Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Кормовые культуры в системе земледелия 9
1.1.1.1. Клевер луговой, значение культуры и место в севообороте 9
1.1.1.2. Болезни клевера лугового 10
1.1.2.1. Люпин, значение культуры и место в севообороте 12
1.1.2.2. Болезни люпина 14
1.2. Общие положения экологии микромицетов, факторы, определяющие развитие почвенных грибов в ризосфере растений 16
1.3. Фитопатогенные почвенные грибы 19
1.3.1. Грибы рода Fusarium, распространение и вредоносность 20
1.4. Микотоксины и способы их детоксикации 23
1.5. Воздействие некоторых химических веществ на почвенные микромицеты 26
Глава 2. Материалы и методы исследования 28
2.1. Материалы исследования 28
2.2. Методы лабораторных исследований 29
2.2.1. Методы выделения и количественного учета грибов из разных органов растений 29
2.2.2. Метод анализа микофлоры корневой системы растений 30
2.2.3. Выделение и количественный учет грибов из почвы 30
2.2.4. Питательные среды, применяемые для культивирования грибов; идентификация микромицетов 32
2.2.5. Метод выделения моноконидиальных культур микромицетов 33
2.2.6. Методы анализа семян сельскохозяйственных культур на зараженность патогенными и сапротрофными грибами, анализ развития болезней проростков зерновых кульур 33
2.2.7. Биологические методы определения токсичности грибов 35
2.2.8. Изучение взаимодействий in vitro грибов, относящихся к разным систематическим группам, с видами Fusarium 36
2.2.9. Метод оценки чувствительности грибов к фунгицидам 36
2.3. Методы полевых исследований 37
2.3.1. Обследование посевов и сбор инфекционного материала 37
2.3.2. Учет корневых гнилей 37
2.3.3. Полевые опыты 38
Глава 3. Изучение особенностей формирования микоценоза под многолетним клевером 42
3.1. Роль микромицетов в этиологии корневых гнилей клевера лугового в Московской и Кировской области 42
3.2. Видовой состав возбудителей фузариозных корневых гнилей клевера лугового в Кировской области 50
3.3. Изменение видового состава микромицетов в ризосфере и на корнях клевера лугового в зависимости от возраста растений 57
3.3.1. Распространение корневых гнилей фузариозной этиологии на посевах клевера лугового разного возраста жизни 57
3.3.2. Изучение видового состава микробиоты ризосферы и корней клевера лугового...59
3.3.3. Изучение взаимодействий между грибами рода Fusarium и микромицетами -антагонистами 66
Глава 4. Особенности формирования микоценоза под люпином 69
4.1. Фитосанитарное состояние люпина узколистного в Брянской области 69
4.1.1. Исследование микофлоры семян люпина 69
4.1.2. Изучение видового состава грибов в пораженных тканях корней и стеблей вегетирующего люпина 71
4.2. Изучение влияния предшественника на формирование структуры патогенных популяций грибов, вызывающих корневые гнили люпина узколистного 73
Глава 5. Экологические связи фитопатогенных грибов в агроценозе 76
5.1. Изучение семенной инфекции различных сельскохозяйственных культур 76
5.2. Изучение формирования грибных комплексов в области ризосферы различных сельскохозяйственных культур и в почве парового поля 82
5.2.1. Исследование количественных изменений пропагул микромицетов в ризосфере растений и в почве парового поля в течение вегетации 82
5.2.2. Изучение видового состава микофлоры ризосферы растений и почвы парового поля 84
5.3. Изучение формирования грибных комплексов на корнях различных сельскохозяйст венных культур 89
5.3.1. Изучение распространения корневых гнилей на посевах исследуемых культур...90
5.3.2. Роль микромицетов в этиологии корневых гнилей различных сельскохозяйственных культур 91
5.4. Изучение некоторых физиологических свойств BHflaF. oxysporum 94
5.4.1. Исследования патогенных свойств изолятов F. oxysporum, выделенных из пораженных корней растений 94
5.4.2. Изучение физиологической дифференциации природных популяций F. oxysporum 96
5.4.3. Исследования фитотоксических свойств изолятов F. oxysporum 98
Глава 6. Экологические связи фузариев в природных ценозах 102
6.1. Вьщеление и идентификация микромицетов, развивающихся в природе на грибах рода Fusarium 102
6.2. Оценка видов микромицетов по их способности деградировать фузариотоксины 104
Глава 7. Изучение воздействия фунгицидов из разных химических групп на почвенные микромицеты 107
Выводы 111
Научно-практические рекомендации 113
Библиографический список 114
Приложения, 128
- Общие положения экологии микромицетов, факторы, определяющие развитие почвенных грибов в ризосфере растений
- Методы выделения и количественного учета грибов из разных органов растений
- Видовой состав возбудителей фузариозных корневых гнилей клевера лугового в Кировской области
- Изучение влияния предшественника на формирование структуры патогенных популяций грибов, вызывающих корневые гнили люпина узколистного
Введение к работе
Актуальность темы исследований. Почвенные микромицеты являются активными компонентами агроценозов, участвуют в поддержании гомеостаза в почве. Исследование закономерностей формирования структуры взаимосвязанных групп микромицетов на видовом уровне в почвах, занятых сельскохозяйственными культурами, имеет значение для совершенствования методов возделывания этих культур и повышения их урожайности.
