Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. О механизме биокоррозии и веществах биогенной природы, 8 стимулирующих коррозию металлов бактериями
1.2. Соли тетразолия. Свойства, применение 27
2. Экспериментальная часть 47
2.1. Используемые приборы 47
2.2. Объекты и материалы исследования 48
2.3. Методика проведения кинетических исследований 52
2.4. Определение химического состава экссудата, выделяющегося на поверхности металла
2.5. Методика проведения электрохимических испытаний 58
3. Результаты и их обсуждение 59
3.1. Кинетика восстановления иоднитротетразолия хлорида суспензией клеток бактерий
3.2. Продукты биотрансформации кислорода, воздействующие на поверхность цинка
Выводы 91
Литература 93
- Соли тетразолия. Свойства, применение
- Объекты и материалы исследования
- Определение химического состава экссудата, выделяющегося на поверхности металла
- Продукты биотрансформации кислорода, воздействующие на поверхность цинка
Введение к работе
Актуальность темы. Многочисленные биолого-химические исследования, проведенные во второй половине прошлого столетия, показали, что коррозия металлов под действием микроорганизмов представляет самостоятельный вид деструкции металлических изделий с присущими ему специфическими закономерностями.
В настоящее время установлено, что биокоррозия происходит опосредованно при воздействии на металл веществ – деструкторов, которые образуются при жизнедеятельности микроорганизмов. Природа некоторых из них и механизм их образования надежно доказаны: тиобактерии продуцируют серную кислоту, нитрозо- и нитробактерии окисляют ион аммония NH4+ до азотистой, а азотистою – до азотной кислоты, отдельные штаммы ацидофильных бактерий способны биотрансформировать неорганические соединения серы до серной кислоты.
В природе широко распространены аэробные биодеструкторы – бактерии и микроскопические грибы. Несмотря на многочисленные исследования, главные стадии и в целом механизм коррозии металлов при воздействии аэробов остаются неизвестными. Ряд исследователей придерживается мнения, что основную роль в аэробной биокоррозии могут играть продукты биотрансформции кислорода компонентами электронотранспортной системы микроорганизмов, в частности, супероксидный анион и продукт его диспропорционирования – пероксид водорода.
Известно, что в качестве индикаторов, характеризующих восстановительную способность клеток к биотрансформации кислорода, широко используются соли тетразолия и, в частности, 2-(4-иодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенил-2H-тетразолия хлорид (иоднитротетразолия хлорид, ИНТ).
Целью диссертационной работы явилось определение кинетических параметров восстановления иоднитротетразолия хлорида суспензией бактериальных клеток в физиологическом растворе для оценки способности микроорганизмов к биотрансформации кислорода в соединения, вызывающие
коррозионные изменения поверхности металлов (цинка, оцинкованной стали, низкоуглеродистой стали Ст3).
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
экспериментальное определение скорости накопления продукта восстановления ИНТ – иодформазана (ИФ) – грамположительными (Bacillus subtilis, Сlostridium spp.) и грамотрицательными (Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Proteus vulgaris) бактериями*;
определение кинетических характеристик (порядка реакции, эффективной константы скорости, энергии активации) восстановления ИНТ суспензией бактериальных клеток, оценка метаболической активности исследуемого ряда бактерий;
выявление условий жизнедеятельности и вида бактерий при биотрансформации кислорода, определяемой по накоплению пероксида водорода в экссудате на поверхности цинка, анализ экссудата на содержание NH3 и значение pH в динамике;
установление взаимосвязи между кинетической активностью бактерий по отношению к ИНТ и их способностью к образованию и выделению перо-ксида водорода в околоклеточную среду;
оценка коррозионной активности бактерий, воздействующих на металлы, в благоприятных условиях жизнедеятельности.
Научная новизна работы:
- Впервые установлено, что восстановление иоднитротетразолия хлорида
суспензией бактерий в физиологическом растворе подчиняется кинетическим
уравнениям реакции первого и нулевого порядков.
