от рН показана на рис. 42. Она описывается S-образной кривой с рКа = 4.40 ± 0.03 (25 C, [SCN-]0 = 0.5 моль/л). Такой характер pH-зависимости можно объяснить существованием равновесия между димером (DDHA) и мономером (MDHA) дегидроаскорбиновой кислоты и тем фактом, что MDHA является более сильным окислителем, чем DDHA [158]. При pH 5 в растворах существует только мономерная форма дегидроаскорбиновой кислоты [158]. При pH 4 в водных растворах обнаружены также ее димеры. Рис. 42 показывает, что различия в скоростях окисления Cbl(II) дегидроаскорбиновой кислотой в присутствии тиоцианата невелики (в отличие от аналогичной реакции в присутствии SH-аминокислот и глутатиона, рис. 29), т.е. реакционная способность мономеров и димеров отличается незначительно, и/или концентрация димеров в сильнокислых средах невелика (этим же, по-видимому, объясняется тот факт, что не обнаруживаются существенные отклонения от первого порядка по DHA при проведении процесса окисления СЫ(П) в сильнокислых средах). Отметим, что в присутствии тиоцианата реакция в слабокислых растворах протекает значительно медленнее, чем в присутствии SH-аминокислот и глутатиона, даже при очень больших концентрациях (санти- и децимолярных) тиоцианата. Так, константа скорости второго порядка при рН 6.4 в присутствии 1 х 10"3 моль/л глутатиона равна 274 л/(моль х с), а в присутствии 0.5 моль/л тиоцианата - 3 л/(моль х с). Однако в сильнокислых растворах различия значительно меньше (ср. рис. 29 и 42). Очевидно, в случае SH-аминокислот и глутатиона важнейшую роль играют процессы депротонирования, т.е. образования анионов (поскольку тиоциановая кислота является очень сильной, процессы протонирования/депротонирования в случае тиоцианата практически не играют существенной роли в водных растворах с рН 1.5-7.0).

Выше показано, что в присутствии тиоцианата и особенно SH-аминокислот и глутатиона увеличивается скорость редокс превращений в системе аскорбиновая (дегидроаскорбиновая) кислота/кобаламин/8Н-аминокислота (пептид) или тиоцианат. Наиболее вероятной причиной этого является образование комплекса СЫ(П)-аминокислота (пептид) или тиоцианат, обладающего более сильными восстановительными свойствами, чем кобаламин(П). Для дополнительной проверки правильности этого вывода использовался метод циклической вольтамперометрии. Установлено, что введение в раствор кобаламина (II)/DHA глутатиона или тиоцианата приводит к сдвигу восстановительного потенциала СЫ(П) к более отрицательным значениям (рис. 43 и 44), т.е. комплексы СЫ(П) с глутатионом и тиоцианатом являются более сильными восстановителями, чем СЫ(П). GSH оказывает более сильный эффект, чем SCN" (табл. 8). k , л/(моль х с) 3,5 2AFR + H+ HAA +

Координация SH-аминокислоты (пептида) или тиоцианата приводит к лабилизации и разрыву связи Co(II) – N (ДМБИ). Вакантное аксиальное положение занимает дегидроаскорбиновая кислота, в результате взаимодействия которой с Co(II) центром образуются аскорбил радикал (AFR-) и RS-Сbl(III) или тиоцианато-Cbl(III). Аскорбил радикал неустойчив в кислой среде и диспропорционирует с образованием аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот. Наиболее важным различием процессов окисления Cbl(II) дегидроаскорбиновой кислотой в присутствии RSH и SCN- является наличие в первом случае обратимой стадии I. Существование этой стадии объясняет наличие отмеченного выше отрезка, отсекаемого на оси ординат зависимостью константы скорости окисления Cbl(II) в присутствии RSH от концентрации дегидроаскорбиновой кислоты. Если в системе присутствуют дополнительные восстановители или увеличивается концентрация уже имеющегося восстановителя, например, глутатиона (см. выше), они взаимодействуют с аскорбил радикалом, что приводит к практически полной аналогии механизмов реакций окисления Cbl(II) в присутствии RSH и SCN-. Схемы 18 и 19 показывают, что SH-аминокислоты, глутатион и тиоцианат в процессе окисления Cbl(II) не расходуются, их роль заключается в активации Co2+-центра. Поскольку in vivo концентрация биовосстановителей (глутатиона, аскорбиновой кислоты, цистеина), способных взаимодействовать с Cbl(III), намного больше концентрации витамина B12, можно полагать, что стехиометрические реакции, представленные схемами 18 и 19, превратятся в каталитические реакции между DHA и “дополнительным” восстановителем, включающие стадии регенерации Cbl(II).

Действительно, установлено, что в присутствии дегидроаскорбиновой кислоты восстановление цистеином аквакобаламина существенно замедляется (рис. 45), т.е. наряду с восстановлением Cbl(III) цистеином до Cbl(II) протекает его окисление дегидроаскорбиновой кислотой. Дополнительным подтверждением каталитического действия кобаламина на реакцию дегидроаскорбиновой кислоты и цистеина служат результаты исследования этой реакции с использованием метода крио ESI-MS. AAAAAA, показывает, что в присутствии кобаламина продукт реакции – цистин (депротонированному цистину отвечает пик при 239.0179) накапливается значительно быстрее, чем в отсутствие кобаламина. Результаты, представленные на рис. 46, свидетельствуют о том, что цистеин играет одновременно две роли – активирующего лиганда и дополнительного восстановителя. Известно, что цистеинилкобаламин (CysCbl) значительно менее стабилен, чем глутатионилкобаламин (GSCbl) [3]. Пониженная устойчивость CySCbl объясняется дестабилизирующим влиянием заряженной -NH3+ группы цистеина на связь Co-S. Кроме того, больший размеры глутатиона способствуют взаимодействию его терминальной карбоксилатной группы с боковой цепью корринового конца, что увеличивает стабильность глутатионилкобаламина [3,183]. Очевидно, низкая стабильность комплексов кобаламинов (III) и (II) с цистеином будет способствовать проявлению им каталитического эффекта в реакции восстановления дегидроаскорбиновой кислоты.