Содержание к диссертации
Введение
1. Высокоэффективная жидкостная хроматография фенольных соединений (обзор литературы) 8
1.1. Механизмы удерживания в жидкостной адсорбционной хроматографии 8
1.2. Фенольные соединения как биологически активные вещества 34
1.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе растительных фенольных соединений 42
2. Методика эксперимента 49
2.1. Объекты исследования 49
2.2. Подготовка подвижной фазы 53
2.3. Методика хроматографического эксперимента при проведении физико-химических исследований 54
2.4. Методика пробоподготовки и хроматографического анализа экстракта коры ивы корзиночной 58
2.5. Методика пробоподготовки и анализа экстракта плодов расторопши пятнистой 59
2.6. Методика пробоподготовки и хроматографического анализа экстракта надземной части полыни эстрагон 61
2.7. Оценка погрешностей эксперимента и расчета констант уравнений линейных регрессий 64
3. Физико-химическое обоснование расчета констант адсорбции и распределения из хроматографических данных 67
3.1. Расчет константы гиббсовской адсорбции из хроматографических данных с учетом внеколоночных объемов 67
3.2. Расчет константы распределения между адсорбционным (двухмерным) и объемным растворами из хроматографических данных 70
4. Физико-химические закономерности удерживания фенольных соединений в нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 76
4.1. Влияние природы фенольных соединений на хроматографическое удерживание в системах Сепарон SGX- пропанол-2 — гексан и Сепарон SGX— бутанол-1 — гексан 76
4.2. Влияние состава подвижной фазы пропанол-2 - гексан на хроматографическое удерживание фенольных соединений 94
4.3. Влияние состава подвижной фазы бутанол-1 - гексан на удерживание фенольных соединений в нормально-фазовой ВЭЖХ. Влияние природы модификатора на удерживание 109
5. Физико-химические закономерности удерживания фенольных соединений в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 127
5.1. Влияние природы фенольных соединений на хроматографическое удерживание в системе Сепарон SGX С is — ацетонитрил — вода 128
5.2. Влияние состава подвижной фазы ацетонитрил - вода на хроматографическое удерживание фенольных соединений 141
6. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе экстрактов растений, содержащих фенольные соединения 163
6.1. Определение триандрина и салицина в Salix viminalis L. методом об-ращенно-фазовой ВЭЖХ 164
6.2. Анализ флавоноидов в плодах расторопши пятнистой Silybum marianum (L.) Gaern. 170
6.3. Определение флавоноидов травы полыни эстрагон Artemisia dracunculus L . 175
Выводы 185
Список литературы 188
- Фенольные соединения как биологически активные вещества
- Расчет константы распределения между адсорбционным (двухмерным) и объемным растворами из хроматографических данных
- Влияние состава подвижной фазы бутанол-1 - гексан на удерживание фенольных соединений в нормально-фазовой ВЭЖХ. Влияние природы модификатора на удерживание
- Определение флавоноидов травы полыни эстрагон Artemisia dracunculus L
Фенольные соединения как биологически активные вещества
Интерес к фенольным соединениям вообще и к их биологическому действию в частности вызван широким, практически всеобщим их распространением в растительном и животном мире, наличием у этого класса веществ достаточно высокой и разнообразной химической, биохимической и физиологической активности.
Своеобразие фармакологического действия растительных фенольных соединений, в сочетании с низкой токсичностью большинства из них, послужило основанием для использования ряда фенольных препаратов в качестве средств профилактики и лечения болезней человека, чему способствовало установление роли фенолов как действующих начал многих средств народной медицины.
Интерес к растительным фенольным соединениям закономерно возрастает, что нашло отражение в публикации ряда сборников и монографий [72-76], а также в быстро увеличивающемся количестве сообщений в научной периодике.
Широте распространения фенольных соединений в растительном мире соответствует разнообразие их химической структуры. Знакомство со структурой и химическими свойствами растительных фенольных соединений облегчает понимание хроматографического поведения, биохимической активности фенолов, молекулярных механизмов их взаимодействия с белками, нуклеиновыми кислотами, а также с аскорбиновой кислотой, пирокатехинаминами и другими биологически важными соединениями, определяющими, в свою очередь, их физиологическую и фармакологическую активность.
