Агрегация производных каликс[4]аренов с каталазой, цитохромом c и фибрином на границе раздела фаз Сафиуллин Роман Альбертович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Литературный обзор 10

1.1. Каликсарены. Основные особенности и биологические свойства 12

1.2. Иммобилизация ферментов в мономолекулярных слоях 21

1.2.1. Методы и механизмы иммобилизации 23

1.2.2. Пленки Ленгмюра-Блоджетт на поверхности раздела фаз.

Основные понятия и особенности 31

1.3. Ингибирование полимеризации фибрина 39

1.3.1. Функции фибриногена и его влияние на свойства твердых поверхностей 39

1.3.2. Ингибирование полимеризации фибрина сульфонатными и фосфоновыми производными каликс[4]аренов 43

1.4. Применение методов атомно-силовой микроскопии при

исследовании тонких органических пленок 46

1.4.1. Атомно-силовая микроскопия 46

1.4.2. Атомно-силовая спектроскопия 49

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 52

2.1. Объекты исследования 52

2.1.1. Каликсарены 52

2.1.2. Белковые молекулы 55

2.1.3. Подложки для иммобилизации ферментов 57

2.1.4. Биоматериалы протезов кровеносных сосудов 57

2.2. Подготовка, проведение экспериментов и обработка данных 59

2.2.1. Пленки Ленгмюра-Блоджетт 59

2.2.2. Подготовка подложек и поверхностей 60

2.2.3. Методы атомно-силовой микроскопии 60

2.2.4. УФ-спектроскопия 68

2.2.5. Определение гидрофильности поверхностей 69

2.2.6. Другие виды микроскопии 70

ГЛАВА 3. Пленки ленгмюра-блоджетт производных тиакаликс[4]аренов 71

3.1. Формирование пленок Ленгмюра-Блоджетт тиакаликс[4]аренов на границе раздела фаз 71

3.2. Иммобилизация каталазы и цитохрома с 91

3.2.1. Пленки тетра-цианопропокси-п-трет-бутилтиакаликс[4]арена 91

3.2.2. Пленки ди-тиоацето-п-трет-бутилтиакаликс[4]арен-монокрауна-5

ГЛАВА 4. Ингибирование полимеризации фибрина производными каликс[4]аренов 106

4.1. Влияние фибриногена на адгезивные свойства искусственных биоматериалов 106

4.2. Ингибирование процесса полимеризации фибрина молекулами сульфонатных и фосфоновых производных каликс[4]аренов 113

Основные результаты и выводы 119

Список цитируемой литературы

• Иммобилизация ферментов в мономолекулярных слоях
• Подложки для иммобилизации ферментов
• Пленки тетра-цианопропокси-п-трет-бутилтиакаликс[4]арена
• Ингибирование процесса полимеризации фибрина молекулами сульфонатных и фосфоновых производных каликс[4]аренов

Введение к работе

Актуальность темы. Согласно статистике всемирной организации здравоохранения, одной из основных причин смерти людей по сей день остаются болезни связанные с нарушением работы сердечно-сосудистой системы, в том числе тромбозы. В связи с этим возникает необходимость в постоянном мониторинге состояния сердечно-сосудистой системы человека и применении антитромбогенных лекарственных препаратов.

Для мониторинга состояния здоровья на сегодняшний день наиболее популярны методы экспресс-анализа с применением биосенсоров на основе иммобилизованных ферментов. При создании биосенсоров для диагностики состояния кровеносной системы человека применимы ферменты, содержащие гемы, например, цитохром с или каталаза. Содержащееся в геме железо может менять степень окисления в присутствии маркеров заболеваний сердечно-сосудистой системы, таких как монооксид азота. Однако существует проблема, связанная с потерей активности фермента при их иммобилизации на поверхности твердых носителей. Данную проблему можно решить, применяя иммобилизацию в супрамолекулярных ансамблях за счет нековалентных взаимодействий, например, иммобилизацию в мономолекулярных слоях Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ). За счет контролируемой организации центров связывания в мономолекулярных слоях возможно осуществление более эффективного и селективного взаимодействия с молекулами и ионами в субфазе. К тому же, в этом случае обеспечивается обратимая иммобилизация, что заметно снижает стоимость сенсорного устройства.

