Содержание к диссертации
Введение
1. Современное состояние проблемы исследования. Обзор литературы 12
1.1. Засуха 12
1.2 Экологический стресс у растений 13
1.3. Засухоустойчивость растений, способы её определения 14
1.4. Сосна обыкновенная как объект исследования 19
1.4.1. Систематическое положение сосны обыкновенной 21
1.4.2. Ареал, почвенно-климатические условия произрастания сосны обыкновенной 21
1.4.3. Генетика сосны обыкновенной 23
1.5. Метод культуры ткани in vitro как один из подходов к изучению ответных реакций растений на заданный стресс 25
1.5.1. Моделирование засухи в условиях in vitro 28
1.6. Цитогенетический анализ как показатель стабильности репродуктивной системы растений в изменяющихся условиях окружающей среды 34
2. Природно-климатические условия на исследуемой территории 38
2.1. Физико-географические условия Воронежской области 38
2.2. Климатическая характеристика 40
2.3. Почвенный покров исследуемой местности 42
2.4. Растительный покров исследуемой местности 43
3. Объекты и методы исследований 45
3.1. Объекты исследований 45
3.2. Методы исследований 48
3.2.1. Методика получения каллусных культур in vitro сосны обыкновенной, анализ каллусогенезов 48
3.2.2. Определение уровня экспрессии генов стрессовых белков в первичных каллусных культурах in vitro сосны обыкновенной 52
3.2.3. Методика изготовления цитогенетических препаратов корешков проростков сосны обыкновенной 53
3.2.4. Статистическая обработка результатов 55
4 Использование метода культуры ткани in vitro для диагностики засухоустойчивости исходных деревьев сосны обыкновенной 56
4.1. Оптимизация условий культивирования каллусных культур in vitro сосны обыкновенной 57
4.2. Реакция каллусных культур in vitro сосны обыкновенной на условия культивирования 62
4.3. Реакция каллусных культур in vitro сосны обыкновенной в ответ на усиление стрессовой нагрузки в условиях культивирования 76
4.4. Подбор оптимальной концентрации NaCl для дифференцировки исходных генотипов сосны обыкновенной по чувствительности к заданному стрессору 77
4.5. Особенности каллусогенных реакций генотипов сосны обыкновенной в ответ на дополнительную стрессовую нагрузку 79
4.6. Экспрессия генов в первичных каллусных культурах in vitro сосны обыкновенной 82
5. Цитогенетический анализ семенного потомства деревьев сосны обыкновенной в годы, различающиеся по погодным условиям 87
6. Алгоритм использования биотест-системы на основе каллусных культур in vitro и цитогенетического анализа в лесной селекции и семеноводстве сосны обыкновенной 112
Общие выводы 121
Рекомендации производству 122
Список литературы 124
Приложение 149
Приложение А. Проект рекомендаций ФГБУ «ВНИИЛГИСбиотех» 150
Приложение Б. Справка о внедрении результатов научно исследовательской работы в учебный процесс 153
Приложение В. Гидротермические условия в годы исследования на территории Воронежской области 154
- Засухоустойчивость растений, способы её определения
- Оптимизация условий культивирования каллусных культур in vitro сосны обыкновенной
- Цитогенетический анализ семенного потомства деревьев сосны обыкновенной в годы, различающиеся по погодным условиям
- Алгоритм использования биотест-системы на основе каллусных культур in vitro и цитогенетического анализа в лесной селекции и семеноводстве сосны обыкновенной
Введение к работе
Актуальность темы. Pinus sylvestris L. – одна из основных
лесообразующих пород на территории Воронежской области. Данный вид
устойчив к действию естественных биотических и абиотических стрессоров
(Чернодубов и др., 1998). С середины прошлого столетия все чаще
наблюдаются природно-климатические аномалии (Peterson et al., 2013), среди
них на долю засух приходится 26% (Tugce et al., 2006). Несмотря на то, что
сосна обыкновенная засухоустойчива, степень ее толерантности к данному
стрессовому фактору ограничена. Свидетельством тому служит массовое
усыхание сосен на территории Воронежской области после засухи 2010г.
Однако часть деревьев выжила (Кузнецова, 2010). В связи с этим проблемы
интенсификации работ по отбору засухоустойчивых форм сосны обыкновенной
вышли на уровень наиболее актуальных проблем современности.
Засухоустойчивыми принято считать не только выжившие в условиях засухи генотипы, но и способные к половой репродукции (Tardieu, 2005).
Цель работы – изучение индивидуальной изменчивости деревьев сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости и разработка рекомендаций по оценке генотипов для проведения селекционных работ.
Задачи исследования:
-
Изучить реакцию каллусных культур in vitro отдельных генотипов сосны обыкновенной на условия культивирования, выявить наиболее информативные и простые в применении критерии оценки каллусогеннных реакций.
-
Разработать растительную биотест-систему на основе каллусных культур in vitro для оценки деревьев сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости.
-
Проанализировать уровень экспрессии генов стрессовых белков в первичных каллусных культурах in vitro сосны обыкновенной.