Фенольными соединениями называют многочисленные вещества, содержащие ароматическое кольцо с одной или несколькими гидроксильными группами, и их многочисленные производные. В настоящее время известно свыше 2000 природных фенольных соединений (в подавляющем большинстве - растительного происхождения). Фенольные ядра входят в состав и других растительных соединений (стероидов, алкалоидов и др.), которые, однако, по своему биогенезу, структуре и функциям принадлежат к другим классам веществ.
В настоящее время известны различные классификации фенольных соединений. Нам представляется наиболее рациональной широко распространенная классификация [72, 73], исходящая из структурных особенностей углеродного скелета фенолов. 1. Простые фенолы (С).
К простейшим фенольным соединениям относятся фенол и его ближайшие производные. Сам фенол в малых количествах был обнаружен в хвое сосны, в составе эфирного масла листьев черной смородины, табака и руты. Пирокатехин найден в листьях тополя и эфедры, чешуе лука, а также в некоторых других растениях. Свободный гидрохинон был выделен из коры и листьев груши {Pyrus communis). Его глюкозид арбутин найден в листьях толокнянки и в ряде растений принадлежащих к семействам Ericaceae, Rosaceae и Compositae. Пирогаллол в небольших количествах найден в шишках секвойи и чешуе лука [75]. 2. Фенолокислоты и их производные (Ca-Cj).
Среди оксибензойных кислот почти повсеместное распространение имеют и-оксибензойная, протокатеховая и ванилиновая кислоты. Довольно часто встречаются также галловая и гентизиновая кислоты, несколько реже - салициловая, сиреневая и о-пирокатеховая (2,3-диоксибензойная). За исключением галловой кислоты, все другие оксибензойные кислоты присутствуют в растительных тканях главным образом в виде растворимых и нерастворимых производных с углеводами. Салицин - О/Ш-глюкопиранозид салицилового спирта является одним из объектов наших исследований. Салицин обнаружен в растениях семейства ивовых {Saiicaceae) [77]. Большое внимание, уделяемое в последние годы фенольным соединениям, объясняется широким спектром их биологического и фармакологического действия. В работе [83] показана многосторонность биологического действия растительных фенолов на гладкую мускулатуру внутренних органов, а также на коронарное кровообращение и сосудистую систему, желчеотделение, обезвреживающую функцию печени и диурез, отмечено их капилляроукрепляющее и противоязвенное действие.
Для флавоноидов характерно влияние на коронарные сосуды и сосуды внутренних органов. Установлено, что на увеличение корон арорас ширяю щей активности флавоноидов оказывает влияние количество гидроксильных групп, метоксилирование в 4 -положение. Укрепление сосудистой стенки и снижение ломкости капилляров выражено наиболее сильно у гликозидов флавоноидов. Желчегонное действие флавоноидов возрастает в ряду флавонолы флавон флаваноны. Флавонолы, в основном, оказывают влияние на обезвреживающую функцию печени. Механизм действия довольно сложный, связанный с изменением окислительно-восстановительных процессов в митохондриях клеток печени. Силу желчегонного действия и обезвреживающей функции печени определяют количество и местоположение гидроксилов в агликонах и в кольце В, а также природа сахарного компонента. Большинство флавоноидов обладает также умеренным диуретическим эффектом, в механизме которого основная роль принадлежит расширяющему действию на сосуды почек.
Сравнительное изучение [83] растений рода Черноголовка, полынь, багульник показывают, что из суммарных комплексов, содержащих кумарины, терпеновые гликозиды, стероидные сапонины, иридоиды, флавоноиды, эфирные масла, оксикарбоновые и фенолкарбоновые кислоты, наиболее выраженной антигрибковой активностью обладают флавоноиды и производные фенол-карбоновых кислот.
В медицинской практике успешно используются тонизирующие препараты родиолы розовой [84, 85], элеутерококка колючего [86-88], сирени обыкновенной [89], ивы корзиночной [78] и многих других растений. Биологическая активность этих растений вызвана наличием в них фенилпропаноидов - роза-вина, триандрина, сирингина и др. [76].
