Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Полимеры, используемые для создания различных систем доставки .16
1.2 Обзор методик создания систем доставки .33
1.2.1 Дендримеры 34
1.2.2 Нанесение слоев на коллоидные частицы 35
1.3 Выводы к главе 1 39
Глава 2. Экспериментальная часть .42
2.1 Материалы 43
2.2 Методы 43
2.2.1 Методика формирования карбонатных ядер (3-5 мкм) .43
2.2.2 Методика формирования карбонатных ядер (600-800 нм) .44
2.2.3 Методика включения белка методом соосаждения .44
2.2.4 Методика включения белка методом диффузии в поры .44
2.2.5 Методика включения белка в оболочку капсулы 45
2.2.6 Методики присоединения флуоресцентных меток к модельным белкам.45
2.2.7 Методика формирования оболочки 46
2.2.8 Методика исследования высвобождения белков из микрокапсу 47
2.2.9 Сканирующая электронная микроскопия и метод энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии 47
2.2.10 Спектрофотометрия .48
2.2.11 Флуоресцентная спектрометрия .48
2.2.12 Конфокальная микроскопия 48
2.2.13 Методика включения микрокапсул в клетки 48
2.2.14 Компьютерное моделирование .49
Глава 3. Формирование микро- и нано- капсул методом полиэлектролитной адсорбции .50
3.1 Формирование микро- и нано- ватеритов CaCO3 .50
3.2 Исследование кинетики включения модельных белков в ядра .56
3.2.1 Включение белков методом соосаждения 57
3.2.2 Включение белков методом адсорбции в поры 61
3.3.Кинетика высвобождения объектов из ядер в имитаторах сред ЖКТ 64
3.3.1 Кинетика высвобождения из микрокапсул с нерастворенным ядром 64
3.3.2 Кинетика высвобождения из микрокапсул с растворенным ядром 69
3.3.3 Кинетика высвобождения из микрокапсул с растворенным ядром и встроеным в оболочку ингибитором пептидазы 71
3.4 Эффективность захвата микрокапсул клетками .74
3.5 Выводы к Главе 3 .79
Глава 4. Молекулярно-динамическон моделирование взаимодействия модельных пептидов и лизиновых дендримеров и дендриграфта 82
4.1 Исследование кинетики образования комплекса дендриграфтом 2-ого поколения с пептидом Семакс .82
4.2 Зависимость кинетики формирования комплекса от молекулярной массы пептида 91
4.3 Влияние поколения дендримера на кинетику образования комплекса с пептидом 96
4.4 Исследование кинетики распада комплекса с пептидами .101
4.5 Выводы к главе 4 104
Заключение 106
Список сокращений .107
Список литературы .108
- Полимеры, используемые для создания различных систем доставки
- Формирование микро- и нано- ватеритов CaCO3
- Исследование кинетики образования комплекса дендриграфтом 2-ого поколения с пептидом Семакс
- Влияние поколения дендримера на кинетику образования комплекса с пептидом
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Разработка и усовершенствование технологий выделения и очистки белков и пептидов
привело к тому, что интерес к их терапевтическому применению существенно вырос. На
данный момент для некоторых промышленно получаемых белков и пептидов, разработаны
различные лекарственные формы, которые уже нашли свое применение в медицине. К таким
белкам и пептидам можно отнести гранулоцитарный-макрофагальный
колониестимулирующий фактор, супероксиддисмутазу, пептид Семакс и многие другие.
Практически все известные в настоящее время белковые и пептидные лекарственные препараты имеют ряд побочных эффектов и низкую биодоступность. Большое значение эта проблема приобретает при лечении таких болезней, как рак, различные нейродегенеративные заболевания, ВИЧ и др. Например, при парентеральном способе введения пептида Семакс большая часть его молекул быстро разрушается ферментами крови и не достигает мозга, что приводит к необходимости постоянного контроля реальной концентрации препарата. При других способах его введении в организм пациента в мозг также попадает лишь его малая часть в результате того, что пептид не способен преодолеть гематоэнцефалический барьер. Это ведет к усложнению и удорожанию лечения как для самого пациента, так и для медицинского учреждения. В связи с этим актуальной проблемой является разработка новых лекарственных форм для повышения эффективности доставки уже известных и применяемых в терапии субстанций.
Выбор способа доставки белковых и пептидных препаратов определяется в первую
очередь предполагаемым путем их введения. Физико-химические свойства некоторых систем
доставок часто ограничивают проникновение препарата через физиологические барьеры.
При разработке системы доставки необходимо помнить, что использование входящих в нее
чужеродных молекул способно оказать дополнительное токсическое действие и вызвать
целый ряд побочных эффектов. Идеальным решением проблемы биосовместимости является
разработка систем доставки защищающих (например, с помощью экранирующей оболочки)
здоровые клетки организма от препарата в процессе его доставки и использование в качестве
таких защитных оболочек молекул, состоящих из природных или биосовместимых
мономеров максимально приближенных по структурным и функциональным
характеристикам к организму пациента.