-
Выполнить цитогенетический анализ семенного потомства одних и тех же деревьев сосны обыкновенной в различающиеся по погодным условиям годы.
-
Выявить индивидуальную изменчивость генотипов сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости с помощью биотест-системы на основе каллусных культур in vitro и цитогенетического анализа семенного потомства.
-
Разработать алгоритм использования биотест-системы на основе каллусных культур in vitro и цитогенетического анализа семенного потомства в лесной селекции и семеноводстве сосны обыкновенной.
Научная новизна. Экспериментально подобраны оптимальный состав питательной среды и тип экспланта для культивирования каллусных культур in vitro сосны обыкновенной. Определен наиболее информативный и простой в своем применении параметр оценки реакции каллусных культур на условия культивирования – жизнеспособность. Установлена оптимальная концентрация NaCl для возможности дифференцировки каллусных культур и, соответственно, исходных деревьев по степени устойчивости к заданному стрессору. Показана изменчивость реакции каллусных культур in vitro в ответ на условия
культивирования в зависимости от исходного генотипа. Выявлена
корреляционная связь между уровнем экспрессии гена AbaH и показателем жизнеспособности каллусных культур. В ходе цитогенетического анализа семенного потомства сосны обыкновенной в динамике лет (благоприятные и засушливые) установлена изменчивость частоты и спектра патологий митоза, а также доли клеток с микроядрами в зависимости от генотипа.
На защиту выносятся следующие положения.
-
Биотест-система для ранней диагностики засухоустойчивости деревьев сосны обыкновенной на основе каллусных культур in vitro.
-
Изменчивость цитогенетических показателей семенного потомства одних и тех же генотипов сосны обыкновенной в динамике лет (засушливые и благоприятные).
-
Алгоритм использования биотест-системы на основе каллусных культур in vitro и цитогенетического анализа семенного потомства в лесной селекции и семеноводстве сосны обыкновенной.
Практическая значимость. Разработана биотест-система на основе каллусных культур in vitro для оценки генотипов сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости.
С помощью данной биотест-системы и цитогенетического анализа
показана возможность отбора засухоустойчивых деревьев сосны
обыкновенной, дающих генетически стабильное семенное потомство. На
основе полученных результатов для проведения селекционных работ
рекомендуем использовать деревья 83, 94, 10, 28, 41. Разработан алгоритм
использования биотест-системы на основе каллусных культур in vitro и
цитогенетического анализа семенного потомства в практике лесной селекции и
семеноводства для выделения засухоустойчивых генотипов сосны
обыкновенной.
Полученные результаты вошли в «Проект рекомендаций по
использованию традиционных и привлечению новых генетических параметров
для оценки разнообразия и устойчивости лесных древесных видов и для
создания селекционных объектов разного целевого назначения» (ФГБУ
«ВНИИЛГИСбиотех», Воронеж, 2016), также результаты научно-
исследовательской работы внедрены в учебный процесс на кафедре генетики, цитологии и биоинженерии медико-биологического факультета ФГБОУ ВО «ВГУ».
Обоснованность и достоверность результатов подтверждается
значительным объемом экспериментального материала, применением
современных методов статистического анализа и использованием
общепринятых в биологии методов исследования.
Личный вклад. Автором сформулированы цели и задачи исследования, собран и проанализирован экспериментальный материал. Обобщены результаты исследований, на основе чего предложено практическое применение метода культуры ткани in vitro с целью ранней диагностики засухоустойчивости исходных деревьев.
На основе проведенных исследований разработан алгоритм
использования биотест-системы с использованием каллусных культур in vitro и
цитогенетического анализа семенного потомства для оценки
засухоустойчивости сосны обыкновенной.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследований
были доложены и обсуждены на VIII Международной научной конференции
«Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, 2013г.);
Всероссийской конференции с международным участием «Состояние лесов и
актуальные проблемы лесоуправления» (Хабаровск, 2013 г.); IV, V, VI
Международной научно-практической конференции «Инновации и технологии
в лесном хозяйстве» (ITF, Санкт-Петербург, 2013, 2014, 2016гг.); VI Съезде
Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и
ассоциированных генетических симпозиумов (Ростов-на-Дону, 2014г.);
Международной научно-практической конференции: «Размножение лесных
растений в культуре in vitro как основа плантационного лесовыращивания»
(Йошкар-Ола, 2014г.); конференции молодых ученых «Научные исследования –
будущее лесного комплекса» (Казань, 2015г.); научно-практической
конференции «Современные проблемы лесной генетики, селекции,
биотехнологии и интродукции» (Воронеж, 2015); Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2017г.); Всероссийской научно-практической конференции «Современная лесная наука: проблемы и перспективы» (Воронеж, 2017); 18-й Всероссийской молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2018).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 4 публикации в рецензируемых журналах, включенных в «Перечень …» ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, общих выводов, рекомендаций производству, списка использованных источников. Работа содержит 40 рисунков, 7 таблиц, список литературы включает 243 источника, в том числе 60 – на иностранных языках.
Засухоустойчивость растений, способы её определения
Для нормального функционирования клетки необходимо поддержание водного баланса, а именно – соответствующего соотношения между поступлением и расходованием воды.
