Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 12
1.1. Теоретические основы процесса кристаллизации 12
1.1.1. Стадии кристаллизации 14
1.1.2. Массовая кристаллизация из водных растворов 20
1.1.3. Методы изучения процесса кристаллизации 20
1.2. Кристаллизация в биологических жидкостях 22
1.2.1. Теоретическое и экспериментальное моделирование процесса кристаллизации в растворах биосред 24
1.2.2. Влияние добавок на процессы кристаллизации фосфатов кальция 27
1.2.4. Микрокристаллизации в капле биологических жидкостей 32
1.3. Особенности взаимодействия поверхности фосфатов кальция с белками и аминокислотами 36
1.3.1. Особенности поверхности фосфатов кальция 37
1.3.1. Топография 38
1.3.2. Химические свойства фосфатов кальция 39
1.3.3. Гидрофобные свойства фосфатов кальция 41
1.3.4. Молекулярно-динамическое моделирование адсорбции 41
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Методика приготовления модельных растворов 45
2.2. Методы изучения кинетики кристаллизации
2.2.1. Методика измерения времени периода индукции 46
2.2.2. Алгоритм расчёта удельной поверхностной энергии 46
2.2.3. Методика турбидиметрического определения скорости роста и агрегации 47
2.2.4. Методика потенциометрического определения кинетики кристаллизации 48
2.2.5. Методика определения размеров частиц с помощью лазерной дифракции 48
2.3. Методы изучения адсорбции аминокислот на фосфатах кальция. 49
2.3.1. Методика синтеза кристаллов брушита и гидроксиапатита 49
2.3.2. Методика проведения адсорбционного эксперимента 49
2.3.3. Методика фотометрического определения концентрации аминокислот 49
2.3.4. Алгоритм обработки экспериментальных данных с позиции теории
Ленгмюра и Фрейндлиха 50
2.4. Методы физико-химического исследования твердых фаз 51
2.4.1. Методика рентгенофазового анализа 51
2.4.2. Методика ИК-Фурье спектроскопии 51
2.4.3. Методика измерения площади удельной поверхности 51
2.4.4. Методика определения -потенциала и знака заряда частиц золей методом электрофореза 52
2.4.5. Методика измерения морфологии частиц методом оптической микроскопии 2.4.6. Методика термического анализа ТГ-ДТГ-ДТА 53
2.5. Определение химического состава надосадочной жидкости 54
2.5.1. Методика определения фосфат - ионов [ГОСТ 18309-72] 54
2.5.2. Методика комплексонометрического определения ионов кальция и магния при их совместном присутствии с отделением фосфатов [РД 52.24.403-94] 54
2.5.3. Методика определения ионов магния и стронция методом АЭС-ИСП 55
2.6. Методы изучения кристаллизации ротовой жидкости 55
2.6.1. Методика забора смешанной слюны 55
2.6.2. Методика фотометрического определения общей концентрации ионов кальция с арсеназо III 56
2.6.3. Методика фотометрического определения фосфат-ионов 56
2.6.4. Методика определения общей концентрации белка 57
2.6.5. Методика фотометрического определения концентрации глюкозы 57
2.6.6. Методика потенциометрического определения рН 57
2.6.7. Методика определения типа микрокристаллизации слюны 57
2.6.8. Методика определения фрактальной размерности микроскопических изображений 58
2.6.9. Алгоритм математической обработки экспериментальных данных методами многомерной статистики (дискриминантный анализ) 59
ГЛАВА 3. Результаты исследования кристаллизации в модельных растворах при варьировании пересыщения 61
3.1. Основные параметры скорости зародышеобразования 61
3.2. Закономерности скорости роста и агрегации в модельных системах 63
3.3. Кинетика кристаллизации из модельных растворов по данным лазерной дифракции 68
3.4. Фазовый состав осадков, полученных из модельных систем 73
ГЛАВА 4. Результаты исследования кристаллизации в модельных растворах в присутствии неорганических и органических добавок 75
4.1. Закономерности кристаллизации из модельных растворов при варьировании кислотности среды 75
4.2. Кинетические параметры кристаллизации из модельных растворов в присутствии неорганических добавок 78
4.3. Кинетические параметры кристаллизации из модельных растворов в присутствии органических добавок 92
4.4. Особенности кристаллизации фосфатов кальция из модельных растворов в присутствии аминокислот 95
ГЛАВА 5. Результаты исследования адсорбции некоторых аминокислот на фосфатах кальция 104
5.1. Физико-химические характеристики синтезированных кристаллов брушита и гидроксиапатита 105
5.2. Результаты адсорбции аминокислот на брушите и гидроксиапатите при фиксированном значении рН 106
5.3. Влияние рН на процесс адсорбции аминокислот на брушите и гидроксиапатите 121
5.3.1. Влияние рН на процесс адсорбции аминокислот на брушите 121
5.3.1. Влияние рН на процесс адсорбции аминокислот на гидроксиапатите 129
ГЛАВА 6. Результаты исследования кристаллизации в капле биологической жидкости 140
6.1. Химический состав смешанной слюны спортсменов разных групп 140
