Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
Введение 10
1.1. Физико-химические аспекты применения полимеров в медицине 11
1.1.1. Биостабильные полимеры 11
1.1.2.Биодеструктируемые полимеры 12
1.1.3.Важнейший представитель класса биодеструктируемых полимеров хитозан 15
1.2. Деструкция полимеров 17
1.2.1. Гидролитическая деструкция полимеров 18
1.2.4. Общие закономерности деструкции некоторых полимеров медицинского назначения 22
1.2.5. Основные закономерности деструкции хитозана 32
1.3. Описание кинетики ферментативных реакций 36
1.3.1. Ранние исследования описания кинетики ферментативных реакцийЗб
1.3.2. Модель Михаэлиса-Ментен 38
1.3.3. Кинетические параметры ферментативного гидролиза хитозана 43
1.3.4. Влияние различных физико-химических факторов на кинетические параметры ферментативной реакции 47
Заключение по литературному обзору 58
2. Экспериментальная часть 62
2.1. Характеристика исходных веществ и реагентов 62
2.2. Методика эксперимента 65
2.2.1. Приготовление растворов хитозана 65
2.2.2. Приготовление пленок хитозана 66
2.2.3. Определение плотности хитозановых пленок 66
2.2.4. Методика фракционирования хитозана 67
2.2.5. Определение молекулярной массы фракций хитозана методом скоростной седиментации 67
2.2.6. Определение характеристической вязкости хитозана в растворе 69
2.2.7. Определение констант в уравнении Марка-Куна-Хаувинка 71
2.2.9. Определение скорости ферментативного гидролиза хитозана в растворе 72
2.2.10. Проведение ферментативного гидролиза хитозана в пленках 74
2.2.11. Определение параметров Кт и Vmax в уравнении Михаэлиса-Ментен для процесса ферментативного гидролиза хитозана 74
2.2.12. Определение Р-гликозидазной активности гиалуронидазы феррицианидным методом 75
2.2.13. Изучение УФ-спектров растворов хитозана 75
2.2.14. Обработка результатов измерений 76
3. Обсуждение результатов 77
3.1. Ферментативный гидролиз хитозана в растворе 81
3.1.1. Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты. 82
3.1.2. Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты в присутствии лекарственного препарата - сульфата амикацина 89
3.2. Ферментативный гидролиз хитозана в пленках, полученных из раствора в уксусной кислоте 98
3.2.1. Ферментативный гидролиз хитозана в пленках. Системы: ХТЗ-раствор фермента в 1% уксусной кислоте и XT3-AM(S04)2-pacTBop фермента в 1% уксусной кислоте 98
3.2.2. Ферментативный гидролиз хитозана в пленках, полученных из раствора в уксусной кислоте. Изучаемые системы - ХТЗ-раствор фермента в воде и растворе Рингера-Локка и XT3-AM(S04)2-pacTBop фермента в воде и растворе Рингера-Локка 107
3.2.3. Ферментативный гидролиз хитозана в пленках. Изучаемые системы XT3M(S04)2-pacTBop фермента в растворе Рингера-Локка, XT3-NaUcD3 з
раствор фермента в растворе Рингера-Локка, ХТЗ-МаЦФТ-раствор
фермента в растворе Рингера-Локка ПО
Заключение 115
Выводы 119
Список литературы 121
- Биостабильные полимеры
- Кинетические параметры ферментативного гидролиза хитозана
- Определение молекулярной массы фракций хитозана методом скоростной седиментации
- Ферментативный гидролиз хитозана в пленках, полученных из раствора в уксусной кислоте
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время для решения медико-биологических задач востребованы самые разнообразные полимерные материалы. Например, биоинертные, биостабильные материалы, не изменяющие своих характеристик в процессе эксплуатации. С другой стороны, необходимы биоассимилируемые полимеры, которые, напротив, должны растворяться под действием ферментов организма человека с образованием нетоксичных продуктов. Такие полимеры могут быть использованы для создания полимерных лекарственных форм с контролируемым выходом препаратов и регулируемой скоростью биодеструкции, специализированных материалов для адресной доставки в орган-мишень, создания временных заместителей тканей в реконструктивной хирургии и др. Скорость биодеструкции полимерного материала играет при этом ключевую роль, поскольку не только определяет срок службы материала, но и контролирует скорость высвобождения лекарственного вещества в случае использования полимерных лекарственных форм.