Актуальность данной работы обусловлена необходимостью разработки систем доставки, обладающих достаточной биосовместимостью, снижающих контакт действующего вещества с организмом в процессе адресной доставки, имеющих способность преодолевать
биологические барьеры, а также позволяющих контролировать процесс высвобождения препарата.
В работе исследованы системы доставки на основе кальций-карбонатных ядер и оболочек, состоящих из большого числа чередующихся слоев, образованных различными противоположно заряженными полиэлектролитами и впервые предложены способы уменьшения разрушения доставляемых белков за счет введения в формируемые капсулы молекул ингибиторов.
В работе былa впервые исследована возможность применения комплексов на основе разветвленных полиэлектролитов (дендримеров и дендриграфтов) для связывания молекул ноотропных пептидов. Полученные или аналогичные комплексы доставки лекарственных препаратов могут быть использованы в будущем не только для лечения инсультов и серьезных черепно-мозговых травм, но также в терапии нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваний и различных форм рака.
Степень разработанности
Теоретической и методологической основой исследования являются работы зарубежных и отечественных групп ученых в области разработки и исследования физико-химических свойств систем доставки для белков и пептидов. Созданием систем инкапсулирования и доставки белков и пептидов, а также исследованием их физико-химических свойств занимается большое количество различных групп ученых, наиболее известными из которых являются группы по руководством М. Roberts, М. Bently, D. Harris, S. Hamad, V. Torchillin, и др. Особый вклад в конструирование полимерных микро- и нано-капсул внесли такие зарубежные и отечественные ученые, как R. Costa, F. Caruzo, B. de Gist, H. Mhwald, G. Sukhorukov, M. Antipova и др. Одним из новых направлений доставки лекарственных пептидов является их доставка с помощью нового класса разветвленных полимерных молекул - дендримеров. Синтез и ислледование свойств дендримеров различной химической структуры проводился в работах Vgtle, Tomalia, Newkome, Frechet, J.P.Tam и др. Систематическое моделирование дендримеров проводилось в работах Н.К. Балабаева, М.А.Мазо, И.М.Неелова, А.Даринского, А.Люлина, С.Люлина и др. Однако моделирование комплексов дендримеров с терапевтическими пептидами практически не проводилось. Проведение такого моделирования является одной из задач данной работы.
Цели и задачи
Целью исследования является разработка систем доставки для терапевтических белков и пептидов на основе натуральных биодеградируемых и синтетических биосовместимых полиэлектролитов и исследование их физико-химических свойств. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- разработать систему доставки, состоящую из ядра и оболочки, позволяющую
удерживать модельные белки и защищать их от воздействия разрушающих
биологических сред желудочно-кишечного тракта;
исследовать условия, влияющие на то, какое количество действующего вещества будет адсорбироваться на ядре;
исследовать кинетику высвобождения модельных объектов из системы доставки при условиях, имитирующих условия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ);
продемонстрировать возможность клеточного захвата полученных систем доставки;
разработать компьютерную модель взаимодействия лизинового дендримера и пептидов (Семакс, Эпиталон),
исследовать процесс образования пептидного комплекса, его равновесную структуру и процесс высвобождение действующего вещества при изменении внешних условий.
Научная новизна
Научная новизна исследования состоит в разработке новых систем доставки лекарственных белков и пептидов, обладающих необходимой биосовместимостью, контролируемостью высвобождения препарата, и исследовании их физико-химических и биологических свойств.
Для полимерных микрокапсул впервые предложена и разработана технология
ферментативного управления проницаемости оболочки путем включения в
полиэлектролитные слои белковых молекул и введения ингибиторов ферментов.
Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения полимерных нано- и микрокапсул, могут быть использованы при создании систем доставки различных лекарственных веществ.
Впервые экспериментально смоделирован захват полимерных микрокапсул
мезенхимальными стволовыми клетками.
Впервые методом компьютерного моделирования для пептидов Семакс и Эпиталон рассчитаны комплексы с лизиновыми дендримерами разных поколений, охарактеризована их структура и определены условия их существования.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость работы состоит в расширении и углубление подходов, используемых в химических, фармацевтических и технических науках для разработки новых систем доставки белков и пептидов в организм пациентов, а также в систематическом исследовании физико-химических и биологических свойств этих систем.
Разработка новых более эффективных форм лекарственных препаратов и средств их доставки является приоритетным направлением развития науки Российской Федерации.
Практическая значимость работы определяется тем, что разработанные технологии могут в будущем быть внедрены в клиническую практику и применяться в ходе производства различных лекарственных форм на основе микро- и макрокапсул.
Положения, выносимые на защиту
-
Влияние времени и скорости перемешивания растворов, соотношение концентраций используемых солей и введение в их состав органических растворителей на размеры формируемых ядер.
-
Исследование методик включение модельных белков в микрокапсулы: соосаждения и диффузии этих белков в поры.