6.2. Микрокристаллизация в капле биологической жидкости (слюны) 1 6.3. Термодинамическая модель структурообразования в высыхающей капле биологической жидкости и ее связь с фрактальной размерностью 148
6.4. Экспериментальное применение фрактальной размерности для описания структур высыхающих капель слюны 157
Выводы 162
Список использованной литературы 165
- Теоретическое и экспериментальное моделирование процесса кристаллизации в растворах биосред
- Методика измерения времени периода индукции
- Методы изучения кристаллизации ротовой жидкости
- Результаты адсорбции аминокислот на брушите и гидроксиапатите при фиксированном значении рН
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Законы кристаллизации интересны, в частности, тем, что между ними и отдельными законами генезиса и роста в живой и неживой природе обнаруживается сходство (Юшкин Н.П., 2007; Руди Ш., 2014). Однако исследования последних лет показали, что грань между живым и неживым устанавливается с большим трудом, а понятия «кристалл» и «жизнь» не являются взаимоисключающими (Борисова О.Н., 2016). Кристаллы и живой организм можно представить примерами осуществления крайних возможностей в природе. Известно, что обменные процессы в живом организме сопровождаются разложением сложных химических соединений на более простые, и синтезом складывающихся из простых – сложных соединений. Это происходит в жидкой или жидкокристаллической среде с наименьшими затратами энергии. Вместе с тем живой организм остаётся самим собой в течение десятков лет (Хромушин В.А. и соав., 2016). На сегодняшний день разработка и совершенствование методов исследования биологических жидкостей представляют большой интерес при диагностике и моделировании различных состояний живого мира. Данные современных исследований показывают, что первичные изменения, связанные с действием, например, патогенного фактора на организм возникают, прежде всего, на молекулярном уровне (Шатохина С.Н., 1995; Яхно Т.В., 2013). В биологических жидкостях происходят постоянные изменения молекулярного состава и характера взаимодействия различных компонентов. Такие изменения являются наиболее информативными при исследовании гомеостаза молекулярного уровня и могут служить основой для диагностики ранних стадий различных заболеваний. Но в настоящее время недостаточно изучена взаимосвязь процесса кристаллизации биологических жидкостей с данными их химического состава и физическими показателями (Воробьев А.А., 2004). В большинстве работ, посвященных вопросам роста кристаллов, изучаются простые системы, что малоприменимо к биологическим жидкостям (Титов А.Т. и соав., 2001; Росеева Е.В. и соав., 2009).
Сложность изучения кристаллизации в биологических жидкостях заключается в том, что в их состав входит большое число компонентов, а также существует множество факторов, влияющих на процессы кристаллизации в биосредах. Кроме того, образование данных соединений происходит в неравновесных условиях и за их возникновение отвечают кинетические факторы.
Таким образом, изучение процессов кристаллизации в прототипах биологических жидкостей важны как для получения новых фундаментальных знаний, так и для создания новых диагностических методов для предотвращения ряда заболеваний.
Цель работы заключалась в определении кинетических параметров кристаллизации (зарождения, роста и агрегации) малорастворимых соединений из модельных растворов (слюны – раствор 1 и жидкой фазы зубного налёта – раствор 2) и исследовании адсорбционного взаимодействия брушита и гидроксиапатита с аминокислотами.
В соответствии с общей целью в работе решались следующие задачи:
-
Изучить закономерности процесса кристаллизации in vitro при варьировании состава модельного раствора - пересыщения и кислотности среды.
-
Установить влияние катионов (магния, стронция, марганца), анионов (фторидов, карбонатов), а также органических веществ (аминокислот, белка – казеина,
глюкозы) на стадии кристаллизации.
-
Исследовать адсорбционное взаимодействие 15 аминокислот различных групп (кислотных, нейтральных, основных) с минеральными фазами (брушитом и гидроксиапатитом).
-
Определить изменения кристаллизации модельных растворов в капле малого объема на смачиваемой подложке (микрокристаллизация) при изменении её химического состава и определить взаимосвязь морфологии кристаллической структуры, образовавшейся при высыхании капель, с её фрактальными размерами.
Научная новизна результатов диссертационной работы:
-
Впервые определены кинетические параметры стадий кристаллизации (нуклеации, роста, агрегации) при 298 К из модельных растворов при варьировании пересыщения. Определены механизмы зарождения и роста фосфатов кальция, установлены лимитирующие стадии процесса.