По мере интенсификации сельскохозяйственного производства возрастает проблема разработки эффективных мер борьбы с возбудителями болезней растений. Причем, в последние десятилетия в структуре агроценоза стали накапливаться не только специфически связанные с сельскохозяйственными культурами патогены, но и общие возбудители заболеваний. Патогены-полифаги по своей вредоносности стали выходить на первое место. Это привело к тому, что обычные для прошлых лет структуры севооборотов перестали существенно ограничивать распространение и накопление в почве патогенных микроорганизмов.
В Нечерноземной зоне «универсальными» патогенами способными поражать различные сельскохозяйственные культуры являются грибы рода Fusarium. Следует отметить, что учет потерь урожая от фузариозов затруднителен. Широкое распространение данной группы возбудителей болезни в последние десятилетия связано с улучшением среды обитания для фитопатогенов: изменение гидротермического режима (теплые зимы, неустойчивый снежный покров, неравномерное выпадение осадков и т.д.), несоблюдение агротехники возделывания культур, высокая насыщенность севооборотов зерновыми, многолетняя обработка растений фунгицидами из различных химических групп, среди которых наиболее «старой» является группа бензимидазолов, применяемая и в настоящее время.
Современное земледелие - многокомпонентная система, отдельные элементы которой находятся во взаимосвязи между собой и природной средой. Одной из составных частей земледелия является система защиты растений, в которой химические и организационно-хозяйственные меры (освоение севооборотов, соблюдение сроков и качества проведения технологических приемов и т.д.), занимают немаловажное место.
Земледелие в Нечерноземной зоне приходится вести в большинстве районов на землях с низким естественным плодородием и слабой окультуренностыо. Все звенья и приемы системы земледелия должны быть направлены на улучшение почв, расширенное воспроизводство плодородия и адаптацию к ландшафтным условиям. В связи с этим, в системе земледелия Нечерноземной зоны в различные типы севооборотов рекомендуют включать обязательными компонентами многолетние травы и зернобобовые культуры.
В условиях Нечерноземной зоны повсеместно в качестве многолетнего бобового компонента севооборотов возделывают клевер луговой. Благодаря высокому содержанию протеина, незаменимых аминокислот, каротина и других веществ, хорошей перевариваемо-сти, клевер по питательной ценности занимает одно из ведущих мест среди кормовых трав.
Клеверный пласт до 80-ых годов 20 века считался одним из лучших предшественников для зерновых культур, сахарной свеклы, картофеля, льна долгунца и др. Однако, в настоящее время, болезни клевера существенно снижают его продуктивность, отрицательно влияют на качество продукции. Особую роль в этом играют корневые гнили, вызываемые грибами рода Fusarium. В связи с этим, роль клевера лугового, как санитарной культуры в севооборотах, значительно снизилась, поскольку он сам стал накопителем фузариозной инфекции. Следует отметить, снижение супрессивности почв под клеверами с конца 70-х годов, по-видимому, было связано с общими отрицательными экологическими процессами, происходящими в современном агроценозе.
В условиях Нечерноземной зоны часто в качестве зернобобового компонента севооборотов включают люпин узколистный, который используют для получения зерна, зеленой массы, силосного сырья. Его значение, как культуры, повышающей плодородие почвы, достаточно изучено. И в то же время, очень мало сведений о его фитосапитарной роли. С этой позиции, обычно, не анализируют схему чередования культур в севооборотах.