-
Влияние вязкости полимеров при формировании оболочки на ядрах как на степень агрегации полученных капсул, так и на скорость высвобождения из них белков в среды, имитирующие ЖКТ.
-
Зависимость высвобождения модельных пептидов и белков из микрокапсул от молекулярной массы полиэлектролитных молекул оболочки.
-
Влияние введения в оболочку микрокапсул из бычьего сывороточного альбумина и дубильной кислоты овомукоида на скорость их разрушение в среде, содержащей трипсин.
-
Исследование процессов комплексообразования дендримеров 2-5 поколений с терапевтическими пептидами Семакс и Эпиталон.
-
Исследование стабильности комплексов лизиновых дендримеров с пептидами.
-
В полученных дендример-пептидных комплексах дендример находится внутри в то время, как большая часть пептидов – на поверхности комплекса.
-
Исследование условий высвобождения модельных пептидов из дендримеров.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов обеспечивается применением совокупности
взаимодополняющих физико–химических методов исследования (конфокальной
микроскопии, энерго-дисперсионной рентгеновской спектрометрии, сканирующей
электронной микроскопии, спектрофотометрии, флуориметрии), хорошей
воспроизводимостью результатов, а также внутренней непротиворечивостью полученных данных и согласием с результатами других авторов, работающих в данной области исследований.
Основные положения диссертационной работы докладывались на 6-й конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», в Санкт-Петербурге 18-21 октября 2010 года (стендовый доклад); 7-й конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», в Санкт-Петербурге с 17-20 октября 2011 года (секционный и
стендовый доклады); 8-й конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», в Санкт-Петербурге (стендовый доклад); 9-й конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», в Санкт-Петербурге (стендовый доклад); международном симпозиуме «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems», в Санкт-Петербурге с 6-10 июня 2011 года (стендовый доклад); международном симпозиуме «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems», в Санкт-Петербурге с 2-6 июня 2014 года (стендовый доклад); международной конференции “6th International "Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications " workshop”, в Саратове с 18-24 мая 2015 года (устный доклад); на «IX международный симпозиум памяти Р. Горбачевой «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. Генная и клеточная терапия», в Сочи 18-20 сентября 2015 года; на International conference on nanomedicine and nanobiotechnology ICONAN 2016, в Париже с 28-30 сентября 2016 года (стендовый доклад); на 3rd International Conference on Mathematics and Computers in Sciences and Industry MCSI 2016, на Крите 27-29 августа 2016 года (приглашенный доклад); на 5th International Symposium on Biomedical Applications of Dendrimers, 2016, в Копенгагине; на XXIV Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование», 23-28 января 2017, в Дубне; на International Conference on Biochemistry and Molecular Biology – ICBMB 2017, 3-5 апреля 2017, в Мюнхене (стендовый доклад), на «Mathematical Methods and Computational Techniques in Science and Engineering», 24-26 февраля 2017, в Кембридже (приглашенный доклад), на 9-м Международном симпозиуме «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» MMOPS2017, 19-23 июня 2017, в Санкт-Петербурге; на 3-м Междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической, биологической химии и фармацевтике МОБИ-ХимФарма2017, 28-31 мая 2017, в Севастополе; на International Conference on Control, Artificial Intelligence, Robotics and Optimization ICCAIRO 2017, 20-22 мая 2017 (приглашенный доклад), в Праге; на 4th International Conference on Mathematics and Computers in Sciences and Industry, 24-26 августа 2017, Корфу (приглашенный доклад).
Список работ, опубликованных автором по материалам диссертации
По результатам работы опубликовано 33 научных работы, в том числе 6 в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 глава в книге «Dendrimers» и 19 тезисов международных и российских конференций. По результатам работы оформлена заявка на патент.
Полимеры, используемые для создания различных систем доставки
Описывая различные методики создания систем доставки для белковых и пептидных препаратов пролонгированного действия, особое внимание уделим компонентам, из которых эти системы состоят. Поскольку целевые препараты предполагаются к применению в медицинских целях, к методикам, структуре и свойствам новых материалов должны быть предъявлены определенные требования:
1. Методика не должна навредить активности и целостности структуры целевого объекта.
2. Материалы должны быть биосовместимыми, биодеградируемыми и одобренными соответствующим органом РФ.
3. Методика должна быть технологичной, экологичной и экономичной.
В статье [4] была дана критическая оценка наиболее распространенных полимеров, применяемых в большинстве системах доставки. Известно, что все полимеры, применяемые в медицинских целях, должны удовлетворять ряду условий. В частности, необходимо, чтобы полимер был биосовместимым и биодеградируемым, т.е. разлагался в организме, кроме того, продукты, образующиеся при его разложении, не должны быть токсичными. Далее в обзоре приведен список наиболее распространенных и разрешенных FDA полимеров для систем доставки.
