Введение к работе
Актуальность проблемы
Влияние, которое растворитель оказывает на химические реакции, протекающие в растворах, в течение многих десятилетий является одной из фундаментальных проблем физической химии. Первоначально внимание исследователей было преимущественно сконцентрировано на равновесных эффектах растворителя, таких как изменение потенциальной энергии реагентов и продуктов реакции по сравнению с их энергиями в газовой фазе. Однако, в последние годы стало ясно, что во многих быстрых реакциях динамика растворителя может иметь критическое значение для их протекания. Наиболее ярко динамический эффект растворителя проявляется в реакциях с переносом заряда. Быстрота, с которой растворитель откликается на перераспределение заряда в реакционной системе, может оказывать влияние как на скорость, так и на выход реакции. Существующие на сегодняшний день теории неравновесной сольватации развиты для процессов в чистых, однородных растворителях. На практике большая часть химических реакций протекает в многокомпонентных растворах. Поэтому экспериментальное исследование многокомпонентных растворов является пока основным источником получения информации о молекулярной динамике таких сложных и гетерогенных систем, как переохлажденные жидкости, стекла и белки. Метод регистрации разрешенного во времени стоксова сдвига спектра люминесценции зонда, входящего в состав сложных, гетерогенных систем, позволяет изучать релаксационные процессы в этих системах в широком интервале времен от 10й до 10: с.
Стекла и переохлажденные жидкости образуют класс веществ широко распространенных в природе. В стеклообразном или
переохлажденном состоянии могут находиться различные материалы: полимеры, сплавы металлов, коллоиды, эмульсии, биологические макромолекулы - белки, многие органические жидкости и т.д. Таким образом, исследование структурных и динамических свойств стекол и переохлажденных жидкостей представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных знаний, а также для решения разнообразных прикладных задач.
Природные биополимеры - белки представлены во всех формах жизни и выполняют широкий набор функций, в частности, катализируют различные химические реакции. Изучение ферментативных систем направлено, с одной стороны, на выяснение детального механизма каталитического процесса, а, с другой стороны, на создание искусственных модельных систем, обладающих столь же высокой каталитической активностью и субстратной специфичностью, что и природные ферменты. Последние годы интенсивно исследуется проблема связи динамических свойств белков с их функциональной активностью. Различными методами получены данные, подтверждающие тесную корреляцию конформационной подвижности белков с эффективностью осуществляемых ими функций. Развитие новых подходов в исследованиях природы высокой функциональной эффективности биополимеров позволит приблизиться к решению задачи по созданию столь же эффективных модельных систем. Цель работы
Основной целью данной работы было исследование динамических свойств вязких полярных растворителей и белков, определение возможной корреляции между внутри молекулярной динамикой белков и осуществляемыми ими функциями. Используемые методы: кинетическая фосфоресцентная спектроскопия и регистрация кинетики термической
изомеризации фотохрома, ассоциированного с белком, позволяют проводить одновременное изучение медленной молекулярной динамики и кинетики химических превращений, осуществляемых в одной и той же системе.
Работа проводилась по следующим направлениям:
1. Определение динамических характеристик бинарных вязких
полярных стеклующихся растворителей в широком диапазоне температур
(103-262 К).
2. Исследование динамической подвижности гемсодержащих белков
и ее влияния на реакцию внутримолекулярного переноса электрона
методом кинетической фосфоресцентной спектроскопии.
3. Создание модельных ферментативных систем на основе
небольших глобулярных гембелков и детальное исследование зависимости
их функций от различных факторов и, прежде всего, от конформационной
динамики.
Научная новизна работы
С использованием метода кинетической фосфоресцентной спектроскопии изучена динамика ориентационнои релаксации в низкотемпературных стеклующихся полярных глицерино-водных и этиленгликоль-водных растворах в широком диапазоне температур. Показано существование широкого распределения времен релаксации в исследованных переохлажденных жидкостях. Отработаны методики определения параметров распределений времен релаксации для систем с гетерогенной динамикой.