В связи с интенсификацией сельскохозяйственного производства расширяется применение химических веществ различного назначения, особенно пестицидов, обладающих фун-гицидным действием. Фунгициды играют роль сильного экологического и селектирующего фактора: попав в почву, они влияют не только на возбудителей болезней, но и на другие почвенные микроорганизмы, вызывают изменения их численности, а нередко проявляя мутагенную активность, представляют генетическую опасность для микромицетов.
Широкое использование минеральных удобрений и пестицидов, ограниченное число генотипов сортов растений приводит к сужению разнообразия биоты в агроэкосистеме и к значительным сдвигам в сообществах биотрофных и сапротрофных видов грибов. Это способствует активизации видов грибов, вызывающих загрязнение зерна и зернопродуктов опасными микотоксинами. В настоящее время наибольшую угрозу представляют токсины видов рода Fusarium. У людей и животных фузариотоксины вызывают отравление, поражают кроветворные и иммунокомпетентные органы, ингибируют синтез белка, нарушают нервную деятельность и воспроизводительные функции, вызывают некрозы кожи.
В заключении, следует отметить, что в настоящее время в литературе мало сообщений об происходящих изменениях в микробиоте различных сельскохозяйственных культур.
Цели и задачи исследований. В работе представлены результаты по изучению формирования микоценозов под различными сельскохозяйственными культурами в агроценозах Нечерноземной зоны.
7 Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить особенности формирования микоценозов на корнях и в области ризосферы многолетнего клевера лугового и люпина.
Выявить в структуре патогенных комплексов грибов корней и ризосферы у разных групп сельскохозяйственных культур (бобовые, зернобобовые, крестоцветные, яровые зерновые) патогенов-полифагов.
Выявить виды микромицетов, использующих грибы рода Fusarium в качестве источника органического питания, а также обладающих детоксицирующими свойствами по отношению к фузариотоксинам, с целью поиска возможных биологических мер борьбы с фузариями.
Провести оценку влияния фунгицидов из разных химических групп на почвенный микоценоз.
Научная новизна. Изучены особенности формирования микоценозов под клевером луговым и люпином в различных эколого-географических районах Нечерноземной зоны. В результате полученных данных определена роль культур в севооборотах с позиции их фито-санитарных свойств.
Изучен видовой состав возбудителей фузариозных корневых гнилей клевера лугового в Кировской области.
В структуре патогенных комплексов грибов корней и ризосферы у разных групп сельскохозяйственных культур выявлен микромицет F. oxysporum, который по полученным характеристикам (представленность в различных субстратах, распространенность, вредоносность и т.д.) является фитопатогеном-полифагом. С этих позиций исследованы некоторые физиологические свойства гриба.
Из природных популяций микромицетов, ассоциирующих с колониями Fusarium, обнаружены изоляты грибов, способные утилизировать таллом фузариев.
Получены данные об эффективности действия препаратов различных химических групп на почвенные микромицеты.
Практическая ценность работы. Полученные результаты могут быть использованы в общей агрономической практике при составлении схем чередования культур в севооборотах Нечерноземной зоны, главным образом при выборе предшественников для зерновых культур. Сведения по видовому составу грибов рода Fusarium, вызывающих корневую гниль клевера в Кировской области, могут быть применены при создании искусственных инфекционных фонов для иммунологической оценки сортов и сортообразцов клевера лугового и его селекции на устойчивость к фузариозным корневым гнилям.
8 Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Втором Всероссийском семинаре повышения квалификации специалистов защиты растений, Москва, 2002 г.; представлены на Первом Всероссийском конгрессе по микологии, Москва, 2002 г.
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам, а также включает 5 глав по результатам исследований, выводов и списка литературы. Работа изложена на 146 страницах, содержит 24 таблицы, 16 рисунков, 14 приложений. Список литературы включает 165 работ отечественных авторов и 52 работы зарубежных исследователей.