Для формирования капсулы каждый полимер подбирается индивидуально в зависимости от их классификации и соответствующих химических, физических и биологических свойств. По происхождению полимеры делятся на синтетические, природные, частично синтетические (производные целлюлозы) и химически модифицированные природные.
Природные полимеры – первоочередной выбор для медицинских целей благодаря их широкому распространению в природе (соответственно, их дешевизне) и биосовместимости.
К одним из полиэлетролитов, образующих пленки, можно отнести дубильную кислоту. Впервые таннин (он же дубильная кислота) стал известен в 1797 году благодаря Дейе и Сегену. Но несмотря на это они не были изучены даже к началу ХХ века. В настоящее время танин достаточно хорошо изучен и широко применяется в косметологии, пищевой промышленности, кожной выделке. Ввиду широкому кругу его распространения в природе (кора и листья молодого дуба), дубильная кислота не очень дефицитный или дорогой полиэлектролит. Однако полученный конечный продукт имеет ряд примесей. Поэтому в 1950 году, был получен синтетический танин. Синтетический танин, проявляя все свойства натуральных дубильных кислот, имеют целый ряд преимуществ – возможно его получение в чистом виде, удобной консистенции, при полностью контролируемом на всех стадиях процессе получения.
Дубильные кислоты – полифенольные соединения, аморфные, содержащие большое число гидроксильных групп, благодаря которым они способны образовывать прочные связи с белками, сложными углеводами и различными природными полимерами.
В медицинских целях используется исключительно синтетический танин. Показания к его применению весьма обширны: воспаление ротовой полости, гортани или дсен; ожоги, язвы, трещины сосков, некроз мягких тканей; интоксикации алкалоидами (кроме морфия, кокаина, атропина, никотина, эзерина салицилата, которые с танином образуют связи, разрушаемые под воздействием желудочного сока); как противоядия (при интоксикации солями свинца, ртути и других тяжлых металлов); в качестве противодиарейного средства; в целях улучшения свртываемости крови; различные дерматологические вирусные инфекции (экземы, экзантемы, герпетические инфекции, ветрянка, папулзный акродерматит); лечение хирургических ран в урологии, проктологии и гинекологии; заживление ожогов первой степени и трещин заднего прохода; детские кожные заболевания. Кроме того, дубильные кислоты тормозят потерю организмом аскорбиновой кислоты и улучшают е усвоение.
Взаимодействия различных белков с полифенолами (в частности с дубильной кислотой) еще мало изучены. Однако интерес к комплексам полифенол – белок растет с каждым годом.
Дубильная кислота представляет собой полифенольное соединение с большим числом гидроксильных групп. С помощью этих групп, он способен образовывать прочные связи с белками, сложными углеводами и различными полимерами. Комплексы, образующиеся между белками и дубильной кислотой, могут быть как растворимые, так и нерастворимые. Оптимальные условия (рН) для образования нерастворимых комплексов между дубильной кислотой и белком являются те, которые происходят вблизи изоэлектрической точки (pI) белка. В большинстве исследований чаще всего используется бычий сывороточный альбумин [5]. Это связано с тем, что БСА имеет структурное сходство с человеческим альбумином. Таким образом, можно предположить, что бычий сывороточный альбумин (pI = 5,7) способен образовывать комплекс с дубильной кислотой даже в воде.
Танин-белковые комплексы обычно образуются за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Это рН зависимый процесс, потому что группа фенольных гидроксильных выступает в качестве донора водородных связей. Таким образом, в сильно щелочной рН (рН 10) связывание с белками дубильные кислоты не происходит.
Гиалуроновая кислота (рисунок 1.2) – анионный линейный гетеросахарид животного происхождения, относящийся к глюкозаминогликанам, состоящий из повторяющихся дисахаридов (N-ацетил-D-глюкозамин и D-глюкуроновая кислота) и входящий в состав соединительной ткани [6]. Оба эти углеводных остатка соответствуют -форме молекулы глюкозы. Функциональные и структурные свойства гиалуроновой кислоты зависят во многом от ее упаковки в пространстве. Данный полимер является природным гелеобразователем. Отличается свойством в малых концентрациях образовывать высоковязкие водные растворы, а при высоких концентрациях образовывать псевдогели. Известна также своими бактерицидными, регенерирующими и ранозаживляющими свойствами [7]. Гидроксильные, карбоксильные и ацетамидные группы наделяют гиалуроновую кислоту гидрофильными свойствами. Кроме того, гиалуроновая кислота за счет полярных и неполярных фрагментов в структуре способна взаимодействовать с различными низко- и высокомолекулярными положительно заряженными соединениями [8]. Для молекулы характерно большое количество водородных связей, формирующихся как внутри молекулы (между соседними углеводными остатками), так и между различными соседними молекулами. В среде с кислым значением pH, образуется нерастворимый комплекс. В нейтральном растворе молекула отрицательно заряжена (pH = 3-4 карбоксильной группы).