С применением антитромбогенных препаратов также связан ряд проблем, таких как токсичность и неспецифичность их действия. Одним из ключевых элементов тромбообразования является белок фибриноген, основная функция которого – формирование каркаса для образующегося тромба и обеспечение адгезии клеток к данному каркасу. Чтобы создавать безопасные и эффективные препараты, препятствующие тромбообразованию, необходимо подробно изучить взаимодействие фибриногена с материалами искусственных сосудов, применяемых в лечении тромбозов, а также разрабатывать новые материалы, способные к ингибированию процессов тромбообразования, обладающих низкой токсичностью и высокой специфичностью действия.

Особенности строения молекул каликсаренов, их низкая токсичность, способность образовывать комплексы с белковыми молекулами, и широкие возможности модификации макроциклов делают их применимыми при решении обсуждаемых проблем.

Цель исследования состояла в определении закономерностей образования моно- и мультимолекулярных слоев каликс[4]аренов, и их взаимодействия с каталазой, цитохромом с и фибрином на границе раздела фаз.

Для достижения поставленной цели был определен ряд задач:

Получить стабильные мономолекулярные слои производных тиакаликс[4]аренов на границе раздела воздух-вода и на поверхности оксида индия-олова (ITO), золота, кристаллического кремния и кварца;

Охарактеризовать свойства мономолекулярных слоев тиакаликс[4]аренов на границе раздела воздух-вода при взаимодействии с цитохромом с и каталазой;

Получить мономолекулярные и мультимолекулярные слои тиакаликс[4]аренов на твердых подложках с включением цитохрома с и каталазы;

Охарактеризовать влияние моно- и мультимолекулярных слоев фибриногена на адгезионные характеристики полиэтилентерефталата и политетрафторэтилена;

Охарактеризовать изменение свойств глобулярных и фибриллярных белков при взаимодействии с производными каликс[4] аренов.

Научная новизна работы.

В работе впервые получены стабильные моно- и мультимолекулярные пленки тетра-цианопропокси-п-трет-бутил-тиакаликс[4]арена и ди-тиоацетопропокси-тиакаликс[4]монокрауна-5 на поверхности оксида индия-олова и золота. Сделаны выводы о структурных особенностях поверхностного слоя, включая ориентацию молекул-«хозяев»; проведена оценка толщины и шероховатости пленок.

Получены стабильные мономолекулярные и многослойные пленки тетра-
цианопропокси-п-трет-бутил-тиакаликс[4]арена и ди-тиоацетопропокси-

тиакаликс[4]монокрауна-5 с включением каталазы на твердых подложках (кварц, кремний, оксид индия-олова и золото).

Впервые получены данные об антиадгезивных свойствах фибриногена по отношению к полиэтилентерефталату и политетрафторэтилену, используемым в биопротезировании.

Впервые показана ингибирующая способность октафосфоновой кислоты
тетраундецилкаликс[4]резорцинарена и тетраметиленсульфонатного

тетрапентилкаликс[4]резорцинарена в отношении полимеризации фибрина.

Практическая значимость работы состоит в том, что использованный в работе метод иммобилизации гемопротеинов в мономолекулярных слоях производных тиакаликс[4]аренов на поверхности твердых подложек может быть применен при создании различных типов ферментных биосенсоров, в том числе для мониторинга состояния сердечно-сосудистой системы человека, а также при создании новых типов подложек.

Представленные в работе результаты исследования особенностей начальных этапов взаимодействия фибриногена с биоматериалами современных протезов сосудов и данные по антитромбогенным свойствам производных каликс[4]резорцинаренов позволят в перспективе улучшить эффективность биопротезирования сосудов.