Стимулирующие и адаптогенные свойства родиолы розовой и ивы корзиночной обусловлены триандрином. Противораковые свойства препаратов родиолы розовой и элеутерококка колючего, вероятно, также обусловлены фе-нилпропаноидами [78].
При исследовании химического состава таких лекарственных растений, как родиола розовая (корневища и культура ткани), элеутерококк колючий, сирень обыкновенная, ива корзиночная был выделен ряд фенилпропаноидов и их глико-зидов, для которых изучена биологическая активность [76]. Сравнительное исследование нейротропной активности веществ показало, что наиболее выраженные стимулирующие свойства проявляют триандрин и розавин, в меньшей степени активен сирингин [90]. При изучении иммуностимулирующих свойств некоторых фенилпропаноидов было установлено, что наиболее выраженную иммуностимулирующую активность проявляет сирингин - гликозид синапового спирта [78].
Расчет константы распределения между адсорбционным (двухмерным) и объемным растворами из хроматографических данных
При теоретическом изучении адсорбции из растворов часто бывает необходимым переход от избыточной адсорбции Г к полному содержанию Z-Ro компонента в адсорбционном слое а;(в молях или мкмолях на единицу поверхности) [135-137]. Для этого часто используют модель мономолекулярного слоя постоянной толщины.
Величина избыточной гиббсовской адсорбции Г\ , как известно, не зависит от какой-либо модели поверхностного раствора [138]. Кроме того классическое определение Г і содержит допущение о том, что плотность раствора остается неизменной вплоть до поверхности адсорбента. Поэтому вводят и другие способы выражения избыточной адсорбции [34]
Модель бинарного адсорбированного раствора как мономолекулярного слоя постоянной толщины вводит чуждую термодинамике Гиббса величину - толщину адсорбционного слоя д. Обычно толщина адсорбционного слоя не сохраняется постоянной вследствие различий в размерах молекул компонентов 1 и 2 и изменения их ориентации при изменении состава объемного и поверхностного растворов. Однако есть случаи, когда толщина адсорбционного слоя при адсорбции из бинарного раствора приблизительно постоянна. К ним относится адсорбция плоских ароматических углеводородов на гидроксилированной поверхности силикагеля из растворов в н-алканах [34]. Молекулы ароматических углеводородов ориентируются практически параллельно поверхности, образуя мономолекулярный поверхностный растворы, толщина которого равна ван-дер-ваальсовой толщине бензольного кольца и молекул н-алкана в вытянутой конформации.
Таким образом, уравнение (92) связывает термодинамическую константу распределения іхпри адсорбции с фактором удерживания к, определяемым из хроматографических данных, при тех допущениях, о которых говорилось выше.
По Снайдеру [16] к = \(р-Х2)/Х2 (уравнение (26)), откуда следует, что Кх-к- (Vm /Va), что противоречит уравнению (92).
Следует отметить, что формула Снайдера является приближенной и получается из уравнения (92) при VM » Va и высоких значениях к (в случае сильно адсорбирующих веществ).
Аналогичные соотношения выведены и для адсорбции из трехкомпо-нентного раствора [32]. Показано, что уравнение (91), устанавливающее связь Кх с к справедливо и в случае применения бинарных подвижных фаз.
В рамках указанного подхода величина стандартной дифференциальной энергии Гиббса адсорбции может быть рассчитана по уравнению:
AaG =-RT-lnKx, (95) где величина AaG характеризует изменение энергии Гиббса при переходе 1 моль чистого жидкого адсорбата в состояние адсорбированной фазы с Xs = 1 при условии Р,Т - const.
Связь избыточных и полных величин адсорбции из многокомпонентных растворов установлена в работе [139]. Проведенный нами на основании литературных данных теоретический анализ взаимосвязи характеристик удерживания в жидкостной хроматографии с различными константами адсорбции позволил достаточно обоснованно рассчитать константы гиббсовской адсорбции Кг с с учетом внеколоночных объемов по уравнению (69), константы распределения фенольных соединений между адсорбционной и объемный растворами Кх по уравнению (92) и величину стандартной дифференциальной энергии Гиббса адсорбции по уравнению (95).