Гиалуроновая кислота хорошо зарекомендовала себя для формирования систем доставки [9, 10]. Благодаря сетчатой структуре в растворе, гиалуроновая кислота способна с одной стороны обеспечить свободную диффузию небольших молекул (вода, электролиты), а с другой стороны способна задерживать молекулы с большого размера (например, белки). Определяющее влияние на формирование и свойства сетки оказывает концентрация и молекулярная масса исходного полимера.
В работе [9] был представлен гидрогель из гиалуроновой кислоты в комплексе с Pluronic F-127. Соотношение компонент, входящих в состав гидрогеля варьировалось. Полученные комплексы при комнатной температуре имели жидкую консистенцию (что позволяло вводить его через шприц) и формировали гель при температуре организма человека. Авторы исследовали химические, реологические и оптические свойства гидрогеля. Также были подробно рассмотрены вопросы биосовместимостимости и биодеградируемости полученного гидрогеля.
Внутренняя микроструктура лиофильно высушенных гидрогелей HA/PF-127 была исследована авторами методом сканирующей электронной микроскопии. Полученные гидрогели имели как взаимосвязанную пористую структуру, так и сеть нерегулярных пор, размер которых варьировался от нескольких микрон до 100 мкм. Поры в гидрогеле, как правило, образуются за счет сублимации воды внутри комплексов. В работе также было показано, что за 7 дней гиалуроновая кислота деградирует на 20%. Однако, модификация гиалуроновой кислоты позволяет снизить скорость деградации под действием ферментов и внешних физических воздействий.
Формирование микро- и нано- ватеритов CaCO3
Цель данного этапа работы - разработать технологию получения карбонатных ядер, стабильных по размеру и морфологии.
В качестве основы для получения частиц карбоната кальция использовали реакцию:
СаС12 + Na2C02 = 2NaCl + CaC02 і (5)
Известны три модификации коллоидных частиц СаС03: ватерит (сферическя форма, гексагональная кристаллическая решетка), кальцит (кубическая форма, ромбоэдрическая кристаллическая решетка) и арагонит (иглообразная форма, орторомбическая кристаллическая решетка).
Карбонатные частицы проходят три стадии формирования - стадия образования зародыша, стадия его роста и стадия созревания частицы. На начальной стадии формируется осадок (зародыш) в виде наночастиц размером менее 100 нм. В дальнейшем эти аморфные зародыши начинают упорядоченно присоединяться друг к другу и приводят к формированию смеси CaCOз различных размеров. При варьировании интенсивности перемешивания растворов солей СаС12 и Na2C03 зародыши карбоната кальция также сближаются друг с другом на расстояния, при которых становятся существенными силы Ван-дер-Ваальса, что в случае одинаковой кристаллографической ориентации, ведет к их слиянию и росту карбонатных частиц. Ватериты формируются также в результате совокупности кристаллического роста и сращивания крупных частиц, происходящих одновременно. Было также показано, что кальциты, сталкиваясь с частицами ватерита в растворе, способны срастаться друг с другом.
Из трех модификаций были выбраны ватериты (рисунок 3.1), поскольку они имеют высокую растворимость по сравнению с кальцитом и арагонитом, высокодисперсную пористую структуру, высокую удельную плотность поверхности. В свою очередь ватериты имеют две основные структуры частиц: фрамбоиды и сферолиты. Частицы обоих типов имеют сферическую форму. Основное их различие заключается в упаковке наноразмерных зерен, из которых они построены. Для сферолитов характерно радиально-лучистое внутреннее строение (рисунок 3.1.в). Оно обусловлено радиальной особенностью роста.
Для того, чтобы получить частицы карбоната кальция, различных форм, некоторые параметры процесса их синтеза необходимо скорректировать: время и интенсивность перемешивания растворов, способы сушки ядер, наличие/отсутствие этиленгликоля в исходных растворах (СаСl2 и Na2CO3), изменение температуры.
В работе сравнивали влияние различных способов сушки на морфологию и размеры ядер (рисунок 3.2). По окончании формирования и промывки водой ядра сушили четырьмя различными способами: сушили из воды в термостате при Т = 70 0C (рисунок 3.2.а); промывали 100 % ацетоном сушили в термостате при Т = 40 0C (рисунок 3.2.в); промывали смесью ацетона с водой при увеличивающейся концентрации ацетона (33 %, 50 %, 100 %), а затем сушили либо в термостате при Т = 40 0C (рисунок 3.2.с), либо из замороженного состояния лиофильно (рисунок 3.2.d). Зависимость вида полученных ядер от способа сушки детектировали с помощью СЭМ [76-79].
Медленная сушка из воды ядер–ватеритов (обладающих, наименьшей термодинамической стабильностью их трех полиморфных модификаций) в термостате при 70 С может приводить к их переходу в кальцит или арагонит (рисунок 3.2.а).