Личный вклад соискателя. Весь объем экспериментальных исследований различными методами атомно-силовой микроскопии, ведение клеточных культур, пробоподготовка, а также анализ и обработка экспериментальных данных выполнены лично соискателем. Автор участвовал также в разработке плана исследований, обсуждении результатов, формулировании выводов и подготовке публикаций по теме диссертационной работы. Изотермы Ленгмюра были получены совместно с Нижегородской государственной медицинской академией.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывали на: Всероссийской школе-конференции «Химия биологически активных веществ, ХимБиоАктив-2012» (Саратов, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (Казань, 2012), XX Всероссийской научной конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2013), Russian-American scientific school «Design of new functional materials: education, science, and technology innovation» (Kazan, 2013), Всероссийской научной конференции «III Всероссийская конференция по органической химии» (Репино, 2013), Международной научной конференции «XXIII International Fibrinogen Workshop» (Marseille, 2014).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 12 публикациях, среди которых 6 статей, опубликованных в 3 отечественных и 3 международных рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ; приоритетность разработки подтверждена 1 патентом. По материалам диссертации также опубликовано 5 тезисов докладов на 1 международной и 4 всероссийских конференциях.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 144 страницах, содержит 3 таблицы, 50 рисунков, 210 библиографических ссылок. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), экспериментальной части (глава 2), обсуждения результатов (главы 3-4), основных результатов и выводов, списка использованных источников и списка сокращений.

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской Академии Наук в рамках государственной бюджетной темы «Разработка методов синтеза соединений со связью фосфор-углерод и фосфор-кислород – основы создания функциональных материалов нового поколения» (№ гос. регистрации 01201157528) при финансовой поддержке государственных контрактов № 16.552.11.7012 и № 02.740.11.0802, Гранта № 09-03-12264-офи_м, Гранта «Разработка физико-химических основ создания новых нано- и микроразмерных кластеров переходных металлов и их производных, а также фосфора и углерода методами электрохимии, создание мембранно-электродных блоков из нафиона, углеродной подложки, наночастиц платины и рутения для топливных элементов» программы фундаментальных исследований Президиума РАН П-7 (2011), Гранта

РФФИ «Самоорганизующиеся нанослои производных (тиа)каликсаренов для создания ферментных биосенсоров» (№ гос. регистрации 12-03-97085 Поволжье) с использованием оборудования лаборатории «Спектроскопии, микроскопии и термического анализа» ЦКП ФГБОУ ВПО «КНИТУ», а также в рамках программ обмена N0010033219 «Examine adhesive properties of biomaterials currently used for the production of vascular grafts» и N0010707098 «Analyze physical and cell adhesion properties of various fibrinogen coated biomaterials used for vascular grafts» на базе Университета штата Аризона.

Иммобилизация ферментов в мономолекулярных слоях

Арильные фрагменты каликсарена, соединенные метиленовыми мостиками, образуют гидрофобную полость с линейными размерами около 1 нм. Особенности строения каликсаренов отрывают широкие возможности относительно их функционализации по верхнему и нижнему ободу [34].

Каликс[n]арены, в которых метиленовые мостики заменены на атомы серы, называются тиакаликс[n]аренами. В работе [35] с помощью рентгеноструктурного анализа было доказано, что тиакаликсарен имеет полость большего объема, чем у классического аналога, за счет большей длины связи арила с атомом серы. Тиакаликсарены сочетают в себе полезные свойства классических каликсаренов и собственные отличительные черты, такие как большая конформационна подвижность, больший размер полости, более эффективное связывание металлов и другие. Тиакаликсарены, в отличие классических каликсаренов, способны образовывать координационные комплексы с катионами металлов [36-383738]. Например, для ионов Zn(II), Cо(II) и Ni(II) была обнаружена высокая эффективность экстракции в сравнении с классическим каликсареном [36]. Наличие атомов серы позволяет обеспечить сильное связывание тиакаликсарена с золотом, что немало важно при создании биосенсоров на их основе.