- Показано, что по значениям начальных скоростей восстановительная
способность бактерий увеличивается в ряду: Bacillus subtilis > Сlostridium spp. >
* Классификация бактерий на грамположительные и грамотрицательные основывается на строении клеточной стенки и зависимой от этого способности бактерий окрашиваться после их обработки по методике, разработанной Грамом.
> Pseudomonas aeruginosa > Escherichia coli > Pseudomonas fluorescens >
> Proteus vulgaris.
- Выявлено, что количество пероксида водорода в экссудате на поверхности цинка зависит от способности бактерий восстанавливать ИНТ: в условиях, оптимальных для жизнедеятельности бактерий, обладающих высокой восстановительной способностью по отношению к ИНТ, пероксид водорода продуцируется в меньшем количестве, чем с использованием питательной среды без источника азота (глюкозо-минеральная среда); в условиях, оптимальных для жизнедеятельности бактерий, обладающих низкой восстановительной способностью к ИНТ, пероксид водорода образуется в большем количестве, чем при использовании глюкозо-минеральной среды.
Практическая значимость работы состоит в выявлении зависимости образования бактериями и выделения в околоклеточную среду пероксида водорода как продукта биотрансформации кислорода клетками бактерий и скоростью восстановления ИНТ. Выявленная закономерность может быть использована как критерий оценки коррозионной активности бактерий с учетом условий их жизнедеятельности.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Кинетические параметры восстановления ИНТ суспензией бактерий
Bacillus subtilis, Сlostridium spp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
fluorescens, Escherichia coli, Proteus vulgaris.
-
Кинетика накопления пероксида водорода в экссудате на поверхности цинка в зависимости от условий культивирования и вида бактерий.
-
Зависимость между скоростью восстановления ИНТ и динамикой накопления пероксида водорода в экссудате на поверхности цинка.
4. Биокоррозия цинка, низкоуглеродистой стали и оцинкованной стали
под воздействием бактерии Escherichia coli на ранних стадиях экспозиции
(3 – 5 суток).
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на XI и XII Международной молодежной научно-технической конференции «Будущее технической науки» (Нижний Новгород, 2012, 2013 гг.).
Диссертация выполнена при поддержке государственного контракта с Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.», проект №14190 «Разработка методик и практических рекомендаций для защиты металлов от воздействия микроорганизмов».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых научных журналах, в числе которых 3 статьи в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ.
Личный вклад автора. Автор непосредственно проводил весь комплекс экспериментальной работы, осуществлял статистическую и математическую обработку результатов, принимал участие в обсуждении полученных результатов и подготовке к публикации научных статей. Аналитические методики определения иодформазана, H2O2 отработаны и адаптированы к условиям биологического эксперимента совместно с к.х.н. Калининой А.А. Электрохимический метод исследования коррозионной активности бактерий разработан совместно с к.т.н. Исаевым В.В. и аспирантом Москвичевым А.А. Микроструктурные исследования поверхности осуществляли в Институте проблем машиностроения РАН (г. Нижний Новгород).
Структура и объем диссертации:
Соли тетразолия. Свойства, применение
Проблема коррозионного повреждения металлов при их использовании во влажных и / или водных средах имеет место во многих отраслях промышленности, оборонной и социальной средах, где используются металлы, изделия и конструкции на их основе. По оценкам прямые и косвенные убытки от биокоррозии по всему миру составляют 1,8 триллиона долларов в год (3-4% от валового внутреннего продукта промышленно развитых стран) [19].
Первые сообщения о стимулирующей роли микроорганизмов в развитии коррозии металлов появились около 80 лет назад и касались воздействия на металл сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) особенно в средах добычи, переработки нефти и хранения нефтепродуктов [2, 20]. Немалую роль в создании нового направления в коррозионных исследованиях сыграли проблемы эксплуатации военной техники и оборудования в условиях теплого и влажного климата, когда скорость разрушения металлов превышала ожидаемую на несколько порядков (103104) [21, 22].
К середине прошлого столетия сформировалось понятие биокоррозии, или более строго, микробиологически индуцированной коррозии (МИК), которую определяют как ухудшение свойств металла, вызванное наличием и деятельностью микроорганизмов [10]. Исторический экскурс в становление и развитие этого научного направления сделан в ряде обзорных работ [10, 23-26], в которых также описано современное состояние и последние достижения в области МИК.