Сушка в жестких условиях - замена воды 100 % ацетоном приводит к образованию в некоторых ядрах каверн (рисунок 3.2.в). СЭМ фотографии ядер, полученных в более мягких условиях сушки, а именно: при градиентной промывке ацетоном (рисунок 3.2.с и 3.2.d) показывают, что ядра кристаллизуются в виде ватеритов [76-78]. Во всех последующих экспериментах ядра сушили в термостате при Т = 40 C после градиентной промывки ацетоном.
В ходе работы варьировали время и интенсивность перемешивания растворов при формировании ядер и оценивали влияние этих факторов на их размеры и полидисперсность. Данные подвергались статистической обработке и сопровождались фотографиями сканирующей электронной микроскопии (рисунок 3.3). Аналогичные данные были получены и в случае изменения времени перемешивания растворов [76-78, 80-83].
При этом зависимость среднего размера и дисперсии размера ватеритов от времени и скорости перемешивания меняются следующим образом: вначале резко падают, а затем изменения становятся менее значительным (рисунок 3.4).
Кроме того, было показано, что с увеличением времени и интенсивности перемешивания увеличивается вероятность образования других модификаций карбоната кальция.
На основании полученных данных, были выбраны оптимальные условия формирования карбонатных ядер, имеющих минимальный разброс по размерам, а именно: интенсивность перемешивания 600 – 960 об/мин, время перемешивания 20 – 40 с.
Уменьшение размеров CaCO3 может быть достигнуто путем варьирования состава смесей, участвующих в реакции, например, с помощью этиленгликоля (ЭГ) и воды. Присутствие этиленгликоля в реакционных растворах позволяет снизить растворимость карбоната кальция. Время формирования ядер соответственно менялось от нескольких минут до нескольких часов.
Увеличение времени перемешивания растворов с добавлением ЭГ с 30 секунд (базовая методика для формирования микронных ядер, описанная в Главе 2) до 30 минут привело к образованию ядер размера порядка 2 мкм (рисунок 3.5.а). При увеличении времени перемешивания до 2 часов, размер частиц удалось снизить в среднем до 1 мкм (рисунок 3.5.б), а при увеличении времени перемешивания до 4 часов средний размер составил 600-800 нм (рисунок 3.5.в).
Размеры получаемых ядер определяли при помощи аналитической системы Malvern Archimedes в воде (рисунок 3.6). Поверхностный заряд ядер был положительный и равен 4.55 мВ. перемешивания (красная)
Изменение формы ядра происходило, при нарушении соотношения концентрации солей (исходное соотношение солей 1:1). Было показано, например, что увеличение количества хлорида кальция (1 М) по отношению к карбонату натрия (0.33 М), вызывает рост ядер эллиптической формы (рисунок 3.7).
Анализ полученных результатов позволил сделать следующие выводы: варьируя условия синтеза карбонатных ядер, можно получить сферические ядра диаметром от 0,6 до 16 m с узким распределением по размерам.
Исследование кинетики образования комплекса дендриграфтом 2-ого поколения с пептидом Семакс
Дендриграфт, как и дендример относится к классу разветвленных полимеров. В данной работе в качестве системы доставки пептидов Семакс был выбран лизиновый дендриграфт 2-ого поколения. Молекулярная масса такого дендриграфта равна 7008 Да.
В процессе моделирования делались мгновенные снимки системы, состоящей из дендриграфта, пептидов, ионов и воды, которые приведены на рисунке 4.1 (молекулы воды для ясности на этих рисунках не показаны). Из рисунков хорошо видно, что в начале расчета (рисунок 4.1. а, г, ж) молекулы пептидов находятся далеко от дендриграфта. Через 20 нс (рисунок 4.1. б, д, з) часть молекул пептидов уже находятся на поверхности дендриграфта, а в конце расчета (рисунок 4.1. в, е, и) все молекулы во всех трех исследованных системах находятся на его поверхности.
Макромолекулы в результате теплого движения или любых иных внешних воздействий могут принимать большое число разнообразных конформаций. В качестве мгновенной характеристики размера комплексов в таком случае обычно используется средний (по всем атомам подсистемы, состоящей из дендримера и пептидов) квадрат радиуса инерции Rg2.
Зависимость изменения радиуса инерции от времени в начале расчета характеризует кинетику образования комплекса. Из полученных на рисунке 4.2 зависимостей видно, что в начале расчета размеры всех подсистем, состоящих из дендриграфта и пептидов велики, так как пептиды находятся далеко от поверхности дендриграфта. Это согласуется с большими расстояниями от дендримера до пептидов на мгновенных снимках систем на рисунках 4.1.а, 4.1.г, 4.1.ж. С течением времени радиус инерции подсистем дендример-пептиды на рисунке 4.2 начинают быстро убывать и спустя некоторое время размеры этих подсистем выходят на плато. Комплексы дендриграфта 2-ого поколения с 8 молекулами пептида формируются в течение примерно 40 нс. В случае формирования комплексов с 8 и 16 пептидами наблюдаются небольшие флуктуации при 50 нс (комплекс с 8 пептидами) и 70 нс (комплекс с 16 пептидами). Затем их средние значения практически не меняются со временем. После 80 нс можно считать, что все системы находятся в равновесном состоянии и комплекс сформирован.
