Пероксидазная активность железо (III) морфиринов и гемнонапептида в системах обращенных мицелл Саркисян, Асмик Размиковна

Введение к работе

Актуальность проблемы. В последние годы бкокатализаторы поучают все более широкое внедрение в практику. Однш ;:з способов их изучения является.моделирование. В качество модели гем-юдеркащих белков и ферментов,широко исследуется феррипротонор-ирин IX (геыин). Изучение шделыюп системы позволяет глубяе юнять механизм действия биологических катализаторов. Ловыиен-1ЫЙ іштерес многих ксследозателеіі к гемлшу и другим кіеталлопор-іиршам обусловлен также способностью этих катализаторов лрово-деть с высокими скоростями и селективностью практически важные жислительнс-зосстановительнк" процессы.

В этом отноаепии особый интерес вызывают мєталлопорЬіриньї, іключешше в мицо'лли ( особенно обращенные - Ql\) .полученные в .' ірисутствіш поверхностно-активных веществ I'lIAB). Интерес к этюл іистемам, в частности, объясняется тем, что согласно результатам физико-химических исследований микроокружение веществ в ло-ирном ядро мицелл по ряду физических-параметров ( полярность, (Иэлектркчоская проницаемость .вязкость структура водного окру-сения, распределение поверхностных зарядов ) сходно с таковыми в )бласти локализации лростетической группы внутрі молекулы фер-іента. Зто указывает на то , что ОМ могут быть относительно іростой и удобной физической моделью фєрлентов.Важюі'і эсобен-юстьв систем ОМ является то, .что'физические свойства мккроок-зуяения веществ, расположенных'внутри полярного ядра., ношо лег-to менять,варьируя либо количе'ст'во вкутркшщелдяркой воды, либо Юбавляя к ней различные вещества.

Системы^:Ш й%йікроз'мульсіііі представляют интерес"не только
уія фундак^нтальных исследований, но и для прикладных целей. Ис-
70ЛьзоЗші;;є"зТйх систем существенно расширяет возмодаюсти лрак-
игаескй^лрйленёния'высокоактивных ,'селективных , природных
*аталк?а?6ров в^биотехнологии , тонкоморганическом синтезе и_
їругих^яб^артях'практической деятельности человека. Кроме,того',
ложно полагать-,что 'структурно, организованные системы получат
распространение,при разработке различных, практически важных
Зиомимётйчёских'¹ процессов'. ''_,. ' _;

Целью ":рабо'ты являлось 'исследование-влияния, мицоллярярго,минре-

: . . ' .'.'і .t*.'-^4l-".v*4.--'..-"^< -> і , , _v ,

' ' '.'; . :_;,;(ї"і-'-' ' ^s ' ..'-. ./-."-.

- 2 ~

окружения на пероксидазную активность железо-порфиринового ком
плекса, гемнонапептида и некоторых их комплексов с низкомолеку-
лярными лигандами. ,.''.-]

Практическое значение работы. Полученные кинетические резулі таты могут быть использованы для управления некоторыми процессами , протекающими в ОМ системах (ферментативные реакции, поли-меризационные процессы и т.д.)с

Научная новизна. Показано, что в зависимости от природы микроокружения (микросреды) и типа эмульгатора, лроисходят структу] ^:ше изменения во включенных в них веществах. Именно эти структурные изменения предопределяют реакционную способность суб -стрг^ов и каталитическую активность взятых нами систем, т.е. путь и скорость реакции.

Публикации.По теме диссертации опубликованы 3 работы.