-
Исследованы кинетические параметры кристаллизации из модельных растворов при варьировании, кислотности среды, неорганических и органических добавок. Установлено замедляющее и ускоряющее действие компонентов раствора.
-
Впервые установлено действие аминокислот различных групп на этапах кристаллизации, определены размеры и скорость образования агрегатов. Показано, что влияние аминокислоты завит от её природы и исходной концентрации в растворе.
-
Изучены физико-химические параметры сорбции аминокислот на брушите и гидроксиапатите.
-
Предложена термодинамическая модель структурообразования в капле биологической жидкости и её связь с фрактальной размерностью. Показано, что данную величину можно использовать для анализа микроскопических изображений капель биологических жидкостей. Показана связь ионно-электролитного состава с характером структурообразования.
Практическая значимость. Полученные в диссертации результаты по кинетике кристаллизации из модельных растворов с различными пересыщениями, рН и концентрациями компонентов могут быть использованы для профилактических мероприятий в лечении заболеваний полости рта (зубные и слюнные камни). Позволяют наметить пути к разработке эффективных методов профилактики болезней ротовой полости человека с использованием известных фармакологических и витаминных препаратов, биодобавок и минеральных вод соответствующего состава. Показана возможность лабораторной диагностики уровня физической нагрузки на организм человека с целью выявления уровня адаптированности и резервных возможностей организма по составу биологического раствора. Результаты исследования химического состава и структурных свойств разных групп испытуемых могут быть полезны для оценки физической нагрузки и её корректировки (Патенты РФ № 2463962, № 2556371), а данные по фрактальной размерности помогут в автоматизации этого процесса (База данных № 2016620163).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Кинетические параметры нуклеации, роста и агрегации in vitro из модельных растворов биологических жидкостей при варьировании пересыщения и кислотности среды.
-
Кинетические параметры нуклеации, роста и агрегации in vitro из модельных растворов биологических жидкостей в присутствии неорганических добавок и варьировании их концентрации.
-
Кинетические закономерности нуклеации, роста и агрегации in vitro из модельных растворов биологических жидкостей в присутствии органических добавок и варьировании их концентрации.
-
Термодинамическая модель структурообразования в высыхающей капле биологической жидкости и ее связь с фрактальной размерностью поликристаллических объектов.
Достоверность и надежность полученных результатов обеспечена применением
отработанных методик расчетов, экспериментов по кристаллизации и измерений,
использованием комплекса взаимодополняющих методов исследования,
воспроизводимостью результатов повторных экспериментов, а также согласием с имеющимися литературными данными.
Апробация работы. Результаты работы представлены на следующих всероссийских и международных научных конференциях: V International Symposium “Biogenic-abiogenic interactions in natural ad anthropogenic systems” (Санкт-Петербург, 2014); IX Международная конференция «Кинетика и механизм кристаллизации» (Иваново, 2014, 2016); Всероссийская молодежная конференция «Медицинские основы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте» (Омск, 2012); Школа-конференция «Неорганические соединения и функциональные материалы (ICFM-2015)» (Новосибирск, 2015); Всероссийская молодежная научная конференция «Минералы: строение, свойства, методы исследования» (Екатеринбург, 2013, 2015, 2016); XXVII симпозиум «Современная химическая физика» (Туапсе, 2015); V Всероссийской научной молодежной школы-конференции «Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии» (Омск, 2016); XII Международная научная конференция “Радиационно-термические эффекты и процессы в неорганических материалах” (Севастополь, 2016).
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 17 работ, в том числе 2 главы в коллективных монографиях, 6 статей в журналах из перечня рецензируемых научных журналов (ВАК, Scopus, Web of Science), 1 база данных и 8 тезисов докладов.
Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ в рамках научных проектов: 15-33-50072 мол нр, 16-33-00684 мол_ а, 15-29-04839 офи м; ФГБОУ ВО «ОмГУ им. Ф.М. Достоевского (грант «Молодым ученым ОмГУ»); стипендии Президента РФ молодым ученым и аспирантам (СП-4176.2015.4).
Личный вклад автора состоит в критическом обзоре имеющихся литературных данных по теме работы, на основании которого сформулированы задачи исследования и спланированы эксперименты. Основная часть результатов, приведенных в диссертации, получена непосредственно автором или при его личном участии. Физико-химические исследования частично проведены на базе ОНЦ СО РАН г. Омск. Соискателем самостоятельно выполнена обработка, анализ и обобщение полученных данных.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы (169 наименований). Общий объем диссертации составляет 182 страницы, включая 77 рисунков и 60 таблиц.