Получены данные, свидетельствующие о гетерогенной структуре глицериновых растворов. Сделана оценка масштабов и динамики реструктуризации гетерогенных областей в 94% глицерино-водном растворе при 237 К.
Изучена молекулярная динамика и кинетика реакции внутримолекулярного переноса электрона в комплексе эозин-метмиоглобин и показана возможность адиабатического механизма реакции переноса электрона в данной системе при низких температурах.
Обнаружено и исследовано каталитическое действие миоглобина на реакцию термической цис -> транс изомеризации мероцианинового красителя, бетаина стильбазола М. На основе этой реакции предложена простая модельная ферментативная система, позволяющая изучать влияние различных факторов на процессы биологического катализа.
Разработан новый подход, основанный на ускорении термической цис -* транс изомеризации бетаина стильбазола в присутствии некоторых гембелков, для оценки масштабов и времен медленной, глобальной конформационной динамики этих белков. Практическая значимость работы
В результате проделанной работы получены количественные данные, характеризующие гетерогенную динамику низкотемпературных, стеклующихся водных растворов глицерина и этиленгликоля. Обнаруженные в этих системах структурная неоднородность и возможность существования нескольких фаз при одинаковых условиях имеют важное значение для понимания процессов, протекающих в стеклах и переохлажденных жидкостях.
На основе метода регистрации динамического стоксова сдвига фосфоресценции эозина отработана методика определения релаксационных параметров локального окружения в таких микрогетерогенных системах, как глобулярные гемсодержащие белки.
Предложена простая модельная ферментативная система на основе комплекса миоглобин - бетаин стильбазола. Эта система позволяет исследовать влияние большого набора факторов, таких как рН и ионная
сила среды, температура, вязкость, структура активного центра, природа иона металла, конформационная динамика на каталитическую активность белка.
На основании эффекта ускорения некоторыми гемсодержащими белками термической изомеризации бетаина стильбазола развита методика изучения медленной, крупномасштабной конформационной динамики этих белков. Личный вклад автора
В диссертации представлены результаты работы, выполненной лично автором по ряду научно-исследовательских проектов, связанных с изучением молекулярной динамики в гетерогенных системах низкотемпературных, вязких стеклующихся растворах и белках - методами кинетической фосфоресцентной спектроскопии и изомеризующихся зондов. Автор непосредственно участвовал в обосновании и постановке основной части экспериментов, их проведении и в обобщении результатов исследований. Апробация работы и публикации
Результаты работы докладывались на 7-й Международной конференции по бионеорганичексой химии, Любек, Германия, 1995 (Seventh International Conference on Bioinorganic Chemistry, September 3-8, 1995, Lubeck, Germany); 3-й Европейской конференции по бионеорганичексой химии, Нордвиджкерхоут, Голландия, 1996 (3rd European Conference on Bio-inorganic Chemistry, August 4-10, 1996, Noordwijkerhout, the Netherlands); 5-й Международной конференции по методам и приложениям флуоресцентной спектроскопии, Берлин, Германия, 1997 (Vlh International Conference on Methods and Applications of I luorescence Spectroscopy, September 21-24, 1997, Berlin, Germany); на Всероссийском совещания «Высокоорганизованные каталитические
системы», 9-10 июня 1998, Черноголовка, Россия; на 2 Съезде биофизиков России, 23-27 августа, 1999 г, Москва, Россия; на 2 Всероссийском научном совещании «Высокоорганизованные каталитические системы», 2000 г, Москва, Россия.
Кроме того, содержание работы докладывалось на заседаниях Ученого совета ИПХФ РАН, научных семинарах ИПХФ РАН и отдела Кинетики и Катализа. Основные результаты диссертации опубликованы в 7 статьях. Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 138 страницах, состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и содержит 36 рисунков, 5 таблиц. Список литературы включает 143 наименования.