Свойства и применение каликсаренов В течение последних двух десятилетий было разработано множество методов функционализации каликсаренов. На самом деле каликсарены являются практически идеальной «молекулярной платформой» для создания специфических предорганизованных лигандов. За счет наличия трех или более фенольных гидроксильных групп на нижнем ободе, функционализация каликсаренов возможна путем проведения сравнительно простых реакций, для получения широкого спектра донорных групп. Каликсарены с заместителями по нижнему ободу, широко применяющиеся в химии комплексов «гость-хозяин», в основном содержат атомы водорода или п-трет-бутильные группы на верхнем ободе. Исследователями было обнаружено, что связывающие и комплексообразующие свойства каликсаренов сильно зависят от природы и количества донорных атомов заместителей [39]. Природа заместителей, расположенных по верхнему ободу, то есть в параположениях относительно фенольных атомов кислорода, сильно влияет на ионофорные свойства данного лиганда. Однако свойства каликсаренов, замещенных по верхнему ободу, изучены хуже из-за сложности осуществления их синтеза [40].

Каликсарены уже применяются в процессах очистки, при проведении хроматографии, в катализе, для создания биомиметиков, ионоселективных электродов, ионных каналов, они могут участвовать в трансмембранном переносе и образовании СОМС [41]. Каликсарены проявляют ярко выраженную способность к комплексообразованию с ионами, нейтральными молекулами. Наряду с циклодекстрином и краун-эфирами каликсарены считаются одними из лучших молекул «хозяев» [42]. В течение последних трех десятилетий каликсареновые хромоионофоры исследовались на предмет применения их в качестве специфических маркеров ионов металлов. Были синтезированы различные производные хромогенных каликс[4]аренов, проявляющих селективное распознавание ионов металлов [43].

Ионофорные свойства каликсаренов оказываются полезными при разработке и создании ионоселективных потенциометрических сенсоров [44]. Ионоселективные электроды разработаны на основе каликсаренов, преимущественно содержащих сложные и простые эфиры, карбоновую кислоту и карбаматы [45, 46]. Также были разработаны пьезоэлектрические сенсоры на основе кварцевого кристалла и каликсарена, для определения содержания органических веществ в водных растворах и газовой фазе. Электрохимические сенсоры на их основе проявляют высокую чувствительность по отношению к ионам металлов. При связывании аминов или ионов металлов заметно изменяются УФ-спектры некоторых азопроизводных каликсаренов. Оптические сенсоры на их основе были применены для детектирования аммиака, органических аминов и различных ионов металлов [47].

Различные заместители по нижнему ободу позволяют добиться селективного связывания с широким спектром молекул, и именно функциональные группы заместителей, как правило, определяют физические свойства молекулы каликсарена [48], в том числе растворимость [49]. Например наличие карбоксилатных, сульфонатных и фосфоновых групп значительно повышает растворимость каликсаренов в воде [50].

Одним из наиболее важных и ярко выраженных свойств каликсаренов, определяющих их широкий спектр возможных применений, является способность к образованию супрамолекулярных комплексов [51, 52]. Образование супрамолекулярных комплексов каликсаренов происходит за счет множественного межмолекулярного взаимодействия, в которых принимают участие как заместители, так и непосредственно макроциклы молекул. Под множественным межмолекулярным взаимодействием следует понимать одновременное участие донорно-акцепторных, электростатических, гидрофобных и -стекинг взаимодействий с макроциклической основой. Зачастую важную роль в формировании комплексов играют водородные связи, формирующиеся за счет аминогрупп, гидроксильных и карбоксилатных групп заместителя, а также за счет незамещенных гидроксильных групп на нижнем ободе. Важно отметить, что данное взаимодействие происходит с участием многих центров связывания и носит именно кооперативный характер [3].