Теоретическое и экспериментальное моделирование процесса кристаллизации в растворах биосред
Для ФК возможны как изо- так и гетеровалентные замещения ионов кальция ионами других металлов в структуре [69-74]. Вересов А.Г. и соавт. [74] отмечают, что главным фактором, определяющим заполнение катионных позиций апатита, является характер химической связи, образуемой катионом в кристаллической структуре. Фактор размерного подобия ионов заместителя с ионами кальция менее значим. Однако, существенные отличия радиусов ионов могут приводить к сильной дестабилизации структуры гидроксиапатита и значительному изменению кристалличности даже при малых степенях замещения [75-77].
Механизмы катионных замещений могут быть представлены следующим образом ( - вакансия): М2+ = Са2+; М++М3+ = 2Са2+; 2М+ = Са2+; 2М3++П = ЗСа2+; М4++П= 2Са2+.
Литературные данные о гетеровалентных замещениях по схеме 2Са2+ М+ + М3+ ограничены. Учитывая близость кристаллических ионных радиусов La3+ и Bi3+ (1.172 и 1.170 ), Гетьман У.И. с коллегами предположил, что ионы Ві3+ также могут замещать ионы Са2+ в достаточно широком интервале концентраций. В ходе исследований по кристаллизации гидроксиапатита в присутствии ионов натрия и висмута авторами с помощью РФА и ИК-спектроскопии было исследовано замещение ионов Са2+ ионами Na+ и Ві3+ в синтетическом гидроксиапатите Саs-2хNaxBix(P04)30H (х = 0-1.6) при 1100С. Показано, что предполагаемая схема замещения реализуется в составах с х 1.3. Дальнейшее увеличение значений х ведет к образованию наряду с гидроксиапатитом кальция дополнительной фазы с неизвестной структурой, т.е при х = 1.4 предел замещения пройден [78].
Как правило, в биологических средах, где происходит кристаллизация гидроксиапатита, присутствуют значительные количества ионов магния. Установлена возможность замещения: Са2+ Mg2+. Также известна способность этого иона изменять габитус кристалла гидроксилапатита в процессе синтеза и проявление ингибирующего действия Mg2+ на кристаллизацию его из водных растворов [74-76, 79]. Эти явления могут быть объяснены различием ионных радиусов кальция (1.05) и магния (0.73 ).
В статье И.В. Фадеевой с соавторами предложен метод синтеза магнийсодержащего фосфата кальция. Исследователями было получено четыре образца состава Caio-xMgx(P04)6(OH)2 (х=0.1, 0.25, 0.5, 1.0), а также установлено, что ион магния дестабилизирует структуру гидроксиапатита. Замещение 1% атомов кальция в гидроксилапатите атомами магния (х=0.1) не изменяло его структуру, а при увеличении концентрации магния образовывалось соединение с более дефектным строением. Возрастание количества магния от 1 до 10 ат.% (от общего содержания металлов в составе соединения) приводило к снижению температуры перехода апатитоподобной структуры в витлокитоподобную [75]. В статье [77] приводятся сведения об образовании магнийсодержащих карбонат-гидроксиапатитов типа А общей формулы MgxCay(P04)6(СО3 (OH)2(х+у)-i8,4 хН2О, где х = 0.05; 0.1; у = 9.8-9.9, причем установлено, что введение небольших количеств ионов магния не влияет на процесс образования биоапатита кальция.
Исследования, проведенные японскими учеными Liao J., Hamada К. и Senna М., позволили установить, что присутствие ионов магния в кристаллизационной среде мешает процессу нуклеации основного фосфата кальция. Кристалличность образующегося гидроксилапатита уменьшается с ростом молярного соотношения Mg/(Ca+Mg) в растворе и при Mg/(Ca+Mg) 0.31 (Mg/Ca 0.2 по данным [74]) осаждающаяся фаза становится полностью аморфной [76]. По мнению авторов, такое воздействие ионов магния может быть вызвано адсорбцией их на поверхности кристаллов и/или образованием твердых растворов замещения, которое сопровождается сжатием элементарной ячейки в направлении кристаллографических осей а и с.
Как отмечается в работе [74], наряду с ионами магния наиболее радикально скорость роста кристаллов гидроксиапатита и их габитус изменяют ионы цинка. Они на три порядка больше, чем ионы Mg2+, подавляют скорость роста апатита в направлении {001}. В результате цинк, как и карбонат-ион в апатите Б-типа, способствует образованию мелких пластинчатых кристаллов (рис. 1.8).
Небольшие количества двухзарядных (Mg2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Mn2+) и трехзарядных (Al3+) катионов в растворе, как уже было отмечено, могут изменять скорость роста и морфологию кристаллов [74]. При этом «отравляющие» рост примеси обычно наблюдаются либо адсорбированными на перегибах и ступенях роста, либо образуют эпитаксиальный слой, кристаллографически подобный растущей грани. В первом случае происходит физическое блокирование ступени примесью и наблюдается изменение формы роста. Во втором случае это связано с экранированием поверхности от маточного раствора [74].