Другой величиной, которая может характеризовать установление равновесия и образование комплексов, является общее число водородных связей (N) между дендриграфтом и пептидами. Оно показывает, как изменяется со временем число контактов между ними (рисунок 4.3). Данная функция была посчитана при помощи функции g_hbonds пакета GROMACS.
Как видно из рисунка 4.3 в начале расчета число водородных связей между дендримером и пептидами равно нулю, поскольку пептиды находятся далеко от дендримера и поэтому не могут иметь с ним никаких контактов. Первая система (DG2 и 8 Семакс) достигает равновесия (выход на плато) уже через 40 нс. Вторая система достигает равновесия через 30 нс, а третья – через 60 нс, что хорошо согласуется как с изменениями расстояний от дендримера до пептидов на мгновенных снимках подсистем, состоящих из дендримера и пептидов на рисунке 4.1, так и с результатами временных зависимостей установления равновесия по радиусам инерции, полученными на Рис. 3. Число водородных связей между дендриграфтом и пептидами показывает, насколько плотно пептиды связаны с ним. Из рисунка 4.3 следует, что число водородных связей в равновесном состоянии (при t 40 нс) для первого комплекса равно примерно 25, для второго (при t 30 нс) – примерно 35, а для третьего (при t 60 нс) – около 52. Поскольку, пептидов во втором и третьем комплексах вдвое и трое больше, можно было ожидать, что число водородных связей также будет вдвое и трое больше. Однако, их соотношение равно 1,4 и 2,1, из чего можно сделать вывод о том, что пептиды во втором и третьем комплексах связаны с дендриграфтом несколько слабее, чем в первом. Функции распределения по числу водородных связей (рис. 4.4) показывают, насколько число водородных связей в данной системе может флуктуировать относительно среднего значения. Полученные функции для комплексов дендриграфта 2-ого поколения имеют пиковые значения при числах связей, близких к средним (25, 35 и 52 соответственно) и являются симметричными. Флуктуации числа водородных связей могут происходить в первом случае в интервале 13-40 связей, во втором в интервале – 20-45 связей, а в третьем в интервале– 35-70 связей
В равновесном состоянии размеры Rg первого комплекса DG2 и 8 Семакс несколько больше (в 1,05 раз), чем размеры самого дендриграфта, а размеры двух других комплексов (DG2 и 16 Семакс, DG2 и 24 Семакс) несколько больше, чем размеры первого комплекса – в 1,16 и 1,22, соответственно (см. Таблицу 14). Этот результат является вполне естественным, поскольку он коррелирует с увеличением молекулярной массы комплексов дендриграфт-пептиды при увеличении в них числа пептидов по сравнению с молекулярной массой отдельного дендриграфта. Форма комплексов может быть охарактеризована, соотношениями главных компонент их тензоров инерции (Rg11, Rg22, Rg33), которые приведены в Таблице 14. В простейшем случае, анизотропия может характеризоваться отношением наибольшей и наименьшей компонент Rg33 / Rg11.
Информация о внутренней структуре равновесного комплекса может быть получена на основании функций радиального распределения плотности числа атомов относительно центра масс как для самого комплекса, так и для его отдельных компонент (рисунок 4.5):
Полученные данные свидетельствуют о том, что большая часть атомов дендриграфта (кривая 2, рисунок 4.5) находится в центре комплексов, а атомы пептидов (кривая 1, рисунок 4.5) распределены более равномерно по объему дендриграфта, в среднем находятся ближе к его поверхности и мало проникают в самый центр комплекса [102, 103]. Другой характеристикой числа контактов между дендриграфтом и пептидами в комплексе является распределение числа ионных пар между ними. На рисунке 4.6 приведена зависимость числа ионных пар от расстояния между дендримерами и пептидом для обоих комплексов.
Из графиков распределения видно, что во всех случаях имеется острый пик, отвечающий непосредственному контакту положительно заряженных групп NH3+ дендриграфтов и карбоксильных групп глютаминовой кислоты пептида. В случае комплексов дендриграфта с 8 и 16 пептидами (кривая 1, рисунок 4.6.а и рисунок 4.6.б) выше, чем в случае комплекса с 24 пептидами (кривая 1, рисунок 4.6.в). Полученные зависимости позволяют сделать вывод о том, что наиболее плотный контакт заряженных групп с дендриграфтом происходит в случае с 8 и 16 пептидами. В то же время во всех случаях контакт зарядов дендриграфта с контрионами (кривые 2, рисунок 4.6.а, рисунок 4.6.б и рисунок 4.6.в) существенно меньше, что позволяет сделать вывод о том, что система доставки в первую очередь взаимодействует с пептидами и лишь небольшая часть зарядов взаимодействует с контрионами.
