Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние в области Использования ISFET в качестве преобразователя сигнала для химических сенсоров 9
1.1 Конструкция ISFET 9
1.2 Теоретические основы функционирования ISFET 13
1.3 ISFET в качестве чувствительного элемента систем для экспресс-диагностики 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1 Материалы 41
2.2 Методы 41
ГЛАВА 3. Исследование изменения электрохимического потенциала в ходе ферментативной реакции в гомогенной системе 49
3.2 Изучение ферментативной реакции, катализируемой нитроредуктазой из E.coli, в гомогенной системе 56
3.2.1 Исследование нитроредуктазы из E.coli 56
3.2.2 Описание модельной системы для измерения профилей каталитических реакций 66
3.2.3 Механизм восстановления нитрогруппы в процессе катализа нитроредуктазой из E.coli 74
ГЛАВА 4. Разработка биосенсора для экспресс-анализа на основе гетерогенной микросистемы 85
4.1 Функционализация поверхности 85
4.2 Исследование параметров биосенсора для экспресс-анализа на основе гетерогенной
Выводы
- Теоретические основы функционирования ISFET
- ISFET в качестве чувствительного элемента систем для экспресс-диагностики
- Исследование нитроредуктазы из E.coli
- Исследование параметров биосенсора для экспресс-анализа на основе гетерогенной
Теоретические основы функционирования ISFET
Практически сразу после демонстрации первого ион-чувствительного полевого транзистора было показано, что чувствительность транзистора к изменению рН раствора напрямую связана с поведением заряда на поверхности оксида металла или неметалла, взаимодействующего с жидкостью [14]. В коллоидной химии до сих пор не существует однозначной устоявшейся теории, позволяющей интерпретировать экспериментальные данные поведения заряда на границе раздела фаз электролит - твердое тело. Все существующие физические модели, описывающие явления на поверхности оксидов металлов и воды, в настоящее время являются комбинациями моделей двойного электрического слоя и моделей адсорбции протонов на поверхности. В этом разделе в рамках теоретических моделей описываются процессы, происходящие при изменении рН на поверхности наиболее распространенного в ранних работах подзатворного диэлектрика - оксида кремния.
Основное уравнение для выражения тока стока в ненасыщенной области ISFET имеет вид [9]: где /U - средняя подвижность электронов в канале; WnL- ширина и длина канала; Eref -вклад электрода сравнения; VDS и VGS - напряжения на истоке и затворе, соответственно; Фя. - работа выхода; q - элементарный заряд; Сох - емкость затворного окисла; Qox, Qss и QB - локальные заряды в поверхностном и пограничных состояниях и обедненном слое, соответственно; %sl - дипольный поверхностный потенциал раствора, и ф/ потенциальная разница между уровнями Ферми легированного и нелегированного кремния.
Все входящие в выражение параметры, за исключением поверхностного электрохимического потенциала г//0 и поверхностного дипольного потенциала %so\ являются постоянными при измерении показателя рН раствора. При этом %so не зависит от рН, и, таким образом, изменение тока стока связано непосредственно только с изменением электрохимического потенциала на поверхности г//0.
Из-за короткого времени отклика и наблюдаемой чувствительности ниже 59,2 мВ/рН был сделан вывод, что поверхностные процессы полностью должны определять основной механизм чувствительности сенсора [15]. Во время реакции на поверхности оксида появляется некоторый суммарный заряд, который приводит к образованию электрохимического потенциала у/0 на границе раздела оксид - электролит. Этот потенциал связан с перераспределением протонов вблизи поверхности согласно уравнению Больцмана: абсолютная температура. Индексы «S» и «В» относятся к поверхности и раствору соответственно. Способность поверхности сохранять заряд при малых изменениях концентрации Н+ на поверхности связано напрямую с собственной буферной емкостью поверхности где а0 - заряд поверхности на единицу площади, [А] - количество заряженных групп, определяемое количеством отрицательно заряженных групп за вычетом положительно заряженных групп на единицу площади. Буферная емкость nt называется собственной емкостью из-за того, что может сохранять небольшие изменения в локальном поверхностном рН (pHs), но не во всем растворе рН (рНв) [16].