Таким образом, влияние ионов металлов на кристаллизацию гидроксилапатита связано с возможностью их изоморфного вхождения в структуру соединения, а именно ее дестабилизацией вследствие неполноты компенсации заряда, появления вакансий и различия в величинах ионных радиусов. Кроме того, ингибирующее воздействие катионов может быть вызвано адсорбцией на растущих кристаллах основного фосфата кальция.
В последнее время некоторыми авторами подчеркивается особая роль органического вещества в процессах образования и роста камней, влияние на формирование их структуры. В свете этого актуальны исследования, посвященные изучению характера взаимодействия гидроксиапатита и органических веществ. Исключительно важными в биологическом отношении соединениями являются аминокислоты. Они циркулируют по организму с кровью и попадают в клетки и тканевые жидкости путем диффузии [80-82].
Различают кислотные, нейтральные и основные аминокислоты. Проведенные зарубежными и отечественными учеными исследования, направленные на определение роли аминокислот в процессах кристаллизации гидроксиапатита, позволили установить, что наибольшее ингибирующее влияние способны оказывать органические молекулы кислотного характера. Кристалличность, растворимость и некоторые другие характеристики гидроксиапатитов в значительной мере изменяются в том случае, если их осаждение протекает в присутствии -карбоксиглутаминовой, глутаминовой, аспарагиновой кислот, а также серина [81, 83-87]. Названные аминокислоты входят в состав образцов. Matsumoto Т. и соавт. считают, поскольку размер молекул аминокислот достаточно большой, они не могут включаться в структуру гидроксиапатита, следовательно, присутствие органических молекул в составе осадков вызвано их адсорбцией на поверхности кристаллов. Данное предположение подтверждается результатами ИК-спектроскопии: в области 1550 – 1650 см-1 наблюдаются полосы поглощения, характерные для цвиттер-ионов.
Методика измерения времени периода индукции
В биологических жидкостях фосфат-ионы определяются по методу Больца и Льюка [139]. Сущность метода: ионы в присутствии избытка молибдата в кислой среде образуют фосфорномолибденовую гетерополикислоту (ФМК). Восстановлением ФМК получают «фосфорномолибденовую синь», обладающую интенсивной окраской, что является основой высокочувствительного фотометрического метода определения фосфора.
Проведение измерений: предварительно слюна центрифугируется 15 минут при 3000 об/мин. К 0.1 мл надосадочной жидкости приливается 2.4 мл 7% раствора трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугируется в течение 10 минут при 3000 об/мин. К 2 мл надосадочной жидкости добавляется 4 мл смеси 0.25 % раствора молибдата натрия Na2Mo04 и 0,15 % раствора гидразин-сульфата N2H6S04, взятых в соотношении 2.5:1. Смесь готовится непосредственно перед определением. Пробы ставят на 10 минут в кипящую водяную баню, охлаждают и фотометрируют против холостого раствора на приборе КФК при 1=670 нм, толщина светопоглощающего слоя /=2.007 см. Содержание фосфора определяется по калибровочному графику, построенному заранее и обсчитанному по методу наименьших квадратов. Погрешность определения 5%. 2.6.4. Методика определения общей концентрации белка
Сущность метода: для количественного определения общей концентрации белка использовалась биуретовая реакция [140], основанная на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди в щелочной среде.
Проведение измерений: к 5.3 мл 3% щелочи приливается 0.2 мл биуретового реактива и 0.5 мл слюны. Раствор хорошо перемешивается и через 15 минут фотометрируется против холостой пробы (1=330 нм, /=2.007 см) на приборе КФК-2. Холостая проба содержит 5.8 мл щелочи 3% и 0.2 мл реактива Бенедикта. Предварительно строится калибровочный график по стандартному раствору белка с концентрацией 0.2 - 1.8 мг. Погрешность определения 5%.
Для определения глюкозы использовали «оксидазный метод», основанный на ферментативном окислении глюкозы в присутствии глюкозооксидазы (ГОД). Торговый набор для определения - «Глюкоза ФС», Диакон-ДС.
Измерения проводились на приборе КФК-2 против холостой пробы, толщина светопоглощающего слоя 1 см, длина волны 490 нм. Расчет результатов проводили по градуировочному графику. Погрешность определения - 5%.
Для определения рН использовали метод прямой потенциометрии с использованием комбинированного стеклянного микроэлектрода на рН-метре «рН-150-МИ», погрешность 0.01 ед. рН.