Автор благодарит за практическую помощь в проведении исследований сотрудников группы «Сельскохозяйственной экологии микроорганизмов» Будынкова Н.И., к.с.-х.н, Савченко Л.Ф., к.б.н., Никифорову Е.Ф., а также Соколову Г.Д., к.х.н., Девяткину Г.А., к.б.н. и ДР-
Общие положения экологии микромицетов, факторы, определяющие развитие почвенных грибов в ризосфере растений
С ростом антропогенного воздействия на окружающую среду возрастает необходимость изучения закономерностей, действующих в микробных системах, в частности, в комплексе микроорганизмов (Заварзин,1976). В отдельных случаях данное воздействие приобретает отрицательный характер, что может привести к упрощению биологических систем. В итоге снижается активность почвы, и отмечаются нежелательные явления, негативно действующие на рост и продуктивность сельскохозяйственных культур (Мишустин, 1956; Тишлер, 1971; Воробьев, 1979; Берестецкий, 1982). С этой точки зрения важнейшим компонентом каждого агроценоза являются почвенные грибы.
По данным некоторых исследователей, у микроорганизмов, лишенных выраженной дифференциации на органы и ткани, включение и реализация программ индивидуального развития в большой степени, чем у более высокоорганизованных организмов, определяются факторами окружающей среды (Smith, Berry, 1974).
Существует мнение, что грибы составляют автономные сообщества - микоценозы (Черемисинов, 1974; Каламээс, 1977). Другие полагают, что нецелесообразно и необоснованно выделять группировки микромицетов в самостоятельные сообщества, потому что в растительных ассоциациях они не образуют взаимосвязанного единства. Изучение чистых культур имеет более прямое, чем ранее считалось, отношение к почвенной микробиологии (Дудка, 1977; Звягинцев, 1979).
Некоторые исследователи рассматривают микромицеты как структурные части фитоценоза- синузии. Авторы выделяют 3 типа синузий: 1) микромицеты, которые развиваются одновременно на растениях, не оказывая заметного влияния друг на друга; 2) микросинузии, сформированные микромицетами с разными трофическими требованиями, что приводит к последовательному развитию в них грибов (сапрофиты следуют за биотрофами); 3) микоси-нузии, между компонентами которых существуют гиперпаразитические взаимоотношения (Симонян, 1976; Симонян и др., 1982).
Garett S. D. (1970; 1971) в своих работах придерживается мнения, что многообразие условий обитания и трофических связей приводит к образованию так называемых экологических групп у грибов, которые не связаны с систематическим положением входящих в них видов.
Многие ученые считают, что особого внимания заслуживают исследования консорции как совокупности организмов, связанных с определенным видом автотрофного высшего растения. На корневую систему растений в этом случае можно смотреть как на определенную меросинузию, обусловленную множеством факторов, в основе которых лежат разнообразные трофические и топические связи как между популяциями организмов, населяющих эти зоны, так и между растением и окружающей средой (Мазинг, 1966; Работнов, 1973).
Заварзин Г.А. (1970; 1976) предлагает представить взаимоотношения между почвенными микроорганизмами в виде микробной системы, которая обеспечивает методологический подход к изучению трофической сети микроорганизмов, поскольку отражает существующие в природе взаимосвязи между отдельными группировками микроорганизмов в пространстве и времени. В зависимости от поступления веществ в определенную точку пространства, будут проявлять активность либо одни, либо другие группы микроорганизмов. Таким путем происходит смена этих групп во времени, совершается их сукцессия.
Многие исследователи указывают, что грибы вместе с другими микроорганизмами входят в биогеоценозы как компоненты гетеротрофного блока, занимая в них уровень деструкторов органического материала. Почвенные микромицеты вызывают минерализацию и гумификацию мертвого органического вещества, в том числе и такого, который недоступен другим организмам: лигнина, кератина, целлюлозы и т.д. Вместе с тем грибы являются активными участниками многочисленных трофических цепей и сетей, существующих между компонентами биоценоза (Мирчинк, 1976; Великанов, Успенская, 1980; Alexander, 1971).
Звягинцев Д. Г. (1979) указывает, что с помощью почвенных микроорганизмов в естественных биоценозах поддерживается гомеостаз в отношении характерного для данного типа почвы уровня органического вещества, определенного содержания азота, фосфора, калия и, вероятно, характерного для данной почвы рН.
По мнению некоторых ученых при экологических исследованиях в большинстве случаев нет необходимости устанавливать все существующие в почве разнообразия микроорганизмов, достаточно ограничиться определением форм, доминирующих в важных экологических процессах, причем имеется в виду не только и не столько численное доминирование. А в одних случаях это могут быть такие глобальные процессы как разложение целлюлозы или азотофиксации, в других - синтез определенных метаболитов - органических кислот, ферментов, витаминов (Звягинцев, 1979; Domsch, 1960).