Содержание и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания эксперимента, изложения результатов и их обсуждения, вь.«юдов и списка цитируемой литературы 96 названий. Работа представлена на 116 страницах машинописного текста и-включает 43 таблицы и.36 рисунков. '

Методическая часть. Нами использованы: гемин (Г) фирмы " Xoc&Z«ig*»t (Англия), тетраеульфофенил порфирин (ТСЗЇЇ) лю-.' безно предоставленный АЛЛ.Хенкиным (отделение КШ АН СССР, Черноголовка) и гемнодапептид (ГНП)^ полученный триптолизом цитохро-ма С из сердца лошади, любезно предоставленный Кулишом М.А. (МИТХТ). ПАВ: додецилсульфат натрия (ДЦС) и бромистый цетилтри-метиламмоний (ЦГАБ) фирмы "Seiva" (Германия), аэрозоль ОТ (АОТ) фирмы "МетД" (Германия). 3 работе были использованы также о-ди-анизидин марки "х ", очищенный возгонкой в вакууме, WADH(Неот1\ 76%-ныЯ раствор пероксида водорода (ПВ) (ос.ч.), имидазол фирмы " Seiva" (Германия), Органические растворители: хлороформ, октан, гептан, гексанол, используемые для приготовления ОМ, применяли после очистки двойной перегонкой. Степень очистки проверяли по величине некоторых физико-химических величин. Буфер-нке растворы готовили на бидистиллированной воде с использованием дважды перекристаллизованных солей ( МаН_гР0« Н_гО , UaW0₄ ttHjO). Пероксидааная активность Г, ГНП и ТСШ опреде-

лялась по начальной скорости окисления о-дианизидина или NAffi на. спектрофотометре Specoto/ UV VIS (Германия)» Кинетика быстрых реакций измерялась методом остановленного потока на установке фирмы " Duixurti* (США). Скорость реакции-определяли измеряя изменение оптической плотности во. врем^.ш_эс использованием коэффициента экстинкции продукта реакции g^gQ=3xI0 М" см" для о-дианизидина (по накоплению продукта окисления о-дианизидина) и 6з40⁼^^^ ^см~ ^рля ^А&Н ^^п0 убнли f/ADH). Электронные спектры поглощения и реакции комплекеообразования Г и ГНП с низкомолекулярными лигандами в мицеллярных системах регистрировали на спектрофотометрах Specoto/ (JV VIS и М-40 (Германия). Спектры кругового дихроизма ГНП регистрировали на дихрографе фирмы "МсиД IIIS " (Зовіп Jvott ", Франция). Спектры кругового дихроизма регистрировали в единицах оптической плотности,-

. Кинетика окисления органических субстратов , пероксидом водорода (ПВ) в водных раствора:' железо (І1!) порфиринов

Нами изучена пероксидазная активность железо (Ш) порфиринов на примере окисления о-дианизидина и МАГМ. Конечным продуктом окисления, о-дианизидина ПВ является бис (3,3- диметокси-- 4 амино) азобифенил, который образуется при конденсации двух молекул -1,4-диаыино - 3,3-диметокси бифзнилена (ex» I):

\ = л/Н *±

- 4 -.осм.

н,со.

,«Нз

Спектр поглощения конечного продукта характеризуется максимумом при -А =4и0іш с 6^-0=3x10 УГ см" . За реакцией окисления о-дканизидина следили по накоплению продукта при -Л =46-нм."

Конечным продуктом пероксидазной реакции с участием WADH является WAD (ex. 2 ). Кинетику окисления ЦАВН-регистрировали по убыли концентрации субстрата.на длине волны А » =340нм ( 3-q=62C0Kcm ). Нами было установлено, что в водных растворах ПВ наблюдается необратимое уменьшение интенсивнозти спектра поглощения используемых в работе железо (Ш) порфиринов, обусловленное;согласно . литературным данным, окислительной деструкцией порфиринового макроцикла. Поэтому,при-анализе кинетических данных использовали начальную скорость реакции ( VG ).