Методика приготовления препаратов микрокристаллизации (МКС) проводилась по рекомендациям Леуса П.А. [141]. Кристаллизация ротовой жидкости осуществлялась методом открытой капли. На стекло, предварительно обработанное спиртом и эфиром, наносится три капли слюны. Высушивание микропрепарата проводили при атмосферных условиях в течение 40 минут. Высохшие капли изучали на микроскопе XSP-104, увеличение 100. Делали снимки с разрешением 2048 1536 на видеоокуляр ToupCam UCMOS03100KPA. Определяли тип микрокристаллизации в соответствии с существующей 6-ти бальной шкалой (табл. 2.3) [142].
Крупные удлинённые кристаллические структуры, сросшиеся между собой в произвольном порядке. балла В центре капли видны отдельные кристаллы звёздчатой формы, по периферии сохранены укрупнённые древовидные кристаллы. 1 балл Отдельные кристаллы в виде прута или веточки, расположенные по всему полю. баллов По всей площади капли большое количество изометрически расположенных кристаллических структур, звёздчатой, округлой и неправильной формы.
Алгоритм анализа фрактальной размерности полученных цифровых изображений был реализован на основе системы компьютерной алгебры MathCad [143]. Программа позволяет анализировать как фрактальные кластеры (пространственно-ограниченные объекты), так и фрактальные структуры (непрерывные объекты). Особенность алгоритма связана с решением проблемы субъективности, возникающей обычно при анализе полутоновых изображений. Результаты расчета зависят от выбора порогового уровня Iw при бинаризации изображения (преобразовании полутонового изображения в черно-белое). Согласно [144], зависимость фрактальной размерности от порогового уровня имеет особенности, которые позволяют определить приемлемое значение. Расчет ведется на основе фрактальной зависимости, которой связаны площадь S и линейный размер L исследуемого объекта (2.18): S = a-LD (2.18) где а - коэффициент пропорциональности, зависящий от геометрической формы (для квадрата а = 1, для круга а = /4), фрактальная размерность D при анализе двумерного изображения не превышает 2. Чем сложнее форма объекта, тем меньше величина D. Для цветных и полутоновых изображений с низкой контрастностью величины а и D могут существенно зависеть от выбора порога яркости Iw. Минимумы или плато на зависимости D(Iw) указывают область оптимальных значений Iw, в которой следует искать величину фрактальной размерности D(Iw). Дополнительный учет среднеквадратической ошибки позволяет оценить достоверность получаемого результата.
Расчет доверительных интервалов для результатов измерений осуществлен с использованием критерия Стьюдента и доверительной вероятностью 0.95. Также в работе использованы методы регрессионного и дискриминантного анализа. Дискриминантный анализ в общем случае, сводится к подгону линейного уравнение следующего типа (2.19): группа = a + brx! + Ъ2х2 + ... + Ьт-хт (2.19) где а является константой, иЬі...Ьт являются коэффициентами регрессии. В результате анализа рассчитываются коэффициенты Ъ (и стандартизованные коэффициенты бета) для каждой переменной и для каждой дискриминантной функции. Они интерпретируются обычным образом: чем больше стандартизованный коэффициент, тем больше вклад соответствующей переменной в дискриминацию совокупностей. Далее проверяют число корней, которое значимы к дискриминации между совокупностями. Для интерпретации анализа используются только те из них, которые будут признаны статистически значимыми. Остальные функции (корни) должны быть проигнорированы. Затем, для каждой значащей функции рассматривают стандартизованные коэффициенты бета. Чем больше стандартизованный коэффициент бета, тем больше относительный собственный вклад переменной в дискриминацию [145].
Методы изучения кристаллизации ротовой жидкости
Данные табл. 3.4 показывают, что частный порядок по ионам кальция для системы, моделирующей состав слюны, не превышает единицы и меньше соответствующего для системы ЖФЗН. Такое различие, вероятно, можно объяснить тем, что для слюны преобладает гетерогенное зарождение и дальнейший рост, а для системы с большей концентрацией кристаллообразующих компонентов появление большего количества критических зародышей, при этом преобладающими являются процессы коагуляции. Схожая закономерность и для значений констант роста, отличие между двумя системами составляет 3-8 порядков.
Кроме того, важно отметить, что для модельного раствора слюны с ростом пересыщения частный порядок увеличивается, а для системы ЖФЗН уменьшается при переходе от S=15 к S=20, а дальнейшее увеличение пересыщения в этой системе влияния не оказывает. Аналогичные зависимости характерны и для значений констант. По нашему мнению, это объясняется тем, что при определенном значении концентрации минералообразующих ионов может наблюдаться смена механизма роста кристаллов [68].
При изучении морфологии частиц твердой фазы методом оптической микроскопии (рис. 3.6) установлено, что при малых временах кристаллизации (t=10 мин) на фотографиях капель исследуемых систем видны дендритные кристаллы хлорида натрия. С увеличением времени (t=30 мин) на фотографиях отчетливо выделяются зародыши кристаллизации. При больших временах кристаллизации (t=50 мин) становятся заметными отдельные кристаллы брушита характерной пластинчатой формы. Это указывает на то, что эта фаза является кинетически контролируемой в изучаемых системах. Следует отметить, что закономерности для изучаемых систем одинаковы, отличается лишь время появления кристаллов в поле зрения.