В почве имеются определенные зоны: ризоплана и ризосфера, где наблюдается большая организованность процессов, чем в иных частях почвы. Взаимоотношения микроорганизмов с корневой системой растений уже давно привлекают внимание исследователей (Березова, 1950). В ряде литературных источников даны обзоры результатов изучения микроорганизмов ризосферы (Красильников, 1958; Clark, 1949; Rouatt, 1957; Vagnerova и др., 1963; Rovira, 1973; Rovira и др. 1979 и др.). Многие авторы считают, что корневые выделения высших растений оказывают сильное и многостороннее влияние на развитие почвенных микроорганизмов, в том числе сапрофитных и особенно патогенных грибов (Красильников, 1958; Мирчинк, 1970; Самцевич, 1972; Roharia, 1956; Domsch и др., 1968; Seidel, 1970). Без корневых экссудатов такие организмы сохраняют состояние покоя, что обеспечивает им существование в отсутствии пораженных растений. Развитие происходит преимущественно при появлении экссудатов.
Для грибов, близких к сапрофитной группе - постоянных почвенных обитателей, действие экссудатов неспецифично, их споры могут прорастать в ризосфере невосприимчивых к ним растений, что служит биологической основой применения севооборотов для борьбы с почвенными патогенами (Горленко, 1950; Стэкмен, 1959; Горленко, 1968; Kommedahl, 1979).
Многочисленные литературные данные свидетельствуют о биологически важных функциях антибиотических веществ - фитотоксинов, которые продуцируются высшими растениями. Достигнув фунгистатических концентраций, фитотоксины защищают растения от заражения фитопатогенными грибами (Василенко и др., 1976; Райе, 1978; Фрайштат, 1981; Alexander, 1964; Dewick, 1977).
Ряд ученых в своих работах указывают на явление почвенного фунгистазиса, отмеченного в почвах разного типа и заметно лимитирующего грибную активность в них. Фунги-стазис снижает интенсивность или ингибирует прорастание грибных зачатков и мицелия. Причинами фунгистазиса могут быть: нарушение питательного режима, химико-токсикологическое воздействие, влияние летучих веществ, анабиоз, лизис, гиперпаразитизм, хищничество и др. (Mangenot, 1979). Есть данные, показывающие, что главной причиной фунгистазиса являются конкурентные отношения между микроорганизмами по причине питательного дефицита (Lockwood, 1977), по другим сообщениям в литературе причиной фунгистазиса являются летучие микробные метаболиты (Smith, 1976).
Лугаускас А. (1988) утверждает, что почва является ключевым компонентом наземных экосостем, что многие процессы, имеющие решающее значение для их нормального функционирования, происходят именно в почве. С этой точки зрения взаимоотношения растения-хозяина и гриба-патогена, а также процесс перехода сапрофитных грибов к паразитическому образу жизни усложняется, и охарактеризовать их в конкретных условиях в настоящее время весьма трудно, так как отсутствуют данные о реакциях разных микромицетов на функциональные особенности растения-хозяина и их изменения, а также на изменения физико-химических свойств почвы под воздействием человека.
Методы выделения и количественного учета грибов из разных органов растений
Стебли с корнями отмывали от почвы, дезинфицировали поверхностно; стерильным скальпелем разрезали стебель поперек на расстоянии 5 - 10 см от корневой шейки и небольшой участок побуревшего сосуда переносили на подкисленную питательную среду (Билай, 1977). По мере роста колоний грибов проводили их диагностику до видового уровня.
Зерно или семена, после поверхностной дезинфекции 70%-ным раствором этилового спирта в течение 0,5 минуты и последующей промывки стерильной водой, раскладывали на поверхность фильтровальной бумаги или на агаризированную питательную среду с интервалом 0,5 - 1,0 см (Наумова, 1960; Семенов, Федорова, 1984). На анализ отбирали от 100 и более зерен каждой культуры.