Влияние состава подвижной фазы бутанол-1 - гексан на удерживание фенольных соединений в нормально-фазовой ВЭЖХ. Влияние природы модификатора на удерживание
В работе впервые изучено хроматографическое поведение фенольных соединений в нормально-фазовой ВЭЖХ с использованием бинарной подвижной фазы бутанол-1 - гексан. Концентрацию модификатора-бутанола-1 Хт варьировали от 1.0 до 15.0 об.%, что соответствовало изменению Хт от 0.01 до 0.20.
Экспериментальные данные по удерживанию приведены в таблице 4.5.
Для оценки влияния концентрации бутанола-1 в элюенте на удерживание фенольных соединений в соответствии с моделью Снайдера-Сочевинского были построены зависимости логарифма фактора удерживания от логарифма мольной доли бутанола-1 в подвижной фазе, рис. 14-16. В таблице 4.14 приведены параметры уравнения Снайдера-Сочевинского для подвижной фазы бутанол-1 - гексан.
Линейные зависимости, представленные на рис. 14-16, показывают закономерное уменьшение удерживания по мере увеличения количества модификатора в подвижной фазе. Согласно значениям коэффициентов корреляции г модель Снайдера-Сочевинского при описании зависимости удерживания феноль-ных соединений в системе Сепарон SGX - бутанол-1 - гексан от содержания модификатора в элюенте выполняется несколько хуже, чем в системе Сепарон SGX - пропанол-2 - гексан. Анализируя константы уравнения Снайдера-Сочевинского, следует отметить, что значения п в случае подвижной фазы бутанол-1 - гексан выше, чем в случае пропанол-2 - гексан. То есть все исследованные фенолы вытесняют из адсорбционного слоя больше молекул бутанола-1, чем молекул пропанола-2. По-видимому, это связано с различием в молекулярных площадках этих двух модификаторов в адсорбционном слое: для практически линейной молекулы бутанола-1 она меньше, чем для более разветвленной молекулы пропанола-2.
Необходимо отметить особое поведение коричного спирта (п 1), пирогаллола (п 1), резорцина и гидрохинона [пг 2). Это свидетельствует о том, что число вытесненных молекул модификатора определяется количеством полярных ОН-групп адсорбата, не участвующих в образовании внутримолекулярных водородных связей, как в случае пирогаллола и пирокатехина.
Представленные в таблицах 4.8 и 4.14 данные по величинам п в системах силикагелъ-пропанол-2 — гексан и силикагелъ-бутанол-1 — гексан позволяют отвергнуть гипотезу об адсорбции молекул исследованных фенольных соединений параллельно поверхности силикагеля, так как в этом случае значения п должны изменяться в более широких пределах. Значительно более вероятной представляется локализованная на дискретных центрах адсорбция с «перпендикулярным» по отношению к поверхности расположением гидроксильных групп молекул адсорбатов. При этом наиболее предпочтительное стехиометрическое отношение в процессе адсорбции 1:1. Адсорбция на 2 центрах одновременно представляется значительно менее вероятной. В таблицах 4.8 и 4.14 значения п приближались к 2 только для резорцина и гидрохинона, в которых возможность образования адсорбционного комплекса с адсорбентом не ослаблена внутримолекулярными взаимодействиями гидроксильных групп.
Рассмотрим данные по удерживанию фенольных соединений в системе Сепарон SGX- бутанол-1 - гексан в рамках модели Эльтекова [32]. При вычислении величины Кх принимали для колонки с Сепароном SGX объем, занятый подвижной фазой, равным 0.196 см3, а объем адсорбционного слоя в случае элюента бу-танол-1 - гексан Va -0.050см . При расчете Va величину 8 принимали равной 5.58 А, что соответствует длине молекулы бутанола-1 в вытянутой конформации.