При изучении кристаллизации методом лазерной дифракции были получены дифференциальные кривые распределения частиц по размерам в разные промежутки времени кристаллизации, которые характеризуют образование частиц твердой фазы (рис. 3.7).
После соответствующей математической обработки дифференциальных кривых с использованием программного обеспечения Wing-2 и Wing-3 определено изменение среднего размера частиц (d) в процессе кристаллизации (табл. 3.4, 3.5). Таблица 3.4
Анализ рассчитанных величин показал, что в процессе кристаллизации размер частиц увеличивается, причем доверительные интервалы для разных промежутков времени не перекрываются. Так же с ростом пересыщения размер кристаллических частиц уменьшается, что подтверждает предыдущие исследования (разд. 3.2). Несмотря на схожую закономерность, необходимо отметить различия размеров образующихся частиц твердой фазы для слюны и ЖФЗН. В модельном растворе слюны он меняется от 198 до 42 мкм при переходе от S=25 к S=35 (табл. 3.4), а в растворе жидкой фазы зубного налета от 52 до 26 мкм (табл. 3.5) для S=15 и S=25 соответственно. Полученные результаты согласуются с ранее представленными данными, а именно состав модельной системы слюны благоприятен для роста более крупных кристаллов [149].
Графическое представление табличных данных (рис. 3.8) показывает, что размер частиц в процессе кристаллизации меняется нелинейно, и, в целом, зависимости имеют одинаковый характер. С увеличением пересыщения количество образующихся частиц увеличивается, но при этом средняя скорость роста кристаллитов уменьшается (табл. 3.6).
Для модельного раствора слюны S=25-35 и раствора ЖФЗН наблюдается линейная корреляция в координатах d3=f(t) (рис. 3.9). Следовательно, на основании теории Лифшица-Слёзова-Вагнера [39] можно утверждать, что рост частиц в этих системах протекает за счет изотермической перегонки (Оствальдовское созревание), то есть заключается в переносе вещества от мелких частиц к крупным, так как химический потенциал последних меньше (эффект Кельвина). В результате мелкие частицы постепенно растворяются, а крупные растут. Таким образом, рост частиц обусловлен диффузионным переносом вещества. а)
Отличается ход кривой «размер-время» для системы жидкой фазы зубного налета с пересыщением S=25. Можно предположить, что рост частиц в этой системе происходит преимущественно за счет агрегации, заключающейся в слипании (слиянии) частиц дисперсной фазы. Поскольку в такой системе образуется большое число центров кристаллизации, следовательно, плотность частиц твердой фазы выше, и они находятся на небольшом расстоянии друг от друга, что облегчает их сближение и взаимную агрегацию.
Установлено, что зависимость размера частиц от пересыщения в моделируемых растворах не линейна, имеет максимальный экстремум и носит одинаковый характер как для системы ЖФЗН, так и для раствора слюны (рис. 3.8). Полученная взаимосвязь указывает на то, что для моделируемых жидкостей характерен дислокационный механизм роста, при этом расчетное значение составляет n=2.00±0.06. Установленные закономерности хорошо согласуются как с литературными данными [81, 83], так и с ранее полученными результатами.
По данным рентгенофазового анализа установлено, что в образцах, полученных из модельных систем через 24 часа кристаллизации при рН=7 присутствует смесь фаз ФК (рис. 3.10): гидроксиапатит (гексагональная сингония, пр. группа P 63/m), брушит (моноклинная сингония, пр. группа Ia), октакальций фосфат (триклинная сингония, пр. группа Р1). По ширине дифракционных пиков видно, что окристаллизованность осадка в системе ЖФЗН лучше.
На ИК-спектрах осадков наблюдаются полосы характерные для валентных и деформационных колебаний фосфатных групп, карбонатных и колебания воды в структуре. Диапазон частот 3440-3500 см-1 соответствует валентным колебаниям связи О-Н в Н2О; интервал 1680-1610 см-1 характерен для деформационных колебаний Н–О–Н в Н2О; полосы низкой интенсивности 1480-1410 см-1 – асимметричным валентным колебаниям С–О в СО32- В-типа (3СО32-); 1090-1030 см-1 – асимметричным валентным колебаниям 3 Р–О в РО43-; 968-958 см-1 – полносимметричное валентное колебание 1 и 3 Р–О в РО43-; 893-894 см-1 – колебания НРО42-; 875-879 см-1 – деформационное колебание О–С–О в СО32- А и Б-типа (2 СО32-); 634-632 см-1 – либрационные полосы поглощения ОН-; 605-564 см-1 – деформационное колебание 4 О–Р–О в РО43-.