Следует отметить, что ранние исследования МИК были связаны с контролем числа бактериальных клеток и их активностью в планктонном состоянии [27]. Однако, как правило, корреляции между количеством микроорганизмов и степенью коррозии металлов не наблюдалось [26]. На основании этих многочисленных исследований был сделан исторически важный вывод, что МИК – это поверхностный процесс и ключевое значение имеет численность и активность микроорганизмов на поверхности металла, а не в объемной фазе [28].
С конца 1970-х годов начались серьезные исследования так называемых биопленок на поверхности различных материалов, в том числе металлов [29, 30], а так же в различных средах, например, в морской воде [4, 31-35], нефтепродуктах [3, 4, 36].
Биопленка – это скопление способных к воспроизведению, метаболически активных клеток, связанных с твердым субстратом, встроенных в сложную матрицу, называемую внеклеточными полимерными веществами (ВПВ). Матрица состоит в основном из органических макромолекул, содержащих полисахариды, белки, липиды и нуклеиновые кислоты. ВПВ обеспечивают механическую прочность биопленки, выступают посредником в адгезии к поверхности и образуют связанную трехмерную полимерную сетку, которая соединяет и временно «обездвиживает» клетки биопленки. Кроме клеток и ВПВ, биопленки могут содержать значительное количество абиотических частиц, например, ил, камни, песок и минералы.
Общепринято, что биопленки составляют отдельную фазу роста бактерий, которая заметно отличается от планктонной формы. Биопленка – это не просто скопление клеток на поверхности, по сравнению с планктонной популяцией, она представляет собой принципиально иное состояние микробного роста [37-40]. Формирование биопленки начинается, когда микроорганизмы необратимо присоединяются к поверхности материала (рис. 1.1). Прикрепление клеток инициируется экспрессией специфичных генов, которые кодируют белки, катализирующие синтез межклеточных сигнальных молекул и инициирующих образование матрицы из ВПВ, тем самым прикрепленные клетки физиологически заметно отличаются от планктонных. Кроме того, микроорганизмы биопленки проявляют генетическую гетерогенность не только между членами разных видов, но и среди клеток, принадлежащих к той же популяции. При исследовании участия в МИК спорообразующих бактерий рода Bacillus было обнаружено, что при инициации спорообразования они выделяют внеклеточные вещества, которые разрушают неспорообразующие клетки. Содержимое разрушенных клеток используется в качестве питательных веществ "каннибальными" клетками [41, 42].
Рост прикрепленных микроорганизмов приводит к генерации общей гетерогенной архитектуры биопленки, содержащей пустоты, каналы и поры (рис. 1.1 и 1.2) [43-46]. Развитие биопленки является непрерывным, динамичным и очень сложным процессом, зависящим от ряда факторов, таких как тип микроорганизма, поверхность, на которой происходит прикрепление, условий окружающей среды и экспрессии соответствующих генов [47].
Объекты и материалы исследования
Заместители при N1, N5 и С3 соответствуют заместителям при N2, N3 и C5 в солях тетразолия, т. е. они являются ароматическими или гетероциклическими на N1 и / или N5 и более вариативны по С3. В целом, структура формазанов является довольно сложной [93-95, 97-99]. Две двойные связи в молекуле формазана (C = N, син-анти и N = N, цис-транс) являются причиной его способности существовать в четырех (или более) стереоизомерных формах [100]. Структуру прежде всего определяет природа (размер и полярность) С3-заместителя. Другие факторы также влияют на структуру формазана: заместители при N1,2, природа растворителя, температура, свет. Например, значение энергии водородных связей указывает на то, что фенильное кольцо в положении C5 вносит значительный вклад в стабилизацию водородных связей [101].