Для компенсации заряда напротив заряженной поверхности со стороны электролита выстраивается слой из контрионов противоположного заряда, формируя двойной электрический слой. Заряд двойного электрического слоя aDL можно оценить через произведение интегральной емкости двойного электрического поля С. и электрохимического потенциала: JDL = —Cti//0 = — т0. (5)
Интегральная емкость используется в дальнейшем при выводе конечного выражения чувствительности ISFET к изменению рН. Способность раствора электролита корректировать количество находящихся в растворе зарядов при небольших изменениях в электрохимическом потенциале называют дифференциальной емкостью Cd :
Комбинируя (4) и (5), получаем выражения для чувствительности потенциала к изменению на поверхности: или же, преобразовывая (8), получаем выражение для чувствительности электрохимического потенциала поверхности к изменению рНв всего раствора: а является безразмерной величиной чувствительности, которая принимает значения от нуля до единицы. Из выражения (10) видно, что чувствительность ISFET зависит от дифференциальной емкости двойного электрического слоя, формирующегося на границе раздела фаз электролит - твердое тело, и от собственной буферной емкости поверхности, которая зависит от природы материала пленки оксида. При а, стремящейся к 1, будет достигаться максимальная теоретическая чувствительность, при этом собственная буферная емкость должна быть высокой, а дифференциальная емкость низкой.
Существует несколько различных моделей, описывающих поведение заряда на поверхности оксидов в ходе протекающих на поверхности реакций при изменении рН электролита. Все эти теории объединяют несколько общих постулатов [17]: 1. Взаимодействия происходят в определенных местах (сайтах); 2. Эти взаимодействия можно описать через закон сохранения масс; 3. Результатом этих взаимодействий является заряд на поверхности; 4. Влияние суммарного заряда поверхности на взаимодействия можно учесть через теорию двойного электрического слоя.
Ниже будут рассмотрены две наиболее распространённых модели, которые используют при описании протекающих физико-химических процессов на поверхности оксидов.
Модель диссоциации кислотно-основных групп поверхности была создана для описания механизма перезарядки поверхности оксида в двойном электрическом слое [18, 19]. Она описывает состояние заряда на поверхности при помощи равновесного состояния между гидрокси-группами на поверхности оксида и ионами водорода ІҐ в объеме раствора [20].
ISFET в качестве чувствительного элемента систем для экспресс-диагностики
Как и в случае с обычным ISFET, чувствительность наноструктурных транзисторов сильно зависит от экранирования заряда. Из-за этого использование антител в качестве рецепторов на чувствительной поверхности вызывает дополнительные осложнения, связанные с размером антител. Типичный размер антител превышает 10 нм, следовательно, при детектировании, например, из сыворотки крови, межмолекулярное взаимодействие будет происходить на расстоянии от поверхности, большем, чем длина Дебая. Одним из основных решений для преодоления этого ограничения является понижение ионной силы растворов до 1 мМ - 1 мкМ [45]. Другим потенциальным решением является использование в качестве рецепторов не антител, а их fab-фрагментов. В этом случае на первом этапе исходное антитело (с размером 9-10 нм) подвергается воздействию пепсина, который селективно отрезает Fc фрагмент тяжелой цепи антитела. В дальнейшем получившийся фрагмент F(ab)2 можно разделить на две части путем восстановления дисульфидных связей. Размеры образующихся после описанных воздействий одиночных fab-фрагментов составляют 2 - 3 нм [46].
Практический интерес в использовании иммунохимических наноструктурных транзисторов заключается в возможности прямого детектирования биомаркеров рака и сердечно-сосудистых заболеваний, а также вирусов при их низкой концентрации [47].
Биомаркеры рака изучаются при онкологическом скрининге [48]. Эти маркеры присутствуют в пораженных тканях и в крови в очень низких концентрациях на начальных стадиях формирования опухолей. Одним из распространенных маркеров рака является простатический специфический антиген (ПСА). ПСА производится клетками предстательной железы, и увеличение его концентрации в сыворотке крови хорошо коррелирует с вероятностью появления рака простаты [49]. Кроме того, ПСА используется в качестве маркера рака груди у женщин [50].