Синтетические полимерные материалы, например, полиметилметакрилат, полиэтилентерефталат и др., разрушаются в организме человека крайне медленно. Природные полимеры животного происхождения, такие как коллаген или гиалуроновая кислота, напротив, разрушаются слишком быстро, поскольку в организме человека присутствуют ферменты, специфически расщепляющие эти полимеры.
Решением данной проблемы может стать использование таких природных полимеров, например, на основе хитозана (ХТЗ), для биодеструкции которых в организме человека нет специфических ферментов, и, следовательно, скорость деструкции материалов на основе этого полимера в организме будет ниже, чем биополимеров животного происхождения.
Работ, посвященных процессам ферментативного превращения ХТЗ достаточно много. Однако в подавляющем большинстве работ, процесс ферментативного гидролиза ХТЗ рассмотрен лишь на качественном уровне. Работ по определению количественных характеристик процесса ферментативного гидролиза ХТЗ под действием неспецифических ферментов, тем более в виде пленочного материала для медицинского применения, фактически нет. Равно как нет и работ, в которых было бы рассмотрено влияние лекарственных соединений на процесс ферментативного превращения ХТЗ.
В связи с этим, изучение кинетических закономерностей процесса ферментативного гидролиза ХТЗ, в том числе в присутствии лекарственного соединения, под действием неспецифического ферментного препарата, присутствующего в организме человека, например, гиалуронидазы, способной вызвать распад В-гликозидной связи в ХТЗ, представляется важной задачей, как с научной, так и с практической точек зрения.
Работа выполнена при поддержке государственного задания Минобрнауки России «Научные основы создания биодеградируемых пленочных систем на основе хитозана для регулируемого транспорта лекарственных препаратов» № 107.13; гранта РФФИ и Республики Башкортостан (грант рповолжьеа № 11-03-97016); Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (проект по госконтракту № 02.740.11.0648 на 2010-2012 гг. и проект по заявке 2012-1.1-12-000-1015-027 (соглашение № 8444, утв. 31.08.2012 г.) на 2012-2012 гг.), государственного задания Минобрнауки России по научно-исследовательской работе № 2687 в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности по заданию № 2014/7.
Целью работы является установление кинетических закономерностей процесса ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе и в пленках в отсутствии и в присутствии некоторых антибиотиков аминогликозидного ряда (амикацина и гентамицина) и цефалоспоринового ряда (цефазолина и цефатоксима), являющихся низкомолекулярными электролитами (НМЭ).
Задачи работы:
определение кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе под действием фермента гиалуронидазы;
установление влияния некоторых электролитов (в том числе антибиотиков), на кинетические параметры процесса ферментативного гидролиза ХТЗ;
изучение кинетических закономерностей ферментативного гидролиза пленочных хитозановых материалов, полученных из раствора;
установление физико-химических способов регулирования скорости биоразложения полимерной матрицы-носителя лекарственного соединения.
Научная значимость работы. В ходе диссертационного исследования впервые:
описан процесс ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе под действием неспецифического фермента гиалуронидазы в отсутствии и в присутствии некоторых антибиотиков аминогликозидного и цефалоспоринового ряда в рамках схемы Михаэлиса-Ментен и рассчитаны кинетические параметры процесса -значения константы Михаэлиса Кт, максимальной скорости гидролизаКтш: и отношения Vmax/Km, представляющего собой константу скорости ферментативного гидролиза при малых концентрациях субстрата;
показано, что влияние НМЭ, в том числе лекарственных соединений (антибиотиков), представляющих собой НМЭ, на процесс ферментативного гидролиза ХТЗ состоит в снижении Vmax и увеличении Кт;
доказано, что количественные закономерности ферментативного гидролиза пленочного материала на основе ХТЗ, моделируются закономерностями ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе.