Общепризнанным является факт, что в растворах 1,3,5 триарилформазаны существуют в двух формах [93-95, 98-101]. Условно их назвали «красной» (хелатной) и желтой (открытой) (хотя в последующих исследованиях указывается, что в растворе может существовать еще одна форма, характерная для кристалла – «оранжевая»): «красные» формазаны (хелатная форма) «желтые» формазаны (открытая форма) Именно переходами между этими формами объясняется, например, явление красно-желтой фотохромии 1,3,5-триарилформазанов. За редкими исключениями все используемые в биохимических исследованиях формазаны окрашены в красный цвет. Их структура характеризуется наличием сильной внутримолекулярной водородной связи (NjH N5), вследствие чего образуется шестичленный хелат с плоской структурой. Предложены две структуры (V) и (VI), но при этом в ранних работах отмечалось о невозможности выделения индивидуальных изомеров красных формазанов [102]. Таким образом, красные формазаны могут рассматриваться как резонансный гибрид, стабилизируемый мезомерным эффектом, т. е. существует в качестве «квазиароматического» шестичленного кольца [98, 101]:
В противоположность этому «открытые» желтые формазаны существуют как истинные изомеры [103]. Однако более поздние результаты показали, что красные триарильные формазаны тоже могут существовать в таутомерном состоянии [94, 100, 104]. Таутомерные формы имеют очень короткое время жизни (10 3 до 10"13 сек). Положение таутомерного равновесия зависит от электроноакцепторной способности заместителей, расположенных в фенильных группах при Ni и / или N5. С электроноакцепторной группой (например, нитро-группой) равновесие смещается в сторону таутомера, где атом водорода связан с атомом азота, который несет эту акцепторную группу [104]. Электроноакцепторные группы заместителя (например, п-нитрофенил) при Ni и / или N5 будут снижать прочность водородной связи до такой степени, что станет возможным раскрытие хелатного цикла. Для 1-арил-5-гетарилформазанов наряду с протонным равновесием характерна и амино-иминная (формазан-формазеновая таутомерия) с участием атома азота азагетероциклических заместителей [101]:
Условию растворимости, как правило, удовлетворяет очень широкий круг солей тетразолия, также как и условию их бесцветности или, в очень редких случаях, крайне слабой окраске. Поэтому при выборе соли тетразолия для конкретных исследований эти факторы не рассматривают [98].
Под субстантивностью солей тетразолия имеется в виду их быстрое, но неспецифическое и почти необратимое присоединение к компонентам клеток, тканей (белки, липопротеины, нуклеиновые кислоты и т.д.) [95]. Степень субстантивности зависит от ряда факторов: от структуры соли, ее концентрации и значения рН раствора, от наличия высокомолекулярных соединений. Соли тетразолия наиболее субстантивны по отношению к липопротеинам и липопротеин-содержащим структурам, в меньшей степени к белкам, липидам и макромолекулам, таким как целлюлоза и ее производные [105, 106]. Установлено, что сродство солей тетразолия к клетке вызвано слабыми электростатическими силами [105], за счет взаимодействия катиона тетразолия с отрицательно заряженными группами белков [107], а также Ван-дер Ваальсовыми взаимодействиями [108]. Экстракция липидов или фосфолипидов уменьшает субстантивность солей тетразолия, но предварительная фиксация или повреждение мембраны клетки, вызванное замораживанием, размораживанием и т.д., увеличивает это свойство [105]. Однако для нитрозамещенных монотетразолиев этот фактор не играет большой роли, даже если они обладают низкой субстантивностью [109].
Субстантивность формазанов прежде всего можно объяснить, как способность взаимодействия нейтральных формазанов с различными компонентами клетки, особенно белками [105]. Основа формазановой субстантивности – их гидрофобные свойства [108].
Способность солей тетразолия к восстановлению до формазанов – ключевое свойство их использования.
Восстановление солей тетразолия протекает ступенчато[98, 110]. После принятия одного электрона образуется нейтральный свободный радикал – тетразолинил: Его структура была установлена ЭПР-исследованиями [110]. Стабильность тетразолинила увеличивается мезомерным эффектом п-заместителей в N-фенильном кольце. Тетразолинил является интермедиатом между солью тетразолия и формазаном [110].
Такая же схема справедлива для получения диформазанов, сначала формируется моно-тетразолинил, а затем - ди-тетразолинил [98, 110]. Тетразолинил имеет характерное поглощение (600-700 нм) в видимой области спектра. Он может реагировать сам с собой: одна молекула окисляется, в то время как вторая молекула восстанавливается (диспропорционирование) (2 TS соль тетразолия + формазан).