Результаты адсорбции аминокислот на брушите и гидроксиапатите при фиксированном значении рН
Учитывая перспективу использования данных по МКС биологических жидкостей, существует необходимость анализа физико-химических процессов, протекающих в сложных многокомпонентных полидисперсных самоорганизующейся системах, какими являются БЖ, например, слюне. Представляет научный интерес проследить за динамикой агрегатного состояния при изменении соотношения концентрации компонентов на модели высыхающей капли.
Результаты расчета термодинамического равновесия, алгоритм которого приведен в [167], для бинарной системы Са10(РО4)6(ОН)2 СаНРО42Н2О представлены в виде трехмерных диаграмм (рис. 6.11). Видно, что область значений концентраций и pH физиологического раствора (слюны) находится в области устойчивости гидроксиапатита.
Область существования Саіо(РО4)б(ОН)2 при увеличении значений рН значительно расширяется. При рН = 5, 6, 7 и 8 область значений концентраций физиологического раствора полностью находится в области устойчивости данного соединения, а при рН 3 4 пересекает поверхность термодинамического равновесия (AG=0).
Таким образом, из диаграмм равновесий следует, что в условиях образования зубных камней брушит является термодинамически неравновесной фазой по отношению к гидроксиапатиту. Это свидетельствует о том, что его образование на начальной стадии формирования зубных камней контролируется в большей степени кинетическими факторами, а последующая трансформация в гидроксиапатит обусловлена стремлением системы к термодинамическому равновесию. Эти данные согласуются с результатами определения минерального состава зубных и слюнных камней [154]. Следует отметить, что на начальных стадиях формирования зубных камней неравновесные процессы играют решающую роль при образовании кристаллических фаз.
Образование неравновесных кристаллических фаз можно изучать при наблюдении высыхающих капель БЖ. При этом морфология кристаллов, образующихся при высыхании капель БЖ, сохраняет существенную часть избыточной энергии за счет изменения дисперсности кристаллов, их геометрической формы и состава фаз. Как правило, выделяющиеся в этих условиях кристаллы имеют неопределенную форму. Одним из методов, позволяющих описывать объекты неправильной формы, является фрактальная геометрия [143, 144]. При этом предполагается, что БЖ изначально находится в неравновесном стационарном состоянии, которое поддерживается гомеостазом.
Опишем связь избыточной энергии Гиббса системы с морфологией кристаллов, полагая, что морфология определена дисперсностью и фрактальной размерностью образующихся кристаллических частиц. Энергия Гиббса G системы в общем случае складывается из вкладов компонентов, находящихся в разных фазах, и поверхностной энергии межфазных границ G = X УklИkl + X Wks + 2 А + По-, (6.1) liquid solid gas здесь fjkf и Уkf- химические потенциалы и число молей компонентов в жидкой, кристаллической или газовой фазах (f=l,s,g), О, о - площадь и поверхностное натяжение межфазной границы.
Основные изменения площади межфазной поверхности связаны с образованием поверхности высокодисперсной кристаллической фазы. Слюна и другие БЖ смачивают стеклянную подложку таким образом, что при высыхании больших капель площадь межфазной поверхности жидкость-подложка не меняется, а поверхности жидкость-газ несущественно. Для капель с радиусом 102 мкм это позволяет пренебречь вкладом поверхностной энергии для границ раздела жидкость-воздух и жидкость-подложка. При меньших размерах капли следует учитывать поверхностную энергию и этих границ.
Таким образом, избыточная энергия может быть запасена в поверхностной энергии или в отклонении состава системы от химического и фазового равновесия (присутствие химически нестабильных компонентов, пересыщение). Величина избыточной энергии может быть использована в качестве индикатора состояния исследуемого биологического объекта. Анализ морфологии высохших капель БЖ позволяет относительно быстро оценить величину избыточной поверхностной энергии.
Чтобы установить связь морфологии кристаллической структуры с состоянием системы, рассмотрим простую термодинамическую модель процесса высыхания капель.
Будем считать, что в рассматриваемой БЖ лишь два компонента меняют своё фазовое состояние - летучий растворитель (вода) перераспределяется между жидкой (/) и газовой (g) фазой v0 = v0/+v0g и кристаллизующееся вещество перераспределяется между жидкой и твёрдой (s) фазой vx =vu+vh, здесь 0 и v, общее количество молей компонента 1 и 2 в системе. Остальные компоненты при высыхании образуют твердый раствор, который, при отсутствии данных о коэффициентах активности, будем считать идеальным = м + RTIn(х), здесь // - химический потенциал компонента, /л- стандартный химический потенциал, х - мольная доля компонента в соответствующей фазе, в дальнейшем будет использована как концентрация.