В ходе моделирования было получено, что электростатические взаимодействия - основной вид взаимодействий, отвечающий за формирование комплексов. Для того, чтобы оценить поступательную подвижность полученных комплексов, для них были вычислены временные зависимости среднеквадратичных смещений центров инерции (рисунок 4.7). Данная функция была рассчитана при помощи функции g_msd пакета GROMACS.
Зависимости среднеквадратичных смещений центров инерции от времени для трех комплексов оказались близки к линейным в интервале равном 5 нс. Это говорит нам о наличии диффузионного режима в этом интервале времени. По наклону полученных зависимостей были определены коэффициенты поступательной диффузии комплексов и его компонент (см. Таблицу 15).
Влияние поколения дендримера на кинетику образования комплекса с пептидом
Целью данного исследования было выявить, существуют ли различия в кинетике образования и равновесной структуре комплексов, образованных дендримерами разными поколениями с одинаковым числом молекул пептида Семакс.
Для этого были выбраны системы, состоящие из дендримеров 3-ого, 4-ого и 5-ого поколений и 16 молекул пептида Семакс (см. Таблица 16).
Зависимости изменения радиуса инерции для систем дендримеров различного поколения (G = 3-5) и 16 молекул пептидов от времени представлены на рисунке 4.12. Показано, что комплексы дендримера 3-его поколения и 4-ого поколения с 16 молекулами Семакс формируются в течение примерно 30 нс. При этом наблюдаются в интервале 40 нс небольшие флуктуации, связанные, скорее всего, с процессами перераспределениями положений пептидов в комплексах. В случае формирования комплекса с дендримером 5-ого поколения и 16 пептидами комплекс формировался при 40 нс. Можно сделать вывод о том, что поколение дендримеров не оказывает существенного влияния на скорость образования комплексов.
В случае комплекса G3 и 24 пептидов, наблюдалось появление флуктуаций после 80 нс. Нестабильность комплекса может объясняться слишком большим число молекул пептида на молекулу дендримера, что приводит к неплотному связыванию некоторых пептидов и, соответственно, большим флуктуациям размеров комплекса. При формировании комплексов с дендримерами больших молекулярных масс (G4 и G5) с аналогичным числом пептидов подобных явлений обнаружено не было. Это можно объяснить наличием существенно большего числа положительно заряженных групп у дендримеров 4го и 5го поколений (64 и 128, соответственно) и, следовательно, более сильным электростатическим взаимодействием дендримеров и пептидов в последних двух комплексах [107-112].
Из рисунка 4.13 следует, что число водородных связей в равновесном состоянии (при t 30 нс) для первого комплекса равно примерно 38, для второго (при t 30 нс) – примерно 40, а для третьего (при t 40 нс) – около 50. Поскольку, размеры дендримеров во втором и третьем комплексах больше, то логично ожидать, что число водородных связей также будет увеличиваться с увеличением поколения.
В равновесном состоянии размеры Rg комплекса G3 и 16 Семакс несколько больше (в 1,15 раз), чем размеры самого дендримера. Размеры двух других комплексов (G4 и 16 Семакс, G5 и 16 Семакс) несколько больше, чем размеры дендримеров G4 и G5 в 1,24 и 1,05 соответственно (cv. Таблицу 17). Этот результат является вполне естественным, поскольку он коррелирует с увеличением молекулярной массы комплексов по сравнению с молекулярной массой отдельного дендриграфта. Размер третьего комплекса при этом в 1,47 раз больше, чем размеры первого комплекса и в 1,1 раз больше, чем размеры второго комплекса. Таблица 17 - Собственные значения тензоров инерции цепей Rg11, Rg22, Rg33 для
Полученные данные свидетельствуют о том, что, как и во всех остальных случаях, дендример (кривая 2, рисунок 4.14) находится в центре комплексов, а пептиды (кривая 1, рисунок 4.14) ближе к поверхности и лишь частично проникают внутрь дендриграфта. При этом проникновение пептидов в центр комплекса уменьшается с ростом числа поколений в дендримере (рисунки 4.14.а, 4.14.б, 4.14.в).
Из графиков распределения ионных пар (не представлены) было получено, что во всех случаях имеется острый пик, отвечающий непосредственному контакту положительно заряженных NH3+ групп дендримеров и карбоксильных групп глютаминовой кислоты пептида. Во всех случаях контакт дендримера с контрионами существенно меньше, что позволяет сделать вывод о том, что система доставки в первую очередь взаимодействует с пептидами и лишь небольшая часть зарядов взаимодействует с контрионами.
Исследование зависимостей среднеквадратичных смещений центров инерции от времени для трех комплексов оказались близки к линейным в интервале равном 5 нс (графики не представлены). Это говорит нам о наличии диффузионного режима в этом интервале времени. По наклону полученных зависимостей были определены коэффициенты поступательной диффузии комплексов и его компонент (см. Таблицу 18). Коэффициенты диффузии оказались близкими для всех трех рассмотренных систем.