При наличии определенных функциональных групп каликсарены также способны связывать крупные органические молекулы, в том числе белки и ферменты, образуя соединения включения [27, 53]. Данный факт делает их применимыми в качестве иммобилизующих агентов для ферментов и белков в биосенсорах, а также в качестве ингибиторов активности и коагуляции белковых молекул. Однако известно лишь небольшое количество современных работ, в которых успешно применены мономолекулярые слои каликсаренов для иммобилизации белков. Так например, авторами работы [54] методами плазмонного резонанса и атомно-силовой микроскопии была показана возможность иммобилизации иммуноглобулина g на мономолекулярном слое каликсарена. Для этого авторы использовали каликс[4]арены в конформации конус, содержащие четыре –SH группы по нижнему ободу макроцикла и различные заместители по верхнему ободу, такие как краун-эфир-5, карбоксильные группы или этилокси группы. За счет тиофильности золота и наличия сульфгидрильных групп на поверхности золотой подложки формировался СОМС каликсарена. А основное влияние на иммобилизацию антитела оказывали полярные заместители верхнего обода. Авторы показали, что ориентация белка относительно поверхности золота непосредственно зависит от направления дипольного момента каликсарена, то есть молекулы антитела выстраиваются вдоль диполей каликсаренов.

В 2014 году была опубликована работа [55], где демонстрировалась селективность взаимодействия пленок Ленгмюра амфифильного п-гуанидино-додецилокси-каликс[4]арена с ДНК, имеющими различные последовательности нуклеотидов. Благодаря анализу изотерм Ленгмюра и брюстеровской микроскопии было показано, что взаимодействие монослоя с ДНК определяется не только неспецифичным кулоновским взаимодействием катионного каликсарена и отрицательно заряженных молекул ДНК, но и структурой ДНК. Так, молекулы с менее плотной упаковкой нуклеотидов сильнее влияли на свойства пленки каликсарена, однако конкретные причины такого взаимодействия авторами предложены не были.

В работе [56] авторы применили тиол-дизамещенные п-трет-бутил-каликс[4]арены для иммобилизации глюкозооксидазы и создания биосенсора на содержание глюкозы. Взаимодействие с белком здесь осуществлялось через оставшиеся на нижнем ободе полярные гидроксильные группы.

Подложки для иммобилизации ферментов

Все производные каликс[4]аренов, используемые в данной работе, синтезированы в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук.

Исходя из анализа литературы, в качестве модельных ферментов были выбраны цитохром с, выделенный из сердца быка (C3131, Sigma-Aldrich, США), и каталаза из печени быка (С9322, Sigma-Aldrich, США). Приобретенные ферменты использовали без специальной очистки. Антиоксидант аскорбиновая кислота были так же приобретены в Sigma-Aldrich (США).

Для проведения экспериментов ферменты растворяли в деионизованной воде. Деионизованная вода на воздухе всегда оказывается насыщена СОг и ее рН равен 5,5. В таких условиях белковые молекулы, содержащие аминокислоты, имеют положительный заряд, так как аминогруппы в таких условиях существуют как катион аммония NH3+. Таким образом, иммобилизация ферментов, находящихся в водной субфазе, на пленке тиакаликс[4]аренов, находящихся на поверхности субфазы, может обеспечиваться за счет взаимодействия аминогрупп белковых молекул с полярными группами исследуемых макроциклов.

Исследованный в данной работе фибриноген был приобретен в Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN, USA). Для приготовления растворов фибриногена использовали свежий натрий-фосфатный буфер с рН=7,4 (NaCl 137 мМ, КС1 2,7 мМ, Na2HPC 4 10 мМ, КН2РО4 1,76 мМ), приготовленный с использованием бидистиллированной воды. Концентрацию фибриногена (Cfg) в растворе определяли с помощью УФ-спектроскопии, путем сравнения оптической плотности фибриногена на длинах волн 280нм (А28о) и 320нм (А32о) с учетом коэффициента экстинкции 1,506 (для 1см кюветы) [146]:

В качестве подложек были выбраны кристаллический кремний, кварц, ITO и золото, напыленное на кристаллический кремний. Все вышеперечисленные материалы были закуплены в компании SPI Supplies (США). Перед использованием подложки промывали струей деионизованной воды, затем сушили при 80 оС в течение 8 часов. Данные подложки подходят для методов визуализации АСМ, так как обладают шероховатостью менее 10нм. Благодаря прозрачности кварц и ITO могут являться подходящей основой для создания оптических биосенсоров. Золото и ITO часто используются при создании электрохимических биосенсоров, так как обладают проводимостью. Из литературных данных рассмотренных ранее следует, что золото также привлекательно из-за его тиофильности. Пластинки кристаллического кремния являются стандартной основой для микроэлектроники и могут служить для создания электрохимических биосенсоров.