Анализ на ПСА в режиме реального времени может быть выполнен при иммобилизации на чувствительную поверхность соответствующих антител. При этом предел обнаружения может составлять вплоть до 1 фг/мл при уменьшении диаметра кристаллической нанопроволоки до 40 нм [51]. Схожий результат с пределом обнаружения 5 фг/мл был получен для поликремниевых нанопроволочных транзисторов с иммобилизованными через APTES и глутаровый альдегид антителами при детектировании аналитов из обессоленной сыворотки крови [52].
Так как в случае рака определенный биомаркер позволяет идентифицировать и локализовать область появления злокачественной области, возможность исследования одного образца на присутствие нескольких маркеров является важным практическим преимуществом. Помимо определения ПСА на основе антител и наноструктурных полевых транзисторов была продемонстрирована возможность одновременного определения нескольких разных маркеров рака на основе массива транзисторов [45, 53]. Женг с коллегами продемонстрировали возможность одновременного определения ПСА, муцина первого типа (MUC-1 или же С А 15-3) и карциноэмбрионального антигена (СЕА) с пределом обнаружения по каждому маркеру в районе нескольких пг/мл в сыворотке крови [53]. Для уменьшения влияния ионной силы раствора на предел обнаружения массив чувствительных элементов может быть интегрирован с системой предварительной пробоподготовки для анализа маркеров рака из пробы объемом 10 мкл, при этом время от ввода пробы в микросистему до получения результата составляет 20 минут. Предложенная конструкция чипа позволяет проводить анализ на маркеры С А 15 -3 и ПСА, которые являются маркерами рака молочной железы [45].
Помимо указанных маркеров иммунохимическая схема детекции была реализована для потенциального маркера раковых клеток ALCAM (CD 166). Предложенная напопроволочная платформа позволяет проводить детекцию в широком линейном диапазоне концентрации (до 5 порядков) с пределом обнаружения 15,5 пг/мл, что может помочь при ранней диагностике меланомы [54]. Кроме того, в качестве биомаркера меланомы может быть использован TNFRSF19, который в здоровом организме присутствует только в клетках мозга. Однако, этот маркер так же может вырабатываться меланоцитами, поэтому обнаружение его следовых концентраций при помощи кремниевых нанопроволочных транзисторов может служить свидетельством возникновения в организме раковой опухоли [55].
Мультидетекция с использованием ISFET с иммобилизованными антителами к фрагменту цитокератина-19 (CYFRA 21-1) и нейроспецифической энолазе (NSE) была использована для демонстрации возможности быстрого скрининга рака легких. Предложенная система позволяет детектировать независимо оба маркера в диапазоне концентраций от 1 нг/мл до 1 мкг/мл в сыворотке крови [56].
Помимо анализа маркеров на рак, актуальной задачей в настоящий момент остается быстрая и высокочувствительная диагностика сердечно-сосудистых заболеваний, особенно определение инфаркта миокарда в первые несколько часов, после появления первых симптомов. Согласно статистике Всемирной Организации Здравоохранения (WHO) причиной смерти 17 млн. человек в год становятся сердечно-сосудистые заболевания [57]. Как правило, после появления характерной боли в груди пациентов отправляют на ЭКГ, однако эта процедура не всегда дает возможность поставить надежный и верный диагноз. В настоящее время для однозначной постановки диагноза вместе с ЭКГ рекомендуется проведение исследования на присутствие кардиомаркеров. Золотым стандартом селективного определения инфаркта среди кардиомаркеров является тест на тропонин Т (сТпТ) или тропонин I (cTnl). Однако из-за того, что описываемые тропонины являются высокомолекулярным белками, пик их концентраций в крови наблюдается более чем через 10 часов после повреждения миокарды, а повышенное содержание маркеров сохраняется в течение нескольких дней. Таким образом, определение сверхнизких концентраций тропонинов в первые часы после появления боли в груди позволяет однозначно установить диагноз. Как правило, низкие концентрации кардиомаркеров (за исключением креатинкиназы MB) определяют при помощи иммунохимических методов. Таким образом, с точки зрения медицинской диагностики использование быстрого и высокочувствительного метода анализа кардиомаркеров является важной практической задачей. Для решения этой задачи среди перспективных систем нового поколения рассматриваются наноструктур ные транзисторы, чувствительная поверхность которых функционализирована антителами к кардиомаркерам. Потенциальная пригодность такой системы была исследована в нескольких работах [58, 59]. Например, изготовленный по КМОП-технологии массив, содержащий 36 кластеров по 5 наноструктурных транзисторов способен детектировать 1 фг/мл тропонина Т в 0.1 М фосфатном буферном растворе, или же около 30 фг/мл маркера в неразбавленной сыворотке, что на несколько порядков превышает чувствительность стандартного ИФА [58]. Другим примером успешного применения наноструктурных ISFET является детектирование тропонина І в допороговом режиме в диапазоне концентраций от 9,2 пг/мл до 46 нг/мл. Стоит отметить, что у здорового человека концентрация тропонина І в сыворотке не превышает 0,6 нг/мл [59]. Для прогноза вероятности тех или иных обострений в сердечно-сосудистой системе в клинической диагностике в настоящее время используют анализ нескольких маркеров. Возможность подобного анализа так же была продемонстрирована с использованием массива нанопроволочных транзисторов.