л/н»

_"VS/

C-c-NH_t

он он Никотинамидадешндинуклеотид (НАД)

Н Н- ' н

. І \\ і _{+ Н}-0-0-н#% II І І І 2Н₂0

' І

R R

NRDH NflD

В изученном диапазоне концентраций ІІВ (до 100 мм) V₄ окис
ленім о-диаяпзвдина и NADH_?катализируемых Г-ом, пропорциональна
концентрации ПВ. При концентрации о-дианирчдияа и МАШ вше
10" М скорость реакции практически не зависит от количества
их содержания в реакционной смеси» При концентрациях Г ниже
5 МКІ.І Ve реакции пролорциональна его концентрации,, Таким обра
зом, при достаточно низких концентрациях Г и ГЯ,кинетика перок-
спдазной реакции Г в воде приблизительно описнвается следующим
выражением: '

%^i_m СШ:_вСПВ3₀ О)

Из данных, представленных в таблице 1>следует, что с ростом рН величина R_nfr± в фосфатном буфере увеличивается. При -рН -^7,0 ч~х& слабо'зависит от природы субстрата и строения порФиркновогб"макроцикла' катализатора» Различия пероксидазных реакций, катализируемы Г и ТСФП^увеличивается :;ри понижении рН. Указанное закономерности объясняются, с одной стороны, стаби-лизирупккм влиянием р.Ч на промежуточно образующийся тройной комплекс Г-.ГЗ- S, с другой - состоянием Г в реакционной зоне і ре обладание рзакнпошшсяособной мономерной формы или малоактивного д::мерг). Замена- о-доанизидина ЭДАШ-ом приводит к значительно;.?/ увеличению скорости реаіяцш (табл.І).

Таким образом,получешпіе данные показывав, .^что кшіетика процесса зависит от строения катлтпзатора и субстрата,а такие от степени устойчивости тройного промежуточного комплекса Г-ПБ-&

Таблица I Значения &_э*д в 5хЮ"^М фосфатном буфере в зависимости от рН,. при 1=29 и [ПВ 3(,=4,5x10-%

о-дианизидин

о-дианизидин

Мицеллярные системы ЦТАБ

Установлено, что при СПАВ3 =(2,5^10^10^--1 и LKail = =(2,25i-9)xI0-⁴M-¹ как в водных растворах, так и в ОМ системах. V₀ пероксидазной реакции может быть приблизительно описана yj -нением (3)" . При C5]_a=I0 мкМ до I мМ У'*$\ t5J₀). Для оценш. константы скорости в мицеллярной фазе ( & у) использовг ли общепринятое выражение (4).

"Расхождения между значениями констант скоростей не превышают 8-1055. ' ' .

где v - мольный объем ОМ, 1.1 - полная концентрация мицелл»

В этой серій работ наші изучена зависимость <„ от содержания внутрмммцелляриой воды, т.е. от отношения С 1^0J/CIIA3J = =П, а в реакциях с WADH , катализируемых Г-ом - от СЦТАБ]₀„ '

Установлено, что при pti-7,2
I ) с увеличением а от 4, до 25 ( при [ЦТАБ] =5x10"^ М ) й ,
ртленьшается от 0,45 до 0,25, а $_м увеличивается от 0,18 до*
3,56 М^сек"¹. -

I) при увеличении СЦТАБ]₀ от 2,5x10"^ до 20_ХЮ"² м(п=15) $^ уменьшается от 63,3 до 11,1 , a iL увеличивается от 4,2 до" 3 ,0 ЬГ сек" .

, Подобно реакциям с участием Г, «_э(т_х^ ою, слету о-дианизи-
дина в присутствии ТССП в 01.1 ЦТА5 слабо "зависит от содержания
воды к с ростом концентрации ПАВ ( в этих экспериментах л=10
поддерживалось постоянным ) скорость этой реакцій: уменьшается,,
Следует отметить, что величина $-«, реакции с участием ТСФа
сильнее зависит от концентрации ПАВ, чем п^Ш Р⁶²¹¹^^{1111 с} Учас
тием Т„

Более слабое ингибпрущее действие, но сравнении с Г, оказывают мицеллы катионяого ПАЗ на каталитическую активность ТСФП прічєм мицеллярнкй эффект ослабляется с ростом а „

Влияние ОМ на кинетішу перокевдазяой реакции заметно зависит от строения железогирфирпяового комплекса» Константа ско = рости перокевдаэной реакции с участием Г в ОМ ЦТАБ,лри рН*7,2_; близко.соответствующей константе в водной фазе.