Применение солей дитетразолия приводит к образованию нескольких продуктов реакции. Во время каждого биохимического или химического восстановления дитетразолиевой соли образуется довольно стабильный основной промежуточный продукт: один остаток (фрагмент) тетразолия остается неизменным, а другой восстанавливается до формазана. Часто, этот тип промежуточного продукта называется полуформазаном [111]. Полуформазан также может диспропорционировать до соли тетразолия и формазана. Все это приводит к довольно сложной схеме восстановления солей дитетразолия [99]:
Определение химического состава экссудата, выделяющегося на поверхности металла
Если в случае Bacillus subtilis и Сlostridium spp. примерно через час экспозиции конверсия восстановления ИНТ составляет более 80%, то под воздействием бактерий Proteus vulgaris степень конверсии в течение всего эксперимента не превышала 20%. Ввиду низкой скорости восстановления ИНТ бактериями Proteus vulgaris константа скорости, равная (2,46±0,25).10-5 с-1 (t = 37C), определена дифференцированием участка кинетической кривой по известному в теории кинетически химических реакций методу (см., например [131]), исходя из предположения, что реакция подчиняется закономерностям простой реакции первого порядка).
Восстановление соли тетразолия бактериями Pseudomonas aeruginosa происходит более сложно. Кинетическая кривая накопления продукта имеет S-образный вид с точкой перегиба (рис. 3.7), что, вероятно, говорит о том, что реакция протекает как автокаталитическая.
Кроме того, кинетические закономерности процесса под воздействием бактерии Pseudomonas fluorescens определялись как по убыли реагента, так и по накоплению продукта (рис. 3.10). В обоих случаях были получены сопоставимые значения константы скорости реакции (3,76.10-9 моль.л-1.с-1 и 3,84.10-9 моль.л-1.с-1 соответственно) при оптимальной для жизнедеятельности бактерий Pseudomonas fluorescens температуре, равной 29С.
Полученные данные показывают, что порядки изученных реакций зависят от природы бактерий, поэтому для характеристики восстановительной способности микроорганизмов по отношению к иоднитротетразолия хлориду использовались не константы скоростей, а начальные скорости реакций при одной и той же концентрации ИНТ и оптимальной для жизнедеятельности бактерий температуре (табл. 3.4). Как следует из данных, представленных в табл. 3.4, по восстановительной активности исследуемые бактерии можно расположить в ряд: Bacillus subtilis Сlostridium spp. Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Proteus vulgaris.
Положение бактерии Pseudomonas aeruginosa в исследуемом ряду определялось по скорости на участке кинетической кривой после индукционного периода (рис. 3.7).
Кинетические кривые восстановления соли тетразолия под воздействием бактерии Pseudomonas fluorescens: 1 – по убыли реагента; 2 – по накоплению продукта
В целом различие в скоростях восстановления ИНТ клеточными структурами бактерий относительно велико. Так, бактерия Bacillus subtilis, обладающая наибольшей активностью, превышает по этому показателю наименее активную бактерию Proteus vulgaris более чем в 20 раз. Для некоторых бактерий исследовано влияние температуры на скорость восстановления ИНТ. В диапазоне температур, оптимальных для жизнедеятельности Bacillus subtilis, скорость процесса не зависит от температуры (табл. 3.5, рис. 3.11). Аналогичная закономерность найдена для бактерии Proteus vulgaris (табл. 3.5, рис. 3.12). В отличие от этого восстановление ИНТ клеточными структурами Pseudomonas fluorescens и Escherichia coli протекает с энергией активации, хотя ее значение невелико и составляет соответственно 61,6 и 58,5 кДж/моль (табл. 3.5, рис. 3.13, 3.14).