Инфицирование (%) грибами зерна хлебных злаков и семян бобовых и крестоцветных культур вычисляли по формуле:
Корни освобождали от крупных частичек почвы, помещали в колбочку, содержащую 100 мл стерилизованной водопроводной воды. Затем, вынимали и тщательно очищали от всех посторонних примесей и повторно промывали до 4-5 раз в стерильной воде. После того, как с корней полностью стекала вода, их разрезали ножницами на небольшие фрагменты длиной 3-4 см. Для анализа брали все корни за исключением стержневого, который не подвергался исследованию. Корневые отрезки просушивали между двумя листами фильтровальной бумаги, взвешивали и растирали в стерильной фарфоровой ступке со стерильным кварцевым песком. Из нарезанных корней брали навеску в 1 г (для бобовых 5 г). Растертые корни переносили в колбу со 100 мл стерилизованной водопроводной воды. Колбу встряхивали в течение 5-7 мин. И после 30-секундного отстаивания из нее отбирали пипеткой 1 мл суспензии и вносили в 9 мл стерильной воды. Из пробирки третьего или четвертого разведения 1 мл суспензии высевали в стерильные чашки Петри. Посев из каждой пробирки производили в 4 чашки. Затем, в чашки Петри стерильно наливали по 10 мл расплавленной охлажденной до 40С агаризировашюй питательной среды, после чего перемешивали осторожным покачиванием, прежде чем остынет агар, и ставили в термостат для инкубации при температуре 23 -25С на 10 - 15 суток. Для определения сухого веса корней, взятых для анализа, делали вторую навеску корней, отмывали от почвы, а затем высушивали до постоянного веса (Литвинов, 1967).
Грибы изолировали из почвы методом разведений (Waksman, 1916) и методом прямого посева (Tresner, Hayes, 1970). Использовали твердые питательные среды Чапека, Чапека-Докса и КГА. Для подавления роста бактерий, после автоклавирования, добавляли к питательным средам антибиотики (пенициллин или ампициллин) или подкисляли среды лимонной кислотой.
Образцы почв, отобранные в зоне корневой системы растений - в ризосфере (путем тщательного встряхивания корневых отрезков) или на участках, лишенных растительности, с глубины 5-10 см, просевали через сито с диаметром отверстий не более 4 мм между двумя листами стерильной бумаги. Затем, на технических весах взвешивали по 10 г почвы в 3 по-вторностях, насыпали ее на стерильные кружки бумаги шпателем, для приготовления водных почвенных болтушек (суспензии) разных разведений и параллельно по 10 г почвы, для определения ее влажности при количественном учете грибных зародышей в 1 г абсолютно сухой почвы. Для каждого образца брали новый кружок бумаги, а шпатель дезинфицировали спиртом и обжигали над пламенем горелки. Для приготовления разведений навески почвы переносили в стерильные колбы, содержащие по 90 мл стерильной воды, и в течение 5 минут встряхивали. Далее 1 мл суспензии переносили из колбы в стерильную пробирку с 9 мл стерильной воды и слегка встряхивали. В дальнейшем разведение и посев суспензий производили аналогичным методом, приведенным в разделе 2.2.2. Засеянные чашки просматривали, начиная с третьих суток. Отдельные колонии грибов при необходимости, для идентификации, отсевали в стерильные чашки Петри на твердые агаризированные питательные среды. Окончательный учет проводили через 10-15 суток после посева.
Если два образца отобраны из одного и того же растительного сообщества, то теоретически S должен соответствовать 1, однако практически он всегда ниже. Достоверными различиями при сравнении флоры двух различных местообитаний считаются такие, при которых показатель составляет менее 0,5.
На анализ отбирали небольшое количество почвы (15 - 20 г) и переносили в стерильную чашку Петри. Продезинфицированной иглой захватывали предельно малые частицы почвы, и помещали их методом укола на твердую агаризированную питательную среду, по 5 уколов в каждую чашку Петри. После каждого укола иглу промывали в воде, дезинфицировали в 70% растворе этилового спирта, обжигали над пламенем горелки и охлаждали. Инкубировали посевы в термостате при температуре 23 - 25 С. Начиная с третьего дня, по мере роста колоний микроорганизмов, проводили идентификацию их систематической принадлежности.
Видовой состав возбудителей фузариозных корневых гнилей клевера лугового в Кировской области
Видовой состав возбудителей корневой гнили клевера лугового фузариозной этиологии был изучен на селекционных и производственных посевах культуры Кировской области в следующих зонах исследования: в центральной - пункты НИИСХ Северо-Востока, Фален екая селекционная станция, Зуевский ГСУ, и в южной - пункты Советский ГСУ, Уржумский ГСУ. Образцы растений отбирали с посевов клевера в основном второго года жизни в фазе цветения 1-го и 2-го укосов.