Практическая значимость работы. Установлено, что в качестве физико-химического способа уменьшения скорости ферментативного гидролиза ХТЗ, с целью увеличения срока службы пленочного материала на раневой поверхности, может быть использовано введение в пленочный материал НМЭ, в том числе и лекарственных соединений, вызывающих уменьшение размеров макромолекулярного клубка и соответственное уменьшение доступности звеньев ХТЗ для взаимодействия с ферментом. Найденные в работе закономерности ферментативного гидролиза ХТЗ и влияния на скорость этого процесса некоторых лекарственных соединений-антибиотиков могут быть востребованы при создании лекарственных покрытий для защиты раневых поверхностей различной этиологии.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XXII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит-2014), Пермь, 2014; XX Международном научном форуме «Ломоносов-2013», Москва, 2013; XXI Международном научном форуме «Ломоносов-2014», Москва, 2014; XXII Международном научном форуме «Ломоносов-2015», Москва, 2015; VI Международной школе-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании», Уфа, 2013; VII Международной школе-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании»,
Уфа, 2014; IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии, Уфа-Абзаково, 2013; X Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии, Уфа-Абзаково, 2015; Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования», Уфа, 2013; Всероссийской научной конференции «Теоретические и экспериментальные исследования процессов синтеза, модификации и переработки полимеров», Уфа, 2013.
Публикации. По материалам работы опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах, 11 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.
Авторский вклад. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах исследования. Все приведенные в диссертации экспериментальные результаты получены автором лично либо при его участии.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 240 источников. Работа включает 17 таблиц и 40 рисунков.
Биостабильные полимеры
Биостабильные полимеры на основе синтетических полимеров имеют массу достоинств. Как правило, их стоимость ниже стоимости полимеров природного происхождения, они легко перерабатываются, для них не возникает трудностей с производством материалов с воспроизводимыми и контролируемыми свойствами. Однако большим недостатком синтетических материалов является их, иногда непредсказуемое, взаимодействие с клетками и компонентами иммунной системы пациента, проявление негативных реакций (воспалительная и аллергическая реакции) организма на возможные продукты взаимодействия сред человеческого организма и полимеров, а также возможное проявление канцерогенных свойств.
Главные направления использования биодеструктируемых полимеров включают в себя создание рассасывающихся шовных материалов [7,22], имплантов для временного замещения сосудов, суставов, костей и т.д. [23,24], использование в терапии дефектов мягких тканей [25-28], в качестве основы для создания новых лекарственных форм [29,30], в том числе - с пролонгированной доставкой лекарственного вещества. Основными физико-химическими характеристиками, которыми должны обладать такие полимеры, являются: - сочетание строения и структуры, обеспечивающих возможность протекания процесса деструкции; - способность к сорбции воды и интенсивность диффузии в их объем окружающей водной среды [9]; - способность образовывать при деструкции под влиянием сред организма нетоксичные продукты, ассимилируемые тканями; соответствие скорости деструкции полимера и скорости регенерации тканей организма, которая может составлять от нескольких недель (при протезировании мягких тканей) до нескольких месяцев (при протезировании костных тканей).
Среди биодеструктируемых полимеров можно отметить несколько наиболее перспективных. Это синтетические полимеры, например поликапроамид и полиэтилентерефталат, полимеры гидроксикарбоновых кислот - полигликолиды, полилактиды и их сополимеры, которые входят в группу алифатических сложных полиэфиров [31], а также полимеры животного и растительного происхождения, такие как коллаген, фибрин, гиалуроновая кислота, целлюлоза, пектин и др.