Исследование нитроредуктазы из E.coli
В качестве фермента для исследования каталитических процессов на поверхности ISFET была выбрана нитроредуктаза из E.coli (КФ 1.5.1.34), катализирующая реакции восстановления нитросоединений.
Нитросоединения являются ксенобиотиками, то есть чужеродными для живых организмов веществами, естественно не входящими в биотический круговорот, но вступающими в метаболизм при поступлении в организмы. При этом как сами нитросоединения, так и их метаболиты - нитрозо и гидроксиламин производные, проявляют цитотоксичность [116, 117]. Токсичность нитросоединений для человека также ассоциируют с продуктами, образующимися в процессе восстановления нитрогрупп микрофлорой человека. Гидроксиламино-производные обладают высокой реакционной способностью к молекулам ДНК, а нитрозо-соединения приводят к образованию высокореакционных нитрооксидов, способных изменять функционал биологических молекул [118]. Превращения нитросоединений происходят под действием неспецифических ферментов [119]. Основным классом ферментов, вовлеченным в метаболизм нитроароматических соединений, и, в частности, тринитротолуола, являются нитроредуктазы. Это семейство ферментов восстанавливает большое число нитроароматических соединений, таких как нитрофуранозы, нитроарены, нитрофенолы, нитробензолы, включая тринитротолуол и гексагидро-1,3,5-тринитро-1,3,5,-триазин, и нитроглицерин. Нитроредуктазы делят на два класса в зависимости от их отношения к кислороду. Если фермент не проявляет чувствительности к кислороду, то он принадлежит к классу I, в противном случае - к классу П. В литературе приводится лишь несколько примеров существования кислород-чувствительной нитроредуктазы (так называемой нитроредуктазы II) [120, 121]. Все остальные нитроредуктазы, описанные в литературе, не чувствительны к кислороду (нитроредуктазы I).
Нитроредуктазы содержат флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве кофактора, используют НАДФН или НАДН в качестве донора электронов и катализируют последовательное двухэлектронное восстановление нитрозаместителей. Нитрозо-интермедиаты в ходе восстановления обычно не детектируются. Нитроредуктазы были найдены во многих бактериях, например, в Escherichia coli [122], Salmonella enterica [123], Enterobacter cloacae [124], Helicobacter pylori [125], Vibrio harveyi [126], Vibrio fisherii [127], Thermus thermophilics [128], Pseudomonas pseudoalcaligenes [129], Pseudomonas putida [130], Clostridium acetobutylicum [131], Klebsiella sp. [132], Pseudomonas sp. [133]. Предполагается, что в E.coli нитроредуктаза является одним из ферментов ответа на окислительный стресс [134], но в целом физиологическая роль нитроредуктаз остается неисследованной. Нитроредуктазы обладают широким спектром субстратной специфичности, при этом самым широким спектром обладают ферменты из Clostridium acetobutylicum и Pseudomonas putida - они способны восстанавливать даже ди-и мононитротолуолы.
Восстановление нитрогруппы происходит, как правило, до гидроксиламина, и скорость его выше, чем дальнейшего восстановления до аминогруппы [120]. Реакция восстановления нитрогруппы обычно идет по механизму последовательного присоединения-отщепления (пинг-понг) [135].
Ферменты, осуществляющие катализ восстановления нитрогруппы, являются наиболее универсальными по отношению к нитросодержащим веществам. Среди нитроредуктаз особенно стоит выделить нитроредуктазу I из E.coli.
