Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
Введение 10
1.1. Физико-химические аспекты применения полимеров в медицине 11
1.1.1. Биостабильные полимеры 11
1.1.2.Биодеструктируемые полимеры 12
1.1.3. Важнейший представитель класса биодеструктируемых полимеров -хитозан 15
1.2. Деструкция полимеров 17
1.2.1. Гидролитическая деструкция полимеров 18
1.2.4. Общие закономерности деструкции некоторых полимеров медицинского назначения 22
1.2.5. Основные закономерности деструкции хитозана 32
1.3. Описание кинетики ферментативных реакций 36
1.3.1. Ранние исследования описания кинетики ферментативных реакций
1.3.2. Модель Михаэлиса-Ментен 38
1.3.3. Кинетические параметры ферментативного гидролиза хитозана 43
1.3.4. Влияние различных физико-химических факторов на кинетические параметры ферментативной реакции 47
Заключение по литературному обзору 58
2. Экспериментальная часть 62
2.1. Характеристика исходных веществ и реагентов 62
2.2. Методика эксперимента 65
2.2.1. Приготовление растворов хитозана 65
2.2.2. Приготовление пленок хитозана 66
2.2.3. Определение плотности хитозановых пленок 66
2.2.4. Методика фракционирования хитозана 67
2.2.5. Определение молекулярной массы фракций хитозана методом скоростной седиментации 67
2.2.6. Определение характеристической вязкости хитозана в растворе 69
2.2.7. Определение констант в уравнении Марка-Куна-Хаувинка 71
2.2.9. Определение скорости ферментативного гидролиза хитозана в растворе 72
2.2.10. Проведение ферментативного гидролиза хитозана в пленках 74
2.2.11. Определение параметров Кт и Vmax в уравнении Михаэлиса-Ментен для процесса ферментативного гидролиза хитозана 74
2.2.12. Определение Р-гликозидазной активности гиалуронидазы феррицианидным методом 75
2.2.13. Изучение УФ-спектров растворов хитозана 75
2.2.14. Обработка результатов измерений 76
3. Обсуждение результатов 77
3.1. Ферментативный гидролиз хитозана в растворе 81
3.1.1. Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты. 82
3.1.2. Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты в присутствии лекарственного препарата - сульфата амикацина 89
3.2. Ферментативный гидролиз хитозана в пленках, полученных из раствора в уксусной кислоте 98
3.2.1. Ферментативный гидролиз хитозана в пленках. Системы: ХТЗ-раствор фермента в 1% уксусной кислоте и XT3-AM(S04)2-pacTBop фермента в 1% уксусной кислоте 98
3.2.2. Ферментативный гидролиз хитозана в пленках, полученных из раствора в уксусной кислоте. Изучаемые системы - ХТЗ-раствор фермента в воде и растворе Рингера-Локка и XT3-AM(S04)2-pacTBop фермента в воде и растворе Рингера-Локка 107
3.2.3. Ферментативный гидролиз хитозана в пленках. Изучаемые системы - XT3M(S04)2-pacTBop фермента в растворе Рингера-Локка, XT3-NaUcD3- раствор фермента в растворе Рингера-Локка, ХТЗ-МаЦФТ-раствор фермента в растворе Рингера-Локка
Заключение 115
Выводы 119
Список литературы
- Важнейший представитель класса биодеструктируемых полимеров -хитозан
- Определение плотности хитозановых пленок
- Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты в присутствии лекарственного препарата - сульфата амикацина
- Ферментативный гидролиз хитозана в пленках. Изучаемые системы - XT3M(S04)2-pacTBop фермента в растворе Рингера-Локка, XT3-NaUcD3- раствор фермента в растворе Рингера-Локка, ХТЗ-МаЦФТ-раствор фермента в растворе Рингера-Локка
Важнейший представитель класса биодеструктируемых полимеров -хитозан
Хитозан обладает целым рядом уникальных свойств, среди которых: биоинертность и отсутствие токсичности, способность к биодеструкции, противовирусная и противоопухолевая активность [62-66] , химическая активность, выражающаяся в возможности получения различных модификаций полимера [67-70], остеокондуктивные свойства, а также выраженная антибактериальной и фунгицидная активность [71-74].