Полилактиды применяются в качестве материала для подкожных имплантов [32], входят в состав биологически совместимых полимерных композиций [33], композиций для контролируемой доставки лекарственных веществ [34-38]. Известны случаи применения полигликолидов в качестве шовных волокон [9]. Главные причины осложнений при использовании синтетических биодеструктируемых материалов из полилактидов и полигликолидов - закисление тканей, возможные воспалительная и аллергическая реакции организма на продукты деструкции таких полимеров [21].
Коллаген используют качестве остеокондуктивного материала [39], в композиции для терапии дефектов мягких тканей [40,41]; для реконструирования хрящевой ткани [42]; материал для биотрансплантатов для коррекции дефектов мягких тканей [43]. Кроме того, известны композиции для лечения ожоговых и хирургических ран [44].
Гиалуроновая кислота используется в медицине при офтальмологических операциях, в ортопедии и в косметологии, входит в состав композиций для профилактики образования послеоперационных шрамов, спаек и келоидов [45-48]. Фибрин - в виде материалов различной формы: в виде порошка - в качестве гемостатического агента для обработки ран, в составе пломбирующих композиций - для заполнения дефектов костей; в виде фибриновой пены - в качестве гемостатического и пломбирующего средства; в виде пленки - в качестве покрытий для кожных поражений [9].
Пектин может быть использован в составе пролонгированных лекарственных форм [49-51]. Алъгинаты примеряются для лечения пародонтита и воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта [52], для получения композитной смеси при лечении рака прямой кишки [53], при получении микрокапсул, содержащих живые клетки для алло- или ксенотрансплантации [54], также в составе антимикробной гемостатической губки [55]. Целлюлоза используется для получения многослойного материала для местного лечения ран и ожогов [56], субмикронной суспензии для офтальмологического и назального применения [57], в составе энтеросорбента [58], в эндоскопической хирургии [59], в качестве материала матрицы для биосовместимого композита для содействия регенерации и/или восстановлению тканей или костей [60], в качестве компонента фармацевтической композиции для пероральной доставки противоопухолевых препаратов [61] и т.д.
Кинетические параметры ферментативного гидролиза хитозана
Примеров проявления конкурентного ингибирования достаточно много. Например, такой тип ингибирования описан в работе [196], в которой установлено, что в реакции получения некоторых птериновых соединений (L-трео-неоптерина и изоксантптерина) из гуанозин-5 -трифосфата в роли конкурентного ингибитора GTP-циклогидролазы может выступать гуанозинтрифосфат.
Авторы [195] установили, что диальдегидные производные циклодекстрина способны конкурентно ингибировать различные формы амилазы (Р-амилаза и глюкоамилаза). Тирозин, меланин ингибируют на конкурентной основе трансглютаминазу в реакции сшивания белков [197]. Опре деление кинетических параметров реакции проводили с помощью трансформации Лайнуивера-Берка.
В работе [198] также с помощью графиков двойных обратных координат Лайнуивера-Берка установили, что добавление синтезированного авторами лиганда вызывает конкурентное ингибирование тирозиназы грибкового происхождения, которая играет важную роль в синтезе меланина.
В реакции ферментативного гидролиза хитина под действием хитиназы, полученной из красного морского леща Pagrus major, добавление аллозамидина вызывает ингибирование, которое также было определено с помощью оценки изменение количественных параметров реакции до и после введение ингибитора, как конкурентное [199-202].
Случай, для которого характерно изменение Vmax и Кт в одинаковой степени, называется бесконкурентным ингибированием. Соответственно соотношение VmaJKm остается постоянным. Бесконкурентное ингибирование также можно описать с помощью схемы Боттса-Моралеса (рисунок 13), если допустить, что не происходит образования формы EI, а форму EIS рассматривать как «тупиковый комплекс». Это означает, что центр, связывающий ингибитор, становится доступным только после того, как свяжется субстрат.