Структура димера нитроредуктазы из E.coli [122] На сегодняшний день нитроредуктаза из E.coli (рисунок 15) является самым эффективным и распространенным ферментом, используемым для восстановления нитрогрупп самых разнообразных нитросоединений до гидроксиламинов. Этот фермент был выбран в качестве модельного для изучения ферментативных реакций вблизи чувствительной поверхности ISFET. Перед началом экспериментов с использованием ISFET этот фермент был охарактеризован спектрофотометрическими методами.
Нитроредуктазы катализируют восстановление нитрогруппы при сопряженном окислении НАДФН до НАДФ . Возможная схема реакции приведена на рисунке 16.
Окисленная и восстановленная форма НАДФН отличаются сопряжением связей никотинамидного кольца (структуры НАДФН и НАДФ приведены на (рисунке 17)). Спектр поглощения НАДФН (рисунок 17) имеет максимум поглощения на длине волны 340 нм, характеризующийся молярным коэффициентом поглощения 6270 моль" см" [135]. Окисленная форма НАДФН - НАДФ - такого максимума не имеет (рисунок 18), вследствие чего становится возможным спектрофотометрический контроль (по падению оптической плотности на длине волны 340 нм) убыли НАДФН и, как следствие, определяемого субстрата в ходе протекания ферментативной реакции.
Кинетика ферментативной реакции описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, которое отражает зависимость скорости реакции от концентрации субстрата: V KaAS (49) где V - скорость реакции, kcat - каталитическая константа, Е0 - начальная концентрация фермента, S - концентрация субстрата, Км - константа Михаэлиса. Как правило, для определения спектра субстратной специфичности и сравнения скорости реакции с различными субстратами между собой проводят измерение константы Михаэлиса-Ментен (Км) и каталитической константы (kcat), а также вычисляют параметр каталитической эффективности, равный отношению kcat І Км .
Для первичной оценки ферментативной активности нитроредуктазы из E.coli по отношению к разным субстратам сравнивали значения удельной активности ферментов с тем или иным субстратом. Для этого достаточно стандартизировать условия измерений, используя одинаковые концентрации субстратов, НАДФН и фермента. При этом обязательным является наличие отрицательных контролей, чтобы достоверно отличить ферментативную активность в ячейке от спонтанного разложения НАДФН.
Исследование параметров биосенсора для экспресс-анализа на основе гетерогенной
При иммобилизации фермента на поверхности ISFET с целью создания химического сенсора особое внимание стоит обратить на следующие факторы: 1) вход в активный центр каждой молекулы фермента должен быть легкодоступен для субстрата; 2) молекулы фермента должны находиться достаточно близко к поверхности сенсора, а именно, дистанция между ферментом и поверхностью не должна превышать длину Дебая; 3) методика функционализации должна приводить к максимально прочной связи между молекулами фермента и поверхностью чувствительных элементов. Лучше всего в этом случае подходят ковалентные методы иммобилизации фермента.
Для выбора оптимальной методики ковалентной иммобилизации нитроредуктазы на поверхности оксида кремния был проведен анализ первичной последовательности и трехмерной структуры нитроредуктазы из E.coli, доступной в базе данных PDB (PDB accession number 1YLR).
Методики ковалентной иммобилизации используют в качестве связующих функциональных групп є-аминогруппу лизина или тиольную группу остатка цистеина. В аминокислотной последовательности нитроредуктазы встречается 19 остатков лизина и только 1 - цистеина. Соответственно, выбор был сделан в пользу методик модификации остатков лизина.