Важным положительным качеством хитозана является возможность регулирования свойств материалов, полученных на его основе. Так отмечается [75,76], что пленки хитозана, сформированные из растворов испарением растворителя, отличаются деформационно-прочностными характеристиками, вследствие различий в организации структуры пленок на надмолекулярном уровне. Варьирование свойств может достигаться варьированием природы соли, в виде которой используется хитозан. [77,78].
Хитозановые материалы характеризуются значительно большей сорбционной активностью, чем целлюлозные материалы [79]. Можно также отметить более высокую пролиферативную активность фибробластов на пленке аскорбата хитозана, по сравнению с широко известным материалом подложки «Коллахит» [80]. В работах [81, 82] подчеркивают, что хитозан при использовании в тканевой инженерии кожи ускоряет лечение ран кожи, влияя на гомеостаз, стимулируя синтез белков внеклеточного матрикса, ускоряет заживление ран, стимулируя образование грануляционной ткани и реэпителизацию [83,84].
Такое многообразие свойств, присущих хитозану, обеспечивает ему практическое применение в самых различных областях хозяйства и промышленности, и главным образом - в биотехнологии и медицине.
Огромным достоинством хитозана является то, что он остается биологически активным при его использовании в самых различных фармацевтических формах, таких как: растворы, пленки, капсулы, таблетки, гранулы, гели, волокна, композиционные материалы и др. [85]. Это позволяет использовать его в качестве материала для создания покрытий, имплантов, матрикса-носителя лекарственных веществ пролонгированного действия.
Например, известно использование хитозана для трансдермальной доставки лекарственных веществ [29], для доставки белков и пептидов, факторов роста, противовоспалительных средств, антибиотиков, анальгетиков, неселективных бета-адреноблокаторов, а также, в генной терапии[86-91].
Одно из наиболее перспективных направлений практического применения хитозана в медицине связано с созданием пленок для временной защиты кожного покрова, например при лечении ожоговых и хирургических ран [92-99]. Ранозаживляюшие свойства хитозана отмечаются во многих работах [100-112], особенно в случае использования его композиций. Например, авторы [100, 112] предложили на всех фазах раневого процесса использовать губчатое раневое покрытие, в состав которого кроме хитозана, входит коллаген. В [101] повысили качество лечения ран с помощью двухслойной мембраны, содержащей смесь геля хитозана с сульфадиазином и серебром. Авторы [102] определили, что под влиянием лекарственных композиционных гелей ХТЗ повышается регенерационная и антибактериальная активность культур Е. Coli и St. Aureus, полученных из ран. Повышенная способность кожи к регенерации была отмечена в [113] для композиции коллаген-хондроитин-сульфат-хитозан.
Одной из причин, способствующих активному продвижению хитозана в качестве полимера биомедицинского назначения, является тот факт, что хитозан способен к процессу деструкции [114], которая может осуществляться как под действием химических и физических факторов, так и под действием биологически активных сред организма человека.
Хорошо известно, что деструкция полимеров может протекать под действием химических агентов (воды, кислот, спиртов, кислорода и т. д.), под влиянием физических воздействий (тепла, света, ионизирующего излучения, механической энергии и т. д.), а также под действием биологически активных сред.
При описании особенностей деструкции полимеров и изделий из них можно отметить существование двух возможных режима деструкции полимера:
1. Протекание деструкции в объеме полимера - внутренней кинетической области (деструкция по V-muny).
2. Деструкция полимера преимущественно в поверхностном слое - внешней дифузионно-кинетической области, т.е. в слое, диффузионно доступном для жидкой окружающей среды (деструкция по S-muny).
Первый режим биодеструкции встречается редко и применим к хорошо набухающим в биологических жидкостях полимерным системам, когда скорость их проникновения в полимер превышает скорость распада. Второй режим биодеструкции встречается более часто, причем в этом случае кроме химического строения полимера, имеют значение такие факторы, как форма полимерного изделия, его размер, наличие перфорации, степень пористости и т.д. При каталитическом влиянии ферментов на процесс деструкции полимеров - это единственно возможный режим деструкции. Это особенно важно, учитывая тот факт, что в случае полимерных материалов, изготовленных из природных полимеров, либо при наличии в полимере фрагментов, моделирующих естественный для фермента субстрат, именно ферментативный гидролиз играет самую заметную роль [115-117].
Анализ литературы показал, что в плане каталитической активности целесообразно рассмотреть следующие вещества: воду, соли и ферменты, в связи с их большой распространенностью и несомненной каталитической активностью.