Целью исследований являлось выявление изменения видового состава возбудителей фузариозных коневых гнилей клевера в зависимости от агроэкологических условий выращивания растений в Кировской области, для обоснования состава искусственных инфекционных фонов для проведения иммунологических исследований и работ по селекции культуры на территории области. В ходе опыта на микологический анализ отбирались растения с выраженными симптомами проявления заболевания.
В общей совокупности за время исследований из пораженных тканей растений клевера было выделено и идентифицировано 11 видов грибов рода Fusarium: F. avenaceum, F. culmorum, F. gibbosum, F. heterosporum, F. javanicum, F. moniliforme, F. oxysporum, F. redolens, F. sambucinum, F. solani, F. sporotrichiella. Изменение видового состава и частоты встречаемости видов грибов рода Fusarium вызывающих корневую гниль клевера лугового в зависимости от года исследования представлены в таблице 4 (рис. 5, приложение 3).
Доминирующее положение в патогенном ценозе фузариев за период исследований занимал вид F. oxysporum. Частота встречаемости патогена варьировала от 28,2 до 68% и в среднем составила 53,4%. Гриб вызывал на растениях корневую гниль, гораздо реже - увядание. F. oxysporum вьщеляли из корней, корневой шейки, нижней части стеблей растений клевера (табл. 5).
Наибольшая частота встречаемости вида F. avenaceum на корнях клевера была отмечена в 1994 и 1995 годах, и составила 15,5% и 15,7% соответственно. За период исследований распространенность патогена значительно варьировала от 2,2% до 15,7% и в среднем составила 8,9%. Микромицет выделялся из корней, корневой шейки и нижних узлов стеблей клевера (табл. 5). На пораженных растениях наблюдали следующие симптомы проявления заболевания, вызванные F. avenaceum: значительное потемнение тканей в области корневой шейки, темно-бурые пятна и язвы на поверхности корня. Во влажную погоду, в прикорневой области растений, гриб образовывал спороношение в виде оранжевых подушечек.
С наибольшей частотой встречаемости вид F. gibbosum идентифицировали в 1994 году - 17,5% и 1997 году - 17,7%. В среднем за период исследований распространенность патогена составила 8,9%. Гриб выделяли, в основном, из пораженных тканей корней и корневой шейки растений (табл. 5).
Частота встречаемости в патогенном ценозе фузариев вида F. heterosporum составила в среднем 13,5%. Гриб вьщеляли из пораженных корней, корневой шейки и нижней части стеблей растений (табл. 5).
В отдельные годы с высокой частотой встречаемости идентифицировали другие виды фузариев: в 1994 году - F. sporotrichiella (6,0%) и F. moniliforme (8,2%), в 1996 году -F. sambucinum (7,8%), в 1998 году - F. culmorum (10,8%), в 1999 - 2000 гг. - F. solani (13,8%). Однако в среднем по Кировской области за период исследований встречаемость каждого из видов не превышала 3,8%.
Частота встречаемости на корнях культуры F. redolens и F. javanicum была невысока и носила спорадический характер. По некоторым сообщениям в литературе среди выше перечисленных видов фузариев распространены изоляты обладающие патогенными свойствами в отношении растений клевера (Трейкале, 1987; Мезенцева, 1989 и др.). Однако, по видимому, их роль в поражении клевера лугового корневой гнилью на территории Кировской области была несущественной.
В ходе исследований было выявлено, что наиболее разнообразный видовой состав грибов рода Fusarium приходился на область корневой шейки растений — 11 видов (табл. 5). Непосредственно из корней клевера были выделены виды F. avenaceum, F. culmorum, F. gibbosum, F. heterosporum, F. oxysporum, F. sambucinum, F. solani, F. sporotrichiella. Область нижних узлов растений была представлена более бедным видовым составом - 6 видов, из них, наиболее часто встречались F. heterosporum, F. oxysporum, F. sporotrichiella.