Примером бесконкурентного ингибирования может служить щавелевая кислота, выступающая в роли ингибитора расщепления Са-Ср связей вератрилглицерола, катализируемого лигнин-пероксидазой [203]. Также при сравнение кинетических параметров реакции, полученных с помощью метода Лайнуивера-Берка, в отсутствии и присутствии продуктов окисления катехина, авторы [204] показали, что в данном случае имеет место бесконкурентное ингибирование Р-гликозидазной активности (Amygdalae dulces). Авторы [205] констатировали случай бесконкурентного ингибирования ферментной активности трипсина меланоидином. Если в ходе ферментативной реакции при варьировании концентрации ингибитора происходит изменение как величины Vmax, так и величины Vmax/Km, то такой случай называется смешанным ингибированием. Этот тип ингибирования также укладывается в схему Боттса-Моралеса, если форма EIS не распадается с образованием продуктов и если все реакции связывания можно рассмотреть как равновесные. В этом случае Kt есть константа диссоциации для комплекса EI.
В качестве примера ингибирования смешанного типа, можно привести работу [206], в которой исследовали кинетические характеристики P-D-фруктофуранозидазы для определения механизма действия биоцидов этония и мертиолата. Установлено, что этоний является неконкурентным ингибитором, а мертиолат ингибитором смешанного типа.
Тип ингибирования может быть легко установлен графическими методами (рис. 15). Например, если построены графики зависимости s/v от s в отсутствии и присутствии ингибитора, при наличии конкурентной составляющей в эффекте ингибирования добавление ингибитора приводит к изменению величины отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат (Km/Vmax), а при наличии бесконкурентной составляющей - к изменению наклона. С другой стороны, если построены прямые, отображающие зависимость Vmax от Кт то смещение точки пересечения характеризует тип ингибирования: для конкурентного ингибирования точка пересечения смещается вправо (рис. 15 а), для бесконкурентного она смещается по направлению к началу координат (рис. 15 б), а для смешанного ингибирования характер смещения точки пересечения промежуточный (рис. 15 в) [161].
Определение молекулярной массы фракций хитозана методом скоростной седиментации
Обращает на себя внимание тот факт, что значения констант Марка-Куна-Хаувинка и характеристической вязкости ХТЗ различны в случае использования одинаковых мольных соотношений сульфата и хлорида амикацина. В данном случае двухзарядный анион (сульфат) оказывает несколько большее влияние на конформационное состояние ХТЗ, нежели однозарядный хлорид, что вполне понятно. Полученные данные говорят о том, что добавление исследуемых антибиотиков, представляющих собой низкомолекулярные электролиты в раствор ХТЗ во всех случаях приводит к уменьшению значения параметра а и [rj] (размера макромолекулярного клубка) и увеличению параметра К. При этом, чем больше соотношение ХТЗ:НМЭ, тем значительнее уменьшение размеров макромолекулярного клубка.
То, что рассмотренные соли представляют собой лекарственные препараты-антибиотики, не имеет принципиального значения с точки зрения их влияния на конформационное состояние ХТЗ. Точно такое же действие оказывает добавление любых солей, повышающих ионную силу раствора. Например, если к раствору ХТЗ в уксусной кислоте добавить такое количество хлорида или сульфата натрия, чтобы ионная сила добавляемых солей совпала с исследованными уже нами растворами антибиотиков, можно ожидать близких эффектов. Например, 0,05 М раствор АМ О имеют такую же ионную силу как 0,2 М раствор сульфата и 0,5 М раствор хлорида натрия. Из данных таблицы9 отчетливо видно, что значения коэффициентов в уравнении Марка-Куна-Хаувинка и значения характеристической вязкости ХТЗ имеют в этом случае близкие значения. Понижение концентрации низкомолекулярных солей и в этом случае сопровождается увеличением значения характеристической вязкости и параметра а.