Определение плотности хитозановых пленок
В литературе описано большое количество работ, посвященных ферментативному гидролизу хитозана под действием ферментов, обладающих хитинолитической активностью [162-170].
Так, в работе [168] описан гидролиз хитозана под действием трех хитозаназ, выделенных из бактериального штамма Bacillus megaterium PI. Процесс ферментативного гидролиза проводили в растворе, в результате чего были установлены оптимальные условия для этой реакции (рН=4,5-6,5 и Г=45С), а также определены кинетические параметры процесса -константа Михаэлиса Кт, значения которой составило 0,8 мг/мл.
В работе [163] был изучен ферментативный гидролиз ХТЗ с помощью ферментного препарата, полученного из пищеварительного тракта морского огурца Stichopus japonicas. Реакция гидролиза ХТЗ протекала в гомогенной среде: 10 мг ферментного препарата добавляли к 500 мл 1% раствора ХТЗ в уксусной кислоте. Реакцию останавливали нагреванием реакционной смеси до Г=95С в течение 3 часов, также были установлены оптимальные условия для данной реакции (рН=6,0 и Т=45С). О процессе деструкции ХТЗ судили по падению ММ с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
В работах [164,165] был исследован ферментативный гидролиз хитозана под действием лизоцима. Было установлено, что реакция подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. В ходе работы был установлен параметр Кт, равный 0,14 ммоль (0,002 % раствор) для хитозана со степенью N-ацетилирования 30% и 0,12 ммоль для 65% N-ацетилированного хитозана.
В работе [166] проводили опыты по деструкции хитозановых пленок под действием микромицетов. Результаты данных опытов показывают практически полное разрушение ХТЗ в течение 10 суток культивирования в случае с Paecilomyces carneus. Деструкцию ХТЗ оценивали по падению ММ с помощью вискозиметрического метода. В случае с Penicillium martensii молекулярная масса ХТЗ на 10-е сутки культивирования уменьшалась на 99,4%, в то время как в контроле молекулярная масса снизилась на 28,5%.
В различных источниках описан ферментативный гидролиз ХТЗ под действием ферментов с различной специфичностью, таких как целлюлаза [171-173], пектиназа [174,175], пепсин [176], папаин [177,178], протеаза [179], липаза [180,181], а-амилаза [182-184].
В работе [185] авторами исследовалась деструкция ХТЗ под действием пектиназы из Aspergillus niger. Было показано, что данный препарат способен деполимеризовать хитозан и его производные. Оптимальные условия для проведения данной реакции оказались при рН=3,7 и Т=47С. Реакция подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, значения Кт и Vmax составили 3,12 мг/мл и 153,85 нмоль/мин мг соответственно. В работах [186], утверждается, что хитозан подвергается деструкции под действием комплексов ферментов, состоящих из а-амилазы, целлюлазы и пектиназы, и а-амилазы и у-амилазы [187], что довольно странно, учитывая тот факт, что в ХТЗ имеются только Р-гликозидные связи.
В работе [188] по степени падения вязкости растворов ХТЗ исследовали деструкцию полимера под воздействием ферментных препаратов «Коллагеназа», «Лираза», «Трипсин» и «Пепсин». Авторами отмечается, что наиболее вероятной причиной активности изучаемых ферментных препаратов по отношению к ХТЗ является наличие в них сопутствующих лизосомальных ферментов с Р-гликозидазной активностью
Авторы работы [189] утверждают, что процесс деструкции ХТЗ может быть активирован ферментом проназой (сериновая протеаза из Streptomyces griseus). Исследования проводились в гомогенной среде, при этом было доказано, что реакция подчиняется схеме Михаэлиса-Ментен, Кт=5,2\ мг/мл и Кгаах=138,55 нмоль/мин мг. Оптимальные условия реакции наблюдались при рН=3, 7 и Т=37С
Авторами работы [190] изучался ферментативный гидролиз ХТЗ различной степени ацетилирования препаратом Целловиридин Г20х, содержащим Р-гликаназы, ксиланазы и целлюлазы, продуцируемым микроскопическим грибом Trichoderma reesei. Хитиназы в препарате отсутствовали. Было показано, что степень ацетилирования ХТЗ не оказывает принципиального влияния на его ферментативный гидролиз данным препаратом, но влияет на состав получаемых гидролизатов и их растворимость в воде. Из образцов с более высокой степенью ацетилирования получали продукты с более узким молекулярно-массовым распределением. Ранее этими же авторами [191] было показано, что гидролиз ХТЗ хитинолитическим комплексом, продуцируемым Streptomyceskurs sanovii, зависит от степени ацетилирования субстрата. Гидролиз ХТЗ со степенью ацетилирования 50-54% протекал в 5-6 раз быстрее, чем для образцов ХТЗ со степенью ацетилирования 15% и 73%.