Рассчитанные по уравнению (92) значения константы распределения Кх ад-сорбатов между подвижной (объемной) и адсорбированной (поверхностной) фазами в системе Сепарон SGX - бутанол-1 - гексан приведены в таблице 4.15. Для оценки применимости модели Эльтекова для описания удерживания фенольных соединений в системе Сепарон SGX- бутанол-1 - гексан от состава подвижной фазы построены зависимости lg Кх от величины -\m-lg Хт + п lg(l - Хт )], рис. 17. В случае, когда данная модель хорошо описывает удерживания адсорбатов от состава элюента, эти зависимости должны быть линейными.
Для описания зависимости Кх фенольных соединений от состава бинарной подвижной фазы бутанол-1 - гексан применено уравнение (12). При решении системы семи уравнений в качестве at были взяты значения lgKx при мольных долях бутанола-1 0.042, 0.070, 0.100, 0.124, 0.150, 0.176 и 0.201.
В таблице 4.16 приведены значения Z, т, п рассчитанные при решении системы уравнений (13).
Как следует из таблицы 4.16 одна молекула фенольного соединения (за исключением двухатомных фенолов) в среднем вытесняет одну молекулу бутанола-1, а молекулы пирокатехина, резорцина и гидрохинона вытесняют из адсорбционного монослоя в среднем 1.5-2 молекулы бутанола-1. Сравнительный анализ данных (таблицы 4.11 и 4.16) показывает, что значения т в случае мо-дификатора-бутанола-1 выше, чем в случае пропанола-2. Это еще раз подтверждает тот факт, что одна молекула фенольного соединения вытесняет из адсорбционного слоя молекул бутанола-1 больше, чем пропанола-2. Причиной этого, наряду с различием молекулярных площадок в адсорбционном слое, по-видимому, является более сильная адсорбция пропанола-2 на полярном адсорбенте из-за большего дипольного момента по сравнению с бутанолом-1.
Для оценки эффектов межмолекулярной ассоциации в системе с подвижной фазой бутанол-1 -гексан построены зависимости в координатах 1/к-Хт (рис. 18-20).
Из рис. 18-20 видно, что для всех соединений в области больших концентраций модификатора (9-15 об.%) наблюдаются сильные отклонения от линейной зависимости. Это объясняется увеличением вклада межмолекулярных взаимодействий адсорбат-модификатор с ростом концентрации бутанола-1. Увеличение вклада межмолекулярных взаимодействий объясняется большей способностью бутанола-1 к образованию водородных связей с молекулами сорбатов в подвижной фазе, что резко уменьшает их удерживание. По этой причине удерживание в этой системе не удаётся в полной мере описать моделью Скотта - Ку-черы. Зависимость удерживания исследованных сорбатов от мольной доли модификатора в элюенте Хт описывается в этом случае полиномом второй степени
Используя представленные в таблице 4.17 эмпирические коэффициенты а, Ь и с можно предсказать удерживание исследованных фенольных соединений и селективность их разделения при варьировании состава подвижной фазы бутан ол-1 — гексан.
Необходимо отметить, что вид представленных на рис. 17-19 зависимостей аналогичен случаю В (рис. 1), согласно которому межмолекулярная ассоциация адсорбат-модификатор соизмерима со специфическими взаимодействиями адсорбата с поверхностью адсорбента. Поэтому в рамках системы сили-кагелъ-бутанол-1 - гексан нами также предпринята попытка расчета констант полной адсорбции и ассоциации фенольных соединений по упрощенному уравнению (35), учитывающему только межмолекулярную ассоциацию типа адсорбат-модификатор. Расчеты по уравнению (35) проводили на основании данных по удерживанию фенольных соединений, представленных в таблице 4.3. Принимая константу адсорбцию бутанола-1 из н-гексана равной Км - 800 [53], величины q Ks, Ks и KSM, рассчитывали методом регрессионного анализа с использованием программы Statistica [134]. Константы адсорбции Ks и ассоциации адсорбат-модификатор К$м фенольных соединений в системе Сепарон SGX - бутанол-1 - гексан приведены в таблице 4.18. При вычислении величины ср = 0.255 принимали для колонки с Сепароном SGXобъем, занятый подвижной фазой, равным 0.196 см , а объем адсорбционного слоя в случае элюента бута-нол-J — гексан Va = 0.050см .