Полученные кинетические данные, прежде всего параметры уравнения Аррениуса, дают основание считать, что восстановление ИНТ клетками бактерий протекает следующим образом. Соль иоднитротетразолия хлорида из объемной фазы раствора транспортируется через клеточную стенку бактерий. Как известно из принципов жизнедеятельности бактерий, клеточная стенка как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий не является барьером для транспорта низкомолекулярных соединений, каким является ИНТ. Проходя через периплазматическое пространство между клеточной стенкой и плазмалеммой клетки, ИНТ физисорбируется на плазмалемме и медленно диффундирует в границах липидной плазматической мембраны к участкам, где находятся доноры электронов – ферментные системы, промежуточные переносчики электронов, О2-. Такое представление процесса согласуется, например, с выводами работы [132]. Вероятно, что доноры электронов по своей природе должны быть радикальными частицами – флавиновый радикал кофермента сукцинатдегидрогеназы, семихиноны, О2-. Вследствие этого химическая реакция ИНТ с донором электронов должна протекать чрезвычайно быстро, а места локализации этих частиц можно рассматривать как некие адсорбционные центры в жидкокристаллической плазмалемме. Таким образом, стадией, лимитирующей восстановление ИНТ суспензией бактерий, является диффузия реагента к активным (адсорбционным) центрам, где непосредственно и происходит восстановление. О диффузионно-контролируемом характере процесса свидетельствует, прежде всего, чрезвычайно низкое значение предэкспоненциального множителя уравнения Аррениуса (таблица 3.5).
Продукты биотрансформации кислорода, воздействующие на поверхность цинка
При использовании глюкозо-минеральной среды аммиак в экссудате не обнаруживается.
Поскольку, как отмечалось, транспорт электронов в мембране клетки сопряжен с побочным образованием продуктов биотрансформации О2, то должна быть зависимость между скоростью восстановления ИНТ и количеством Н2О2 в экссудате на поверхности цинка, заселяемой бактериями. С этих позиций вполне объяснимы полученные результаты о влиянии состава питательной среды на концентрацию Н2О2 в экссудате. При экспозиции цинка на МПА под воздействием Bacillus subtilis и Сlostridium spp. пероксида водорода почти в 2 раза меньше, чем при использовании глюкозо-минеральной среды. Очевидно, что при высокой эффективности электронного транспорта и наличии достаточного количества питательных веществ для биосинтеза белка и других клеточных компонентов энергетические потребности клетки сбалансированы с синтетической активностью клеток и разобщения электронного транспорта, сопряженного с образованием активных метаболитов кислорода, не происходит. При использовании глюкозо-минеральной питательной среды недостаток азота лимитирует синтетическую активность бактерий, вследствие чего при активном расщеплении глюкозы происходит разобщение электронного транспорта с биосинтезом АТФ, потребности в котором минимизированы. В результате происходит пересыщение электронтранспортной цепи электронами, в экссудате увеличивается содержание Н2О2. Эти рассуждения согласуются с характером заселения бактериями Bacillus subtilis поверхности цинка. На рисунке 3.21 представлено изображение биопленки бактерии Bacillus subtilis на поверхности цинка спустя 3 суток с начала экспозиции образца на МПА в условиях оптимальной влажности и температуры.
При культивировании бактерий на МПА активно метаболизируются аминокислоты, особенно на начальном этапе. В результате бактерии быстро колонизируют поверхность цинка и выделяют внеклеточные полимерные соединения с образованием плотной биопленки (рис. 3.21)
Высокое значение рН экссудата создает растворенный в водной среде аммиак, причем, как следует из данных, представленных на рисунке 3.18 и 3.20, концентрация NH3 примерно равна [OH-] и имеет порядок 10-3 моль/л. Электронотранспортная цепь функционирует без пересыщения и О2-образуется в пределах нормы. К 9-ым суткам экспозиции содержание аммиака в экссудате выходит на стационарный минимум (рис. 3.20), а рН возрастает. Очевидно, что под воздействием водного раствора аммиака снимается оксидная пленка и развиваются процессы типа реакции Фентона с участием непосредственно металла. В результате с уменьшением содержания аммиака рН остается на высоком уровне в течение длительного времени.