В работе [192] исследовали влияние молекулярной массы и степени деацетилирования хитозана на его ферментативный гидролиз папаином (амидгидролаза растительного происхождения), полученного из растения Carica papaya (табл. 3)
Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты в присутствии лекарственного препарата - сульфата амикацина
Как видно из представленных в табл. 10 данных, значение константы Михаэлиса Кт является величиной практически постоянной, не зависящей от концентрации фермента и характеризующей сродство данного фермента к субстрату. Значение Vmax дает характеристику каталитической активности фермента, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта реакции при данной концентрации фермента при условии избытка субстрата. При проведении реакции в условиях избытка субстрата, максимальная скорость реакции линейным образом зависит от концентрации фермента (рис. 25).
Зависимость максимальной скорости ферментативного гидролиза хитозана в растворе 1% уксусной кислоты (7) и в системе XT3:AM(S04)2 с мольным соотношением 1:0,01 (2), 1:0,05 (3) и 1:0,1 (4)моль/моль ХТЗ от содержания ферментного препарата в растворе. Обращает на себя внимание тот факт, что значение константы Михаэлиса Кт, определенное графическим методом Лайнуивера-Берка (риск 24), составило «3,4 г/дл. Высокое значение Кт обусловлено, вероятно, тем, что гиалуронидаза не является специфическим для ХТЗ ферментом, а рН 1% раствора уксусной кислоты не соответствует рН-оптимуму действия гиалуронидазы. Значение максимальной скорости ферментативного гидролиза Vmax, определяющей максимальную возможность образования продукта реакции при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата, составило (0,5-1,51) 10 6 г/(дл мин).
Именно к такой схеме сводится механизм Михаэлиса-Ментен при низких концентрациях субстрата. При этом, зависимость скорости ферментативного гидролиза от концентрации субстрата на начальном этапе апроксимируется прямой с наклоном Vmax/Km. Для случая ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе 1% уксусной кислоты параметр VmaJKm составляет (0,15-0,44) 10"6 мин"1 (см. таблицу 9)
Добавление в раствор уксусной кислоты низкомолекулярных солей-сильных электролитов - хлорида и сульфата натрия сопровождается некоторыми изменениями в закономерностях ферментативного гидролиза. Главное, что обращает на себя внимание, это то, что характеристическая вязкость под действием фермента изменяется в этом случае в меньшей степени, чем в отсутствии НМЭ. Как следствие этого, имеет место изменение кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе уксусной кислоты - уменьшение Vmax и увеличение Кт. В результате уменьшается и значение Vma/Km, имеющее физический смысл константы скорости реакции. Таким образом, добавление НМЭ приводит к уменьшению скорости ферментативного гидролиза ХТЗ. Увеличение и без того большого значения Кт, свидетельствует об ухудшении сродства между ферментом и субстратом, очевидно вызванного некоторым поджатием макромолекулярного клубка (см.данные таблицы 9). Близкие значения полученных кинетических параметров Кт и VmaXy полученные для систем XT3-Na2SC 4 и ХТЗ-NaCl связаны очевидно с тем, что ионная сила 0,5 М раствора хлорида натрия и 0,2 М раствора сульфата натрия, одинакова.
Таким образом, вещества, представляющие собой НМЭ, в том числе и лекарственные препараты-антибиотики, способные оказывать влияние на конформационное состояние субстрата (см. табл. 9), по всей вероятности, способны оказать влияние на процесс протекания реакции ферментативного гидролиза ХТЗ.
Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты в присутствии лекарственного препарата - сульфата амикацина Кривые изменения характеристической вязкости ХТЗ в присутствии AM(S04)2 имеют вид, аналогичный тому, какой они имели для индивидуального ХТЗ. Однако, введение AM(S04)2 сказывается на скорости падения характеристической вязкости. Как видно из сравнений кривых рис. 20-22 и кривых (2) рис. 26-28, введение AM(S04)2 в раствор ХТЗ приводит к тому, что характеристическая вязкость под действием фермента изменяется в существенно меньшей степени, чем в отсутствии AM(S04)2.