В данной работе исследовали свойства материалов современных графтов, а именно, ПЭТ и ПТФЭ. Изображения поверхностей расширенного ПТФЭ, пленки ПТФЭ и пленки ПЭТ, полученные методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), показаны на Рис. 14. Рис. 14. СЭМ изображения поверхностей исследуемых биоматериалов, покрытых 2-5 нм слоем сплава золота и палладия: а) расширенный ПТФЭ; б) пленка ПТФЭ; в) пленка ПЭТ

На Рис. 14 а) видна разветвленная структура расширенного ПТФЭ. Такие структуры зачастую являются «слепыми» объектами для методов АСМ и делают невозможным проведение анализа адгезии клеток, так как клетки проникают между волокнами. Согласно работе [186] прозрачные тонкие пленки ПЭТ и ПТФЭ по химическим и физическим свойствам практически не отличаются от расширенного ПТФЭ и плетеного ПЭТ. Поэтому в данной работе для АСМ экспериментов и анализа адгезии клеток в основном использовали прозрачные гладкие пленки биоматериалов. Искусственный сосуд из расширенного ПТФЭ был предоставлен компанией BARD (США), пленки ПЭТ и ПТФЭ были приобретены в компаниях Grafix (США) и Ridout Plastics (США) соответственно. Поскольку адсорбция фибриногена на поверхность любых инородных тел, попадающих в организм, является первой стадией защитной реакции организма, запускающей процесс гемостаза, то следующая задача данной работы – охарактеризовать влияние моно- и мультимолекулярных слоев фибриногена на адгезионные характеристики полиэтилентерефталата и политетрафторэтилена.

Пленки тетра-цианопропокси-п-трет-бутилтиакаликс[4]арена

Для исследования оптических свойств и рецепторных характеристик перенесенных пленок применяли метод УФ-спектроскопии. Для проведения экспериментов методом УФ-спектроскопии использовали только кварц, так как он прозрачен во всем используемом диапазоне длин волн. Применение ITO в данном случае затруднено ввиду сильного поглощения ITO в УФ области.

Спектры поглощения монослоев ТКА I, перенесенных на кварц с деионизованной воды, показаны на Рис. 25 а. По спектрам видно, что увеличение числа перенесенных слоев приводит к росту оптической плотности на длинах волн 208 и 271 нм, характерных для тиакаликс[4]аренов. Зависимость оптической плотности на длинах волн 208 и 271 нм от количества монослоев представлена на Рис. 25 б. Линейный характер данной зависимости, а также данные нанолитографии свидетельствуют о последовательном формировании регулярной многослойной структуры из мономолекулярных слоев. а) УФ-спектры монослоев ТКА I на кварце (числами указано количество монослоев в пленке ТКА); б) зависимость оптической плотности на длинах волн 208 нм и 271 нм от количества монослоев в пленке Было обнаружено, что нанесение мономолекулярных слоев ТКА на подложку приводит к изменению ее гидрофильных свойств. В случае с кварцем и кремнием постепенное изменение гидрофильных свойств, предположительно, связано с изменением степени покрытия подложки пленкой ТКА, и как следствие, изменением поверхностной энергии системы. Степень заполнения поверхности пленкой тиакаликс[4]арена была определена как непосредственно путем АСМ визуализации поверхности, так и методом определения краевого угла смачивания. Равновесный контактный угол смачивания капли воды на поверхности высушенной пленки ТКА на твердой подложке определяли как контактный угол, образующийся при растекании капли в линейном диапазоне кинетической кривой =f().