Приведенные в таблице 4.18 константы адсорбции фенольных соединений Ks изменяются от 126 (для я-ксиленола) до 1631 (для пирогаллола). То есть адсорбция фенольных соединений на гидроксилированном силикагеле главным образом определяется полярностью соединения.
При элюировании подвижной фазой бутанол-1 - гексан для большинства фенольных соединений заметный вклад в общее удерживание вносит межмоле-куярная ассоциация адсорбат-модификатор в объемном растворе, которая следует из высоких значений KSM.
Что касается константы ассоциации адсорбат-модификатор KSM , то она увеличивается с ростом вероятности образования направленной водородной связи между молекулами фенольного соединения и бутанола-1 в объемном растворе. Следует отметить, что высокие значения KSM наблюдаются для пирокатехина и фенола, а для коричного спирта и пирогаллола ассоциация адсорбат-модификатор мало выражена. В случае пирогаллола межмолекулярная ассоциация адсорбат-модификатор не выявлена, что является причиной высоких величин фактора удерживания к этого соединения по сравнению с другими фенолами в системе Сепарон SGX- бутанол-1 -гексан.
Сравним константы адсорбции Ks и ассоциации KSM фенольных соединений в системах силикагелъ-пропанол-2 - гексан и силишгелъ-бутанол-1 - гексан (таблица 4.13 и 4.18). Значения Ks фенольных соединений на Сепароне SGX при элюировании подвижной фазой пропанол-2 - гексан выше, чем при элюировании подвижной фазой бутанол-1 — гексан. Так как величина Ks характеризует квазихимическую реакцию адсорбции из однокомпонентной подвижной фазы (без модификатора), то обнаруженное различие в величинах Ks, по-видимому, обусловлено приближенным характером модели удерживания Ланина и Никитина, основанной на допущении равенства размеров молекул ад-сорбата и компонентов бинарной подвижной фазы в адсорбционном слое, а также идеальном поведении растворов.
Наличие корреляции между величинами Ks, полученными с использованием двух модификаторов (рис. 21) свидетельствует об одинаковой природе межмолекулярных сил притяжения адсорбат-твердый адсорбент.
Определение флавоноидов травы полыни эстрагон Artemisia dracunculus L
Надземная часть полыни эстрагон или тархуна (Artemisia dracunculus L., сем. астровых или сложноцветных - Asteraceae) широко применяется в качестве пряно-ароматического сырья и входит в рецептуру безалкогольного напитка «Тархун». Имеются многочисленные литературные данные о применении этого растения в качестве общеукрепляющего, противовоспалительного, ранозажив-ляющего, противоракового, диуретического, противоязвенного и улучшающего пищеварение средства [79].
Актуальность данных исследований определяется также и тем обстоятельством, что в настоящее время в Самарской области на базе Средне-Волжской зональной опытной станции НПО Всероссийского института лекарственных и ароматических растений (пос. Антоновка) созданы промышленные плантации тархуна, что в перспективе позволит использовать это растение не только для пищевых целей (РСТ РСФСР 667-82 "Эстрагон свежий"), но и в качестве лекарственного растительного сырья.
Широкий спектр биологической активности объясняется богатым набором действующих веществ, главными среди которых являются эфирные масла, флавоноиды, кумарины, каротиноиды [79]. Литературные данные относительно флавоноидного состава надземной части тархуна довольно противоречивы. Так, по данным отечественных исследователей в ней содержится лютеолин, кемпферол, кверцетин и их производные, тогда как зарубежные авторы сообщают о наличии в надземной части данного растения наряду с гликозидами кемпферо-ла и кверцетина флаванона нарингенина, метоксилированных флавонолов и гликозидов патуленина.
Ранее из экстракта тархуна выделены такие флавоноиды, как эстрагоно-зид, пиноцембрин, нарингенин и аннагенин [79]. Установлено, что основными флавоноидами полыни эстрагон являются эстрагонозид (8-o-a-L-рамнопиранозид 5,6,7,8,4"-пентагидрокси-3 -метоксифлавона) и пиноцембрин (5,7-дигидроксифлаванон), которые представляют наибольший интерес в связи со своей сильно выраженной антимикробной активностью и могут быть использованы для определения подлинности сырья и препаратов данного растения.