Ферментативный гидролиз хитозана в пленках. Изучаемые системы - XT3M(S04)2-pacTBop фермента в растворе Рингера-Локка, XT3-NaUcD3- раствор фермента в растворе Рингера-Локка, ХТЗ-МаЦФТ-раствор фермента в растворе Рингера-Локка
Таким образом, изучение кинетических особенностей процесса ферментативного гидролиза хитозана, в том числе и в присутствии лекарственных препаратов, под действием неспецифического ферментного препарата гиалуронидазы, присутствующего на раневой поверхности организма человека и обладающегор-гликозиднойактивностью в хитозане, выявило некоторые общие физико-химические (кинетические) закономерности.
Полиэлектролитная природа хитозана приводит к тому, что увеличение ионной силы раствора, достигаемое при добавлении низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений, сказывается на конформационном состоянии макромолекул хитозана, а именно, на уменьшении размеров равновесных клубков и увеличении плотности упаковки звеньев. Об этом свидетельствуют уменьшение значений характеристической вязкости растворов хитозана, и констант в уравнении Марка-Куна-Хаувинка, определенные в присутствии низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений на примере антибиотиков. Важно то, что изменение конформационного состояния ХТЗ, вызывное присутствием низкомолекулярных электролитов, оказывает принципиально важное влияние на кинетику процесса ферментативного гидролиза хитозана, поскольку уменьшает доступность звеньев хитозана для взаимодействия с ферментом.
Установлено, что ферментативный гидролиз хитозана под действием гиалуронидазы может быть описан в рамках механизма Михаэлиса-Ментен. Значение максимальной скорости ферментативного гидролиза, определяющей максимальную возможность образования продукта реакции при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата, составило (0,5-1,51) 10 6 г/(дл мин). Значение константы Михаэлиса Кт составило 3,4 г/дл и является достаточно высоким, что обусловлено, вероятно, тем, что гиалуронидаза не является специфическим для хитозана ферментом, а рН 1% раствора уксусной кислоты не соответствует рН-оптимуму действия гиалуронидазы. Изменение кинетических параметров процесса, вызванное присутствием низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений-антибиотиков во всех изученных случаях сводится к уменьшению Vmax и увеличение Кт а также к уменьшению значений Vmax/Km, имеющего физический смысл константы скорости реакции. Увеличение и без того большого значения свидетельствует об ухудшении сродства между ферментом и субстратом, очевидно вызванного поджатием макромолекулярного клубка. При этом следует отметить, что уменьшение скорости ферментативного гидролиза происходит на фоне того, что выбранные соединения не оказывают влияния на общую активность гиалуронидазы.
Разработанный подход к изучению ферментативного гидролиза пленочных образцов хитозана и хитозана в смесях с лекарственным веществами-антибиотиками, представляющими собой низкомолекулярные органические соли, с учетом поверхностной концентрации звеньев хитозана, позволил выявить идентичность кинетических параметров ферментативного гидролиза пленок хитозана и параметров гидролиза аналогичных систем в растворе при малых концентрациях субстрата. Данный факт позволяет без изучения процесса ферментативного гидролиза в растворе получать достоверные результаты о кинетических параметрах процесса биодеструкции полимерного материала, анализируя только процесс ферментативного гидролиза пленок. Таким образом, несмотря на принципиально различную топологию изучаемых систем (раствор хитозана, пленка хитозана), показано, что кинетические закономерности процесса гидролиза хитозана в растворе при малых концентрациях субстрата и монолитных пленок хитозана, близки. Роль среды, в которой растворен ферментный препарат сказывается на численном значении параметра Vmax/Km. Например, при переходе от растворов ферментного препарата в уксусной кислоте к растворам в воде или в растворе Рингера Локка, происходит увеличение значения VmaJKm, поскольку повышение рН благоприятно сказывается на активности ферментного препарата. Однако, независимо от выбранной среды, закономерности, связанные с замедлением процесса ферментативного гидролиза хитозана в присутствии низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений-антибиотиков, имеют место во всех случаях. При этом наблюдается корреляция между конформационным состоянием хитозана, которое он имел в исходном растворе (значениями характеристической вязкости хитозана и параметра а в уравнении Марка-Куна-Хаувинка) и кинетическими параметрами процесса ферментативного гидролиза пленочных образцов хитозана (рис. 40)