Анализ трехмерной структуры нитроредуктазы показал, что остатки лизина распределены по поверхности молекулы фермента неравномерно, и большая их часть расположена ближе к активному центру (рисунок 38). Существует несколько основных методик иммобилизации белка по аминогруппе: реакция с ангидридной группой [145]. Но данная методика слишком груба для данных условий; кроме того, в результате ее действия в непосредственной близости от взаимодействия будет находиться свободная карбоксильная группа фермента, которая потенциально может осуществить внутримолекулярный катализ гидролиза новообразованной амидной связи; реакция с цианатами [146] и прямое алкилирование аминогрупп так же проходят в слишком жестких условиях; специфическая реакция с образованием оснований Шиффа с использованием глутарового альдегида [147] и прочих схожих коротких симметричных бифункциональных реагентов может вызвать сшивание молекул белка между собой, образование ассоциатов и побочных продуктов. Кроме того, азометиновые связи неустойчивы при подкислении, а их защита требует введения дополнительной стадии восстановления боргидридом натрия. Однако в ряде случаев такая методика иммобилизации позволяет получить высокий выход по активности иммобилизованного фермента; реакции ацилирования аминогруппы (хлорангидридная активация карбоксильной группы; пара-нитрофениловый и N-гидроксисукцинимидиловый эфир, или же активация in situ в присутствии дициклогексилкарбодиимида или соли Вудворда). N-гидроксисукцинимид является одной из лучших уходящих в ходе реакции групп, соответственно, смещает равновесие в системе в сторону продуктов реакции согласно принципу Ле Шателье.
Исходя из неравномерного распределения остатков лизина по поверхности белковой глобулы, можно предположить, что ориентирование молекул белка будет невыгодно с точки зрения доступности активного центра для молекул субстрата. В таком случае высокая плотность посадки фермента будет приводить к возникновению стерических препятствий и диффузионному лимитированною скорости взаимодействия субстрата с ферментом. В литературе приводятся данные о том, что самый высокий выход по активности ковалентно иммобилизованного фермента не всегда наблюдается при максимально высокой плотности посадки функционального сшивающего агента [148, 149]. Таким образом, с целью получения оптимального метода иммобилизации нитроредуктазы из E.coli на поверхности оксида кремния были рассмотрены несколько возможных стратегий функционализации.
Иммобилизация фермента с использованием асимметричного линкера В качестве асимметричных линкеров было рассмотрено использование двух различных реагентов: 1М-гидроксисукцинимидил-4-(/2-малеимидофенил)-бутират (SMPB) и N-гидроксисукцинимидил-З-малеимидобензоат (MBS). Оба они являются схожими гетеробифункциональными линкерами, которые содержат N-гидроксисукцинимид-эфирную и малеимидную группы [150]. Эти соединения отличаются друг от друга длиной (11,6 А для SMPB и 9,9 А для MBS). Следовательно, пленки, полученные с их использованием, отличаются длинной спейсера, что может, с одной стороны, влиять на доступность проникновения субстрата в активный центр фермента, с другой -увеличивать расстояние активного центра фермента от чувствительной поверхности. Гидроксисукцинимидная группа является активатором карбоксильной группы, повышающим ее нуклеофильность, что позволяет ей взаимодействовать с первичными аминами при рН 7 - 9 с образованием амидной связи. В свою очередь, малеимидные группы способны присоединять тиольные группы по реакции Михаэля с образованием стабильной сульфидной связи при pH 6,5 - 7,5 по активированной двойной связи [151]. Таким образом, с использованием этих соединений возможна иммобилизация белка либо через КНг-группы остатков боковой цепи, либо через SH-группы.
Поскольку нитроредуктаза из E.coli содержит только один остаток цистеина, проводить её иммобилизацию целесообразно через аминогруппы лизина. Следовательно, предварительно поверхность оксида кремния следует функционализировать SH-группами для последующего их взаимодействия с молекулами-линкерами. Для подобной функционализации может быть использован меркаптопропилтриэтоксисилан (MPTES). Схема реакции приведена на рисунке 39.
При исследовании данного метода иммобилизации была изучена зависимость активности иммобилизованного фермента от различных сочетаний концентрации смеси MPTES с TMPS и бифункциональных линкеров. Экспериментальные исследования показали, что активность иммобилизованного фермента не зависит от использованных концентраций активных функциональных групп на поверхности функционализированного оксида (таблица 5). Такая нечувствительность к концентрации MPTES может быть связана с тем, что даже при самых низких концентрациях происходит максимальное насыщение поверхности функциональными группами, а дальнейшие увеличение исходной концентрации прекурсора является избыточным.
Данное предположение было подтверждено в ходе исследования поверхности при помощи атомно-силовой микроскопии (АСМ). Результаты АСМ-исследований морфологии полученных пленок фермента подтвердили, что даже минимальные значения используемых концентраций MPTES являются избыточными и достаточными для формирования плотной пленки из фермента на поверхности оксида кремния (рисунок 40).