В случае іОФП,лрі! рН=7_в2, константа скорости реакции окисления с—динккзидока,прп переходе от водного раствора к шцел-яярноіі системе ЦТАБдвеличивается до 50' раз»

И в этом случае наблюдаемые, кинетические закономерности изучаемых пероксидазных реакцій могут быть оборонены в рамках представлений об образовании, тройного комплекса ИВ - Kai-S» что показана на схеме: " ; . *.

. При условии EgCS» К_~и при t~*0 из ( 5 ) получается ( 3). В рамках этого получаем,, что V₀ окисления субстрата не зависит от его концентрации и прямо пропорциональна концентрация!.! Г и ПВ, Согласно уравнению{3),V_Q процесса не зависит от его природу.

Согласно.данным спектральных измерений в слабогидратиро-
ванных мицеллах ( рис.1 (а и б)) молекулы Г имеют измененную
структуру с железом {III}, координированным двумя молекулами
вода. Такая форма Г в водных растворах реализуется лри.рН<5,6
и обладает пониженной цероксидазной активностью. В мицеллах
с высоким содержанием вода, константа скорости дероксидазной
реакции составляет 0,54 If сек ₈ что значительно меньше ,
чем в водной фазе несмотря на то„ что в этих условиях спектр
поглощения солюбилизованного Г практически совпадает с сост-
. ветствующим спектром в водном растворе-. Можно полагать , что,
значительный вклад, в ингибирующее действие мицелл на рассмат
риваемую реакцию оказывает пониженная доступность Г, локализо
ванного в монослое ПАВ₈для молекул ПВ, С этим выводом согла
суются результаты кинетических исследований по влиянию ОМ ЦТАБ
на каталитическую активность более гидрофобного ТСФП. Констан
та скорости окисления о-дианизидина ПВ, катализируемого ТСФП
в мицеллярннх системах ЦТАБ,'с низкой степенью а равна 1,5 М~х
Х.сек^-^ и'возрастает до 9,0 ГГ сек дрип.=20,приблияаясь к .
значению соответствующей константе в водной фазе, равной
10,7 JT-^ceR"¹, . .;\

В таблице 2 приведены значения констант скоростей в зависимости от рН в водных и мицеллярннх системах ЦТАБ. ,

В водных растворах константа скорости реакции NADH с ПВ, катализируемой Г, увеличивается от 2,8 до 70 ЬГ^сек ,при изме нении рН от 3,0 до 8,0. В мицеллярном растворе ЦТАБ соответств юи;ая константа уменьшается лишь в малой степени (табл.2) ,что может быть интерпретирована стабилизирующим влиянием мицелляр-

28 гб гч кК . гъ ъв ш і& кк

(а)

Рис. I (а и б) Зависимость спектров поглощения Г от «г в 0ІЛ ЦТАБ в области Соре |а)ив видимой ' .области (б) I-а» 2,2 2 = 20с,

ного шкроокрунекия на тройной комплекс Г - ПВ —S » не только при нейтральных \ как это шеет место в водном растворе J ,> но и при значениях рН< 7_Р0„

В мииедлярянх системах с ростом рН среда активность ТСШІ резко уменьшается,, в то время „ как в воде такая зависимость

Таблица 2

.мицеллы

каталитической активности этого комплекса илеет обратный характер» ТоО, в определенных условиях, мицеллы могут оказывать силі нов активирующее влияние на каталитические свойства ТОМ, что объясняется влиянием щщелляряого" микроокруиения на структуру катализатора. ТОФП, который -реализуется в-.ОМ лри низких значені рН и обладает высокой, пероксидазной активностью, в спектрах характеризуется максимумами 394, 526, 567, 606 и 680 км.