Можно предположить, что концентрации Н2О2 и OH- на границе Zn – биопленка превышают соответствующие значения на границе биопленка – экссудат, поскольку биопленка может затруднять диффузию Н2О2 и OH- в экссудат. На глюкозо-минеральной питательной среде при прочих равных условиях клеточная стенка бактерий, колонизирующих поверхность цинка, лишена внеклеточных фибрилл, имеются лишь единичные сообщества бактерий с характерной иглоподобной структурой (рис. 3.22). Очевидно, что синтетический процесс менее активен и вероятность разобщения электронного транспорта с синтезом АТФ велика. Противоположные закономерности наблюдаются для бактерий Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens, которые проявляют более низкую активность по отношению к ИНТ. При экспозиции цинка на МПА под воздействием Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens, концентрация Н2О2 в экссудате выше примерно в 2 раза, чем при использовании глюкозо минеральной среды. Очевидно, что активное дезаминирование аминокислот (рис. 3.20) приводит к резкому увеличению субстратов Рис. 3.22. Микрофотографии поверхности цинка спустя 3 суток экспозиции под воздействием бактерии Bacillus subtilis на глюкозо-минеральной среде электронтранспортной цепи, но при ее низкой эффективности доля побочного процесса – переноса электронов на О2 с последующим диспро-порционированием до Н2О2, возрастает (рис. 3.17). В случае глюкозо-минеральной среды низкая эффективность электронтранспортной цепи более сбалансирована с условиями жизнедеятельности, вследствие чего побочный процесс образования активных метаболитов кислорода выражен слабее.
Снижение содержания Н2О2 в экссудате с течением времени (рис. 3.16, 3.17) может быть обусловлено, вероятно, каждым из двух факторов: разложением каталазой, которая обнаруживается в экссудате через 3 5 суток экспозиции известным методом; разложением Н2О2 при акцептировании электрона металла после растворения оксидной пленки по схеме реакции Фентона:
Как отмечалось, последнее положение может быть причиной поддержания рН экссудата на высоком уровне в течение длительного времени. Так, например, для Bacillus subtilis, культивируемой на МПА к 12 суткам экспозиции концентрация Н2О2 в экссудате снижается по сравнению с максимальной более чем в 5 раз, а значение рН становится наибольшим (рис. 3.16, кривая 1; рис. 3.18, кривая 3).
Воздействие агрессивных бактериальных метаболитов (Н2О2, OH-) на металл может быть одной из главных причин стимулирования биоповреждений его поверхности. Как видно из рис. 3.21, через 3 суток с начала экспозиции в условиях, благоприятных для жизнедеятельности бактерий Bacillus subtilis, проявляющих высокие электронотранспортные свойства, происходит активная колонизация поверхности цинка, которая сопровождается разрушением металла по граням зерен с признаками межкристаллитной коррозии (рис. 3.23 б). Микрофотографии поверхности цинка: а – исходная поверхность цинка, не контактирующая с бактериями (1000); б – поверхность цинка спустя 5 суток экспозиции под воздействием бактерий Bacillus subtilis (200)
Очевидно, что биопленка Bacillus subtilis стимулирует коррозионный процесс за счет активных метаболитов, в том числе Н2О2, OH-, которые концентрируются на межфазной границе металл – биопленка, а также частично диффундируют на границу биопленка - окружающая среда, что способствует формированию жидкого экссудата (рис. 3.15).
Коррозионная активность на начальном этапе (3 суток) определена по зависимости потенциала образца цинка от плотности тока при скорости развертки 20 мВ/с (рис. 3.24).
Биопленка органической природы, проявляя диэлектрические свойства, создает экранирующий эффект. Это приводит к тому, что первый цикл восстановления не вызывает появления тока коррозии (рис. 3.24 а, б). Лишь в третьем цикле на хроновольтамперометрических кривых плотность тока перестает резко меняться при Е -1,2В (эта область соответствует потенциалу восстановления двухвалентных соединений цинка, например гидроксиду (Е = -1,245 В)), причем при использовании глюкозо-минеральной среды плотность тока восстановления продуктов коррозии существенно выше, чем при культивировании бактерий на МПА. Результат согласуется с большей концентрацией Н2О2 в экссудате (рис. 3.16, кривые 1 и 2) и подтверждает стимулирующую роль бактерий в коррозионном процессе.