Таким образом, изменение конформационного состояния ХТЗ, имеющее место при добавлении к его раствору низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений (антибиотиков), необходимо принимать во внимание при определении скорости ферментативного гидролиза, поскольку связь характеристической вязкости с молекулярной массой в случае систем ХТЗ-НМЭ-растворитель будет уже не такая, как в исходной системе ХТЗ-растворитель.
Важно то, что влияние ионной силы раствора, изменяющейся вследствие введения НМЭ проявляется не только в области больших разбавлений, при которых определяется характеристическая вязкость, но и в области полуразбавленных растворов. Об этом свидетельствуют меньшие значения относительной вязкости растворов ХТЗ-НМЭ в уксусной кислоте, вызванных поджатием макромолекулярного клубка по сравнению с растворами индивидуального ХТЗ (рис. 19).
Зависимость относительной вязкости растворов хитозана от его содержания в растворе для систем ХТЗ-уксусная кислота (7), ХТЗ-AM(S04)2 (2), ХТЗ-МаЦФЗ (3) и ХТЗ-NaCl (4). Содержание AM(S04)2 в растворе составляло ОДмоль на моль XT3;NaUcD3 - ОДмоль на моль ХТЗ; а
Ферментативный гидролиз хитозана в растворе Поскольку ферментативный гидролиз ХТЗ является обычной ферментативной реакцией, логично допустить, что данный процесс должен описываться в рамках подхода Михаэлиса-Ментен, что ставит задачу установления зависимости начальной скорости ферментативного гидролиза от концентрации субстрата (ХТЗ) в растворе.
Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты При изучении ферментативного гидролиза ХТЗ задача определения начальной скорости процесса сводится к определению изменений во времени значений характеристической вязкости полимера, происходящих вследствие разрыва макроцепей ХТЗ под влиянием ферментного препарата. Зависимости изменения характеристической вязкости от времени при ферментативном гидролизе ХТЗ в растворе различной концентрации, представлены на рис. 20-22.
Как видно, с увеличением времени выдержки раствора ХТЗ с ферментом, вязкость закономерно уменьшается, что свидетельствует об уменьшении молекулярной массы ХТЗ. Наиболее значительное падение вязкости происходит в начальном периоде. Дальнейшая ферментативная экспозиция раствора ХТЗ, сказывается на степени падения вязкости существенно в меньшей степени, т.е. скорость реакции уменьшается со временем. Такой ход кинетической кривой характерен для большинства ферментативных реакции. Для всех изучаемых растворов ХТЗ при небольших временах гидролиза кривые уменьшения характеристической вязкости носят линейный характер. Именно на этом участке определено значение начальной скорости ферментативного гидролиза Vo, служащей мерой ферментативной активности фермента по отношению к ХТЗ.
Как показали проведенные исследования, наблюдаемые зависимости начальной скорости ферментативного гидролиза от концентрации субстрата могут быть описаны в рамках схемы Михаэлиса-Мэнтен.
На рис. 23 представлена зависимость начальной скорости от концентрации ХТЗ в растворе. Из данных рисунка видно, что кривые имеют классический вид и представляет собой часть равнобочной гиперболы.
Как видно из представленных в табл. 10 данных, значение константы Михаэлиса Кт является величиной практически постоянной, не зависящей от концентрации фермента и характеризующей сродство данного фермента к субстрату. Значение Vmax дает характеристику каталитической активности фермента, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта реакции при данной концентрации фермента при условии избытка субстрата. При проведении реакции в условиях избытка субстрата, максимальная скорость реакции линейным образом зависит от концентрации фермента (рис. 25).
Ферментативный гидролиз хитозана в пленках, полученных из раствора в уксусной кислоте
Таким образом, изучение кинетических особенностей процесса ферментативного гидролиза хитозана, в том числе и в присутствии лекарственных препаратов, под действием неспецифического ферментного препарата гиалуронидазы, присутствующего на раневой поверхности организма человека и обладающегор-гликозиднойактивностью в хитозане, выявило некоторые общие физико-химические (кинетические) закономерности.