Кинетические особенности пероксидазных реакцийі катализируемух железо (Ш) порфиринами,в мицеллах анионных ПАВ

Известно, что такие анионные ПАВ,.как аэрозоль ОТ (АОТ) и додецилсульфат натрия (ДЦС) образуют ОМ в неполярных раствори-, телях. К сожалению, используемые нами железопорфирино.вые комплексы мало растворимы в мицеллярных системах ДОТ, поэтому все кинетические исследования нами были вьятолнены. в ОМ,образуемых системой гептан-гексанол-ДЦС. Здесь' также кинетика пероксидазной реакции описывается уравнением (3). ^.₃(Мі скорости окисле-

- II -

иия NAtffi в мицеллах анионного IIAB, катализируемого Г, примерно на порядок выше, чей в ккцеллах катионного ЦТАБ и в коде. Золкчк-на ft зд практически не зависит от а к от С11АЫ в диапазоне от 2,ёхКГ" до 2x10 М„ Эти закономерности сохраняются для пе-роксидазяого окисления о-дианкзвдина, катализируемого Г, т.о величина я _т^ реакции практически не зависит от содержания воды и лишь слегка умкьшается с ростом [ПАВЗ . Но отношение -f;_n._f.._t,

СКОРОСТИ ОКПСЛЄНИЯ В МПЦеЛЛЯрЛОЙ СГ.СТеї.'.е К СООТВйТСТВу!.)!!ІЄІІ KOI'C-

танте в водной фазе составляет приблизительно 4,5-5, в то врогш: как дая о-днанизидина это соотношение не превышает 1,6 раза. Таким образом, можно утверждать, что'влияние мицелл па кинетику лероксидазной реакции зависит от лрірода S ," т. о проявляется своеобразная' субстратная еяецнулгчность , характерная для ферментативных реакция. Субстратную специфичность мкцеллярякх систем можно объяснить, как изменением локализации комплекса Г - S внутри мицеллярного агрегата, так и различным влиянием мицал-лярного шікроокружения на кинетические параметры распада ко;.:л-лекса Г- EgО.^ -$, если место раслолокения комплекса h-j н:з.-,-няется.

С ростом С IIAB] ₀ от. 2,5x1с"² до 20x10^-2 Ж t_y . возрастает .примерно'В 5 раз ( для о-диадкзидина и ШШ , катализируемые Г), что объясняется гетерогенностью самых мицелл.

Мицеллы анионного ПАЗ оказывают значительно более сильное влияние на пероксидазную реакции о-дканизидина катализируемого ТСФЛ , по сравнению с Г . В мицеллах с низким содержанием вода! п= 8) 8 окисления о-дианизидина составляет приблизительно 4ХІ0"⁴ Ї.1 ^сек"¹ , в то время , как в' воде Ящр ^ІС>^{7 І/Г} х хсек . Изменение fi от 8 до 30 сопровождается почти сороко-кратным увеличением «₃jvf.« Несмотря па наличие четырех от:~' ;i-тельно заряяеняых сульфатных групп в молекуле ТСФП нель:.. V.K-лючпть возможность локализации молекулы катализатора в зоне , близкой к поверхности мицеллы из-за наличия достаточно гидрофобного лорфирннового макроцикла . Очевидно , что с ростом содержания внутришцеллярной воды , часть катализатора будет перераспределяться в более полярное водное ядро. О влиянии мицелляр-ного микроокрукения на электронную структуру ТСФП свидетельству-

- 12 -ют данные оптическое і;з:.:еренга'і ( рис .2 (а и б)) , причем величина элймкта зависит от а .

0.2-

(а)

яК

18 (б)

кК

Рис. 2. Спектру поглощения ТСОП в -.'ицеллярных епстег.йх ДЦС в зависимости от а в области Соре (а) і: а ыдашой областе {б) ( ГДДС3₀ = 5x1 СГ² М,СТСФП3₀= =5x10" Ы, ?Н=7.2 , Т=2Э5К, ,1-П*7,6; 2-п=30

На основе наложенного можно заключить, что низкая каталитических активность ТСФП в мицеллах анионного ПАВ обусловлена его отношением к одинаково зараженным г.-.олекулам ДДС.