С этой целью нами разработана методика препаративного выделения эст-рагонозоида из травы тархуна методом колоночной хроматографией, в обра-щенно-фазовой ВЭЖХ разработана методика хроматографического разделения компонентов Artemisia dracunculus L., с использованием стандартного образца проведена идентификация эстрагонозида в экстрактах травы полыни эстрагон.
Препаративная жидкостная хроматография ориентирована на то, чтобы выделить один или большее число компонентов данного образца, которые собирают для дальнейшего использования, например, для продолжения синтеза, применения в качестве стандартных образцов для анализа.
Препаративное выделение компонентов проводилось в несколько этапов: экстракция исходного сырья; тонкослойный хроматографический (ТСХ) анализ; подготовка препаративной хроматографической колонки; элюирование компонентов тархуна.
Методика препаративного выделения эстрагонозида описано в п. 2.6.
Основным компонентом надземной части полыни эстрагон является впервые выделенное флавоноидное соединение, названное авторами работы [79] эст-рагонозидом. Структура данного соединения устанавливалась с помощью ЯМР Н-, УФ- и масс-спектроскопии и проведением химических реакций [79].
Эстрагонозид в условиях кислого гидролиза расщепляется на агликон (названный аннагенином) и рамнозу. Строение агликона как 5,6,7,8,4х-пентагидрокси-З -метоксифлавона следует из данных спектров ЯМР JH эстрагонозида (рис. 48 и 49), в котором присутствуют соответствующие сигналы трех ароматических протонов кольца В флавоноида (3\4Л - замещение) и протона при С-3.
Метильная группа отнесена нами к гидроксилу при С-Зл на основании данных УФ-спектров, в которых имеет место батохромный сдвиг длинноволновой полосы с увеличением интенсивности поглощения в присутствии метилата натрия. Данные УФ-спектров свидетельствуют также о наличии свободных гид-роксильных групп при С-6 (батохромный сдвиг длинноволновой полосы в присутствии АІСІз) и С-7 (небольшой батохромный сдвиг коротковолновой полосы в присутствии ацетата натрия).
Присоединение углеводного фрагмента к 8-ОН-группе эстрагонозида подтверждается тем, что полученный в результате кислотного гидролиза агли-кон становится нестабильным, о чем свидетельствуют данные УФ - спектров (вещество разрушается в присутствии метилата натрия). Кроме того, на пластинках «Силуфол УФ 254» желтая окраска пятна агликона, в отличие от эстра-гонозоида, становится при хранении хроматограмм зеленовато-коричневой.
С целью идентификации компонентов экстракта также были сняты масс-спектры образца экстракта тархуна с использованием нового метода MALDI -спектрометрии {MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation). Суть метода заключается в действии лазерного луча с длиной волны 337 нм, длительностью импульса около 3 нсек, максимальной энергией в импульсе 250 мкДж на образец. Масс-спектры были сняты с использованием матрицы - 2,5-дигидроксибензойной кислоты. В процессе анализа регистрировались только положительные ионы. Для матрицы характерны следующие массы: 137, 154, 155, 177, 192,273.
Целью данной части работы являлось получение максимально возможного разделения компонентов в экстрактах тархуна и идентификация эстрагонозида с помощью ВЭЖХ.
Исследования проводили в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ с использованием в качестве адсорбента Сепарон С;8. В работе [165] с использованием подвижной фазы ацетонитрил - вода (50:50, об.%) нами представлена методика идентификации и количественного анализа пиноцембрина в экстракте тархуна. Для получения более лучшего разделения исследовался этот же элю-ент ацетонитрил - вода в следующих соотношениях: 31:69; 25:75; 20:80 (об.%). Все элюенты были подкислены 2 н. фосфорной кислотой.
На рис. 51-53 представлены хроматограммы экстракта тархуна с использованием в качестве подвижной фазы трех подвижных фаз ацетонитрил - вода в соотношениях 31:69; 25:75; 20:80 (об.%), соответственно.