Полиэлектролитная природа хитозана приводит к тому, что увеличение ионной силы раствора, достигаемое при добавлении низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений, сказывается на конформационном состоянии макромолекул хитозана, а именно, на уменьшении размеров равновесных клубков и увеличении плотности упаковки звеньев. Об этом свидетельствуют уменьшение значений характеристической вязкости растворов хитозана, и констант в уравнении Марка-Куна-Хаувинка, определенные в присутствии низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений на примере антибиотиков. Важно то, что изменение конформационного состояния ХТЗ, вызывное присутствием низкомолекулярных электролитов, оказывает принципиально важное влияние на кинетику процесса ферментативного гидролиза хитозана, поскольку уменьшает доступность звеньев хитозана для взаимодействия с ферментом.
Установлено, что ферментативный гидролиз хитозана под действием гиалуронидазы может быть описан в рамках механизма Михаэлиса-Ментен. Значение максимальной скорости ферментативного гидролиза, определяющей максимальную возможность образования продукта реакции при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата, составило (0,5-1,51) 10 6 г/(дл мин). Значение константы Михаэлиса Кт составило 3,4 г/дл и является достаточно высоким, что обусловлено, вероятно, тем, что гиалуронидаза не является специфическим для хитозана ферментом, а рН 1% раствора уксусной кислоты не соответствует рН-оптимуму действия гиалуронидазы. Изменение кинетических параметров процесса, вызванное присутствием низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений-антибиотиков во всех изученных случаях сводится к уменьшению Vmax и увеличение Кт а также к уменьшению значений Vmax/Km, имеющего физический смысл константы скорости реакции. Увеличение и без того большого значения свидетельствует об ухудшении сродства между ферментом и субстратом, очевидно вызванного поджатием макромолекулярного клубка. При этом следует отметить, что уменьшение скорости ферментативного гидролиза происходит на фоне того, что выбранные соединения не оказывают влияния на общую активность гиалуронидазы.
Разработанный подход к изучению ферментативного гидролиза пленочных образцов хитозана и хитозана в смесях с лекарственным веществами-антибиотиками, представляющими собой низкомолекулярные органические соли, с учетом поверхностной концентрации звеньев хитозана, позволил выявить идентичность кинетических параметров ферментативного гидролиза пленок хитозана и параметров гидролиза аналогичных систем в растворе при малых концентрациях субстрата. Данный факт позволяет без изучения процесса ферментативного гидролиза в растворе получать достоверные результаты о кинетических параметрах процесса биодеструкции полимерного материала, анализируя только процесс ферментативного гидролиза пленок. Таким образом, несмотря на принципиально различную топологию изучаемых систем (раствор хитозана, пленка хитозана), показано, что кинетические закономерности процесса гидролиза хитозана в растворе при малых концентрациях субстрата и монолитных пленок хитозана, близки. Роль среды, в которой растворен ферментный препарат сказывается на численном значении параметра Vmax/Km. Например, при переходе от растворов ферментного препарата в уксусной кислоте к растворам в воде или в растворе Рингера Локка, происходит увеличение значения VmaJKm, поскольку повышение рН благоприятно сказывается на активности ферментного препарата. Однако, независимо от выбранной среды, закономерности, связанные с замедлением процесса ферментативного гидролиза хитозана в присутствии низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений-антибиотиков, имеют место во всех случаях. При этом наблюдается корреляция между конформационным состоянием хитозана, которое он имел в исходном растворе (значениями характеристической вязкости хитозана и параметра а в уравнении Марка-Куна-Хаувинка) и кинетическими параметрами процесса ферментативного гидролиза пленочных образцов хитозана (рис. 40)