Другая возможная 'причина уменьшения скорости пероксадазкой реакции з мицеллах ДДС.связана с неоднородным распределением pea гентов в мицеллах. В лринциле возможна такая ситуация,, когда гздрофобнн!і субстрат локализуется з поверхностном слое 1MB , в то время как молекулы отрицательно заряженного катализатора концентрируются в водном ядре. Такое' перераспределение реагентов внутри мицелл такке может лрпзести к заметному замедлению ле-рокевдазной реакции.* Наконец, трудно исключить действие дшцал-лярного ыккроокружения на "_нест -тройного комплекса ТСФП-П&-<3 „

- ІЗ -

Влияние рН на кинетику пероксидазной реакции

в ОМ ДДС . . _

. В мицеллярных системах анионного ПАВ рН зависимость каталитической активности железопорфиринов сушестветю зависит от

их строения.(Таблица 3) '

Таблица 3

(М^сек"¹)

Г, о-д-н

ТС, о-д-н .

Константы скорости окисления NADH и о-д-н, катализируемого Г, практически не зависят от рН в диапазоне 2,6 до 7,2 и возрастают в 2 раза при повышении рН до.9,0. Напротив, при изменении рН от 2,4 jxo 7,2 каталитическая активность ТС<Ш в ми-целлярной системе уменьшается почти з 300 раз и практически нз изменяется при дальнейшем повышении рН. Высокую активность ТС в системах ОМ можно объяснить ослаблением взаимодействия ПАВ с катализатором.при низких значениях рН.

Пероксидазная активность гемнонапептида (ГНП) в ОМ

Влияние систем ОМ на спектральные свойства ГНП .....

Низкую пероксицазную активность железо (Ш) порфирина в ОМ можно было бы объяснить, во-первых, отсутствием гистидина в координированной сфере железа и, во-вторьк, специфическим вли-

- - к -

яшем белкового окружения на его активность (пероксидаза более актигні'Л, '« мелєзо (1L) nopft;pviH_j у которого пятым к шестик аксиальные лигандами являдтся молекулы гистидина и воды). Для того, итобм сг;он::ть степень влияния этих факторов, нами выполнены аналогичные исследования на микропероксидазе IX (ГНП),

Б настоящей работе было изучено влияние обращенных мицелл на спектри поглощения и кругового дихроизма (Щ) микроперокси-дагы IX.

ііа рисунках За и Зб приведены спектры поглощения ГНП в вс чых растворах при различных знаменита рН.

d\ /V^-s V565

S35\\\№jii₇

:/6

20 . /

23 kJK ^ «

a*.

Рис.

(s и б). Спектры поглощения солрбилизеванного '

ГНП б ffocfaTHow буфере при различных зна- : vch/.ях рН,в области Соре, (а), и в. видимой области ( Сф.б. 1 =5x1 (гМ, [ ГНП "] =Зх1(Г⁵М, ,Т=2Э5К, А-рН=9,0, Б-рК=7,2, В-рН=2,4)

При кислотно-основном титровании ГНП, в его спектрах отсутствуют изобисгические точки. 'Это означает, что в изученном диапазоне рН существует, по крайней мере, три контрмера (А,Бп В) с соответствующими характерными спектральными поглощениями. . В сг'ектре А ионы железо (1Л) находятся в-'низкоспиновом состоянии

- 15 -в спектре В - в высокослшовом состоянии { на это указывает наличие максимума при 617нм), a d спектре Б - наряду с низко-спиновым находятся и иону железо (13) в енсокоспиновом состояний (максимум при 625 гал). Результати, полученное :СД-ом показали, что мгаделлярное микроокружение может оказывать влияние на кон-формационное состояние ТШ. и на константы его димеризации,причем величина эффекта зависит ov природы ПАВ, от концентрации ГКП и степени гидратации мицелл.