В первом приближении можно рассматривать гетерогенную твердую поверхность с перенесенными монослоями как поверхность, состоящую из двух типов поверхностей: поверхность 1 - пленка ТКА I с площадью аь и поверхность 2 - подложка с площадью а2- Долю суммарной площади, приходящейся на монослой (аi) можно оценить с помощью уравнения Кассье: где в0 - контактный угол гетерогенной поверхности, 0! и 02 - углы смачивания гомогенных компонентов гетерогенной поверхности, ср\ и ср2 -доли площадей гетерогенной поверхности покрытой и не покрытой ТКА соответственно.

Значения контактного угла смачивания были получены для пленок ТКА I, перенесенных на кварц, ITO и кремний (Рис. 26 а). Значение вх соответствует поверхности, полностью покрытой пленкой ТКА, и равно 80±1О независимо от подложки. Учитывая значение угла смачивания для чистого кремния 02=53О (Рис. 26 а, кривая - 3) при расчете степени заполнения поверхности пленкой ТКА в соответствии с уравнением (10) ср\ для пяти перенесенных монослоев равно 0,6 (Рис. 26 б), АСМ изображение данной поверхности представлено на Рис. 23 в. Полученное путем анализа АСМ изображений значение средней геометрической площади поверхности, занимаемой ТКА I, (10, 27 и 58 %, для 1, 3 и 5 перенесенных монослоев соответсвенно) согласуется с данными, полученными методом определения угла смачивания (1 = 0,11, 0,34 и 0,63). б) Рис. 26. а) Зависимость контактного угла смачивания от количества монослоев ТКА I на поверхности твердых подложек: кривая 1 – ITO, кривая 2 – кварц, кривая 3 – кремний; б) зависимость доли поверхности кремниевой подложки покрытой ТКА I от количества перенесенных монослоев ТКА Также на основе мономолекулярных слоев ТКА I, перенесенных на поверхность полированного кристаллического кремния, была создана и запатентована подложка для исследований на атомно-силовом микроскопе (Рис. 27 а). Данная подложка обладает рядом преимуществ, таких как программируемая гидрофобность (Рис. 27 б), наличие однородной поверхности шероховатостью мене 1 нм (Рис. 27 в) и устойчивость к органическим растворителям [198].

Рис. 27. Запатентованная подложка для метода АСМ: а) модификация поверхности полированного кремния монослоями ТКА I; б) зависимость угла смачивания подложки от количества слоев ТКА I на подложке; в) распределение точек поверхности по высотам для 5 монослоев ТКА I на участке 2х2 мкм Было обнаружено, что тиакаликс[4]арен I захватывает ионы серебра из водной субфазы, однако параметры его пленки при этом практически не меняются. Координирование макроциклов с ионами серебра было подтверждено путем переноса монослоя тиакаликсарена I на твердую подложку и восстановления ионов серебра с помощью боргидрида натрия (NaBH4), при этом на поверхности подложки обнаруживаются частицы металлического серебра (Рис. 28) [199]. Данный факт был подтвержден методом УФ-спектроскопии, так как в спектрах пленки, изображенной на Рис. 28 б, появляются полосы поглощения, характерные для наночастиц металлического серебра [200].

Ингибирование процесса полимеризации фибрина молекулами сульфонатных и фосфоновых производных каликс[4]аренов

Влияние фибриногена на адгезивные свойства полиэтилентерефталат а При исследовании пленок ПЭТ, покрытых фибриногеном, методом атомно-силовой спектроскопии было обнаружено, что сила адгезии, возникающая между иглой АСМ и чистым ПЭТ, достаточно велика и составляет 1,05±0,3 нН (Рис. 40). После инкубации ПЭТ в растворе фибриногена с концентрациями меньше 1 мкг/мл сила адгезии практически не меняется. Концентрация инкубации 1 мкг/мл соответствует образованию сплошного мономолекулярного слоя фибриногена на поверхности ПЭТ. Однако при дальнейшем росте концентрации фибриногена в буфере сила адгезии иглы АСМ к поверхности биоматериала заметно падает. В диапазоне концентраций 1 - 2 мкг/мл сила адгезии иглы к поверхности уменьшается на 80%. Причиной таких изменений является формирование эластичного бислоя фибриногена, не способного обеспечить сильную адгезию. Дальнейший рост концентрации фибриногена приводит уже к незначительному спаду адгезии.