Изучение влияния предшественника на формирование структуры патогенных популяций грибов, вызывающих корневые гнили люпина узколистного
На опытных посевах люпина сорта Кристалл отдела семеноводства была изучена структура патогенных популяций грибов, накапливающихся на корнях и нижних узлах стеблей культуры, при разном сочетании люпина в плодосмене: - вариант №1 - возделывание люпина после ячменя; - вариант № 2 - возделывание люпина после овса; - вариант № 3 - бессменное возделывание люпина в течение ряда лет. Растения для анализа отбирали в фазе цветения. Пораженные участки тканей закладывали на питательную среду и по мере роста колоний грибов проводили их идентификацию до родового и видового уровня. Инфицирование корней и узлов люпина патогенными мик-ромицетами приведены на рисунке 14. Из пораженных тканей растений были выделены патогенные грибы родов Fusarium, Pythium, Rhizoctonia, Pleiochaeta. Существенной разницы в видовом составе грибов, изолированных из корней и узлов растений по вариантам опытных посевов выявлено не было. Везде превалировали грибы рода Fusarium. Инфицирование корней люпина фузариями в варианте № 1 (после ячменя) составило 73%, в варианте № 2 (после овса) - 64%, а в варианте № 3 (при бессменном возделывании) - 69%. Из обнаруженных видов грибов рода Fusarium доминировал F. oxysporum. В меньшей степени были распространены F. Sporotrichioides, F. роае, F. avenaceum, F. solani, F. redolens, и др. Органоспецифической приуроченности грибов рода Fusarium выявлено не было - инфицирование патогенами, как корневой системы растений, так и нижних узлов стеблей, было значительным. В ходе исследований, была отмечена высокая зараженность корневой системы и нижней части стеблей люпина грибами рода Pythium в варианте № 2. Частота встречаемости патогенов на корнях растений составила 30%, шейке - 25%, на нижних узлах - 12%. Инфицирование люпина патогеном Pleiochaeta setosa варьировала в зависимости от варианта опыта (8-11%). Из поврежденных тканей растений были изолированы грибы Alternaria spp. Однако микромицеты выделялись обычно в комплексе с патогенными видами грибов, их распространенность не превышала 7%.
Следовательно, зерновые, используемые в качестве предшественников для люпина, не оказывают существенного влияния на формирование структуры патогенных популяций грибов вызывающих корневые гнили культуры. Таким образом, микологический анализ семян и вегетирующих растений люпина показал общность их патогенного состава - превалирование грибов рода Fusarium, при этом в патогенном ценозе доминировал F. oxysporum. Установлен комплексный характер инфицирования растительных тканей люпина патогенными и сапротрофными микромицетами, из которых общими представителями для семян и корней культуры являются виды родов Alternaria, Acremonium, Fusarium, Mucor, Penicillium, Rhizopus. Исследования проводили на экспериментальных посевах отдела «Эпифитотийные болезни зерновых культур», ВНИИФ. Изучение видового состава патогенных популяций грибов, их антагонистов и доминирующих сапротрофов на семенах, корнях и в области ризосферы различных сельскохозяйственных культур проводили с целью выявления видов или группы микромицетов, которые по полученным характеристикам (представленность в различных субстратах, распространенность, вредоносность и т.д.), можно было бы отнести к фитопатогенам-полифагам. В ходе работы использовали общепринятые фитопатологические и микологические методики исследований. Семена являются одним из основных источников сохранения и распространения патогенных микроорганизмов. Фитопатологическая экспертиза позволяет в лабораторных условиях определить количественный и качественный состав патогенов и сапротрофов, представленных в посевном материале, а также всхожесть семян, которая может изменяться в зависимости от зараженности их грибами и другой патогенной микрофлорой. Проведенная фитопатологическая экспертиза выявила невысокие посевные качества семян сельскохозяйственных культур, используемых в опыте. Патогенная микофлора зерна овса, яровой пшеницы, люпина, горчицы, рапса, гороха и вики была представлена грибами родов Botrytis, Fusarium, Bipolar is, Alternaria, Sclerotinia, Ascochyta. При проведении фитопатологической экспертизы в рулонах фильтровальной бумаги распространенность патогенных микромицетов на семенах исследуемых культур составила: на люпине - 18%, рапсе - 2%, горохе - 25%, яровой пшеницы - 72%, овсе - 59% (табл. 11,12). При анализе развития болезней проростков зерновых культур в рулонах фильтровальной бумаги были получены следующие результаты: - распространенность проростков семян яровой пшеницы сорта Энита с признаками поражения составила 36%, при этом показатель развития болезни достигал 19%; - распространенность проростков семян овса сорта Скакун с признаками поражения составила 14%, при этом показатель развития болезни достигал 8% (табл. 12).