Результаты, полученные методом клеточной силовой спектроскопии и путем анализа адгезии клеток, показали, что адгезия клеток HEK Mac-1 к чистому ПЭТ существенно больше адгезии клеток к биоматериалу при наличии на его поверхности мультимолекулярного слоя фибриногена (Рис. 41). Также для ПЭТ было обнаружено, что при низких концентрациях фибриногена адгезия клеток к поверхности возрастает практически в два раза.

Наличие монослоя фибриногена, жестко связанного с подложкой, приводит к возникновению достаточно сильной механотрансдукции в клетках, вследствие чего клетки распластываются на поверхности и приобретают способность делиться (Рис. 42). Однако при увеличении концентрации фибриногена от 0,6 мкг/мл до 20 мкг/мл адгезия клеток падает более чем на 80%. Эластичный мультимолекулярный слой фибриногена на поверхности ПЭТ не способен обеспечить достаточную механотрансдукцию в клетках, и клетки не способны закрепиться на такой поверхности, что необходимо для их дальнейшего деления. На изображениях, полученных с помощью оптического микроскопа (Рис. 42), видно, что при низкой концентрации фибриногена клетки распластываются на поверхности подложки, такие клетки приобретают способность делиться. А при высокой концентрации белка клетки сохраняют сферическую форму, такие клетки слабо закреплены на поверхности и не способны делиться.

Так как концентрация фибриногена в плазме крови здорового человека порядка 2,5 г/л, то наиболее вероятно образование на поверхности материала протеза мультимолекулярной матрицы фибриногена при контакте графта с кровью. Исходя из представленных результатов, можно заключить, что адсорбция фибриногена на поверхность протезов сосудов, изготовленных из ПЭТ, препятствует прилипанию и дальнейшему росту клеток эндотелия на поверхности графта и образованию естественного сосуда.

Атомно-силовая спектроскопия показала, что адгезия иглы АСМ к поверхности ПТФЭ сравнима с адгезией к чистому ПЭТ и составляет порядка 1,1 ±0,4 нН (Рис. 43). Однако в случае ПТФЭ при инкубации материала в растворах фибриногена наблюдается отличный от ПЭТ характер изменения силы адгезии. Наблюдается уменьшение силы адгезии иглы АСМ к ПТФЭ уже при наличии отдельных молекул фибриногена на его поверхности, а при наличии сплошного мономолекулярного слоя белка на поверхности биоматериала адгезия падает более чем на 80%. Так, при изменении концентрации фибриногена в буфере от 0 до 1 мкг/мл адгезия приобретает значения порядка десятков пиконьютонов. Данный эффект может возникать из-за слабого взаимодействия белковых молекул с сильно гидрофобной и химически инертной поверхностью ПТФЭ, вследствие чего молекулы адсорбируются на поверхность кремниевой иглы АСМ.

Клеточная силовая спектроскопия показала, что адгезия клеток НЕК, трансфецированных интегринами лейкоцитов, к чистому ПТФЭ достаточно велика и составляет 500±150 пН (Рис. 44). При адсорбции молекул фибриногена на ПТФЭ адгезия клеток к нему уменьшается, и при концентрации белка 20 мкг/мл составляет порядка 20% от первоначального значения.

Хотя поверхность расширенного ПТФЭ, содержащая множество мягких волокон, является слепым объектом для методов АСМ, удалось провести атомно-силовую спектроскопию на поверхности узлов ПТФЭ. Как и ожидалось, результаты, полученные на пленке ПТФЭ, схожи с результатами на расширенном ПТФЭ. Так же, как и в случае гладкой пленки, адгезия иглы АСМ существенно падает уже при концентрациях порядка 1 мкг/мл (Рис. 43).