Существует немалое количество стрессоров различной природы, ведущих к возникновению водного дефицита в растительном организме, то есть к повышению расходования воды относительно её потребления. К ним относят: высокие и низкие температуры, засуху, ветер, мороз. Во всех случаях будут функционировать одни и те же механизмы, направленные на понижение внутриклеточного водного потенциала и защиту жизненно важных макромолекул и структур клетки.
Засухоустойчивость – это способность растений переносить длительные засушливые периоды, водный дефицит, обезвоживание клеток, тканей, органов с наименьшим снижением вегетативной и генеративной продуктивности. Проявление засухоустойчивости обусловлено, в первую очередь, генетическими особенностями организма (является полигенным признаком), а также зависит от местообитания растения, степени его адаптации к дефициту влаги (Генкель, 1982).
Механизмы, обеспечивающие засухоустойчивость растений, можно свести в следующую схему (рисунок 1).
В ответ на засуху происходит нарушение водного режима, что отражается на всех физиологических функциях: усиливаются гидролитические процессы (в клетках наблюдается распад сложных соединений). Всё это приводит к накоплению токсических концентраций NH3 и последующему разрушению цитоплазматических структур и мембранных барьеров; нарушению синтеза и распаду хлорофиллов и других пигментов фотосинтеза и, как следствие, к резкому снижению фотосинтетической активности, усиленному синтезу абсцизовой кислоты, снижению количества ауксинов и цитокининов; разобщению транспорта электронов и фотофосфорилирования; нарушению нормального хода фотохимических реакций и реакций ферментативного восстановления СO2; нарушению структуры хлоропластов; задержке оттока ассимилятов из клеток.
Наиболее чувствителен к засухе процесс роста, темпы которого при нарастающем недостатке влаги снижаются значительно раньше по сравнению с фотосинтезом и дыханием. Последствия дефицита воды многообразны. В клетках снижается содержание свободной воды, возрастает концентрация вакуолярного сока, снижается его рН, что влияет на гидратированность белков цитоплазмы и активность ферментов. Изменяются степень дисперсности и адсорбирующая способность цитоплазмы, ее вязкость. Возрастают проницаемость мембран и выход ионов из клеток, в том числе из листьев и корней (экзоосмос); эти клетки теряют способность к поглощению питательных веществ. В случае, когда водный дефицит долго не прекращается, наблюдается нарушение нуклеинового обмена, приостанавливается синтез и усиливается распад ДНК. В листьях снижается синтез и усиливается распад всех видов РНК, полисомы распадаются на рибосомы и субъединицы. Прекращение митоза, усиление распада белков при прогрессирующем обезвоживании приводят к гибели растения (Федулов и др., 2015).
Условно механизмы засухоустойчивости разделяют на следующие три основных типа:
- избегание засухи: способность растения вырасти и завершить свой жизненный цикл до наступления повреждающего водного дефицита;
- выносливость к засухе при высоком водном потенциале тканей: способность растения выносить засушливые периоды, поддерживая при этом в тканях высокий водный потенциал;
- выносливость к засухе при низком водном потенциале тканей: способность растения выдерживать засуху при низком водном потенциале тканей (Пахомова, 1999).
Для наиболее засухоустойчивых растений характерна развитая корневая система, высокое корневое давление, значительная водоудерживающая способность тканей, обусловленная накоплением в вакуолях осмотически активных веществ (углеводов, органических кислот, растворимых форм азота и ионов минеральных веществ).
Недостаток воды в тканях растений возникает из-за превышения ее расхода на транспирацию над поступлением из почвы. Это часто наблюдается в жаркую солнечную погоду к середине дня. При этом содержание воды в листьях снижается на 25-28 % по сравнению с утренним, растения утрачивают тургор и завядают. В результате снижается и водный потенциал листьев, что активизирует поступление воды из почвы в растение.
Изменение кальциевого гомеостаза является одной из наиболее ранних реакций растений на действие стрессоров различной природы, в том числе и засухи (Penfield, 2008).
Общепризнанным механизмом клеточной адаптации к условиям засухи является повышение концентрации аминокислоты пролин, что связывают с распадом хлорофилла и белков. Однако повышение содержания пролина происходит и при действии других стресс-факторов, оказывающих осмотический эффект: засоление, образование льда в межклетниках под влиянием отрицательных температур и др. Также увеличение содержания пролина зарегистрировано и при действии стрессоров иной природы: тяжелых металлов, ультрафиолета и даже авирулентных патогенов, что свидетельствует о полифункциональной роли пролина.
Установлено, что пролин выполняет осмопротекторную, шаперонную (способен предотвращать образование агрегатов белковых молекул (Samuel et al., 2000)), антиоксидантную, сигнально-регуляторную функции, принимает участие в регуляции экспрессии некоторых генов и другие функции (Szabados et al., 2009; Carvalho et al., 2013). Также пролин выполняет ряд функций и в физиологически нормальных условиях: значительное его количество транспортируется в репродуктивные органы растений. Так, накопление пролина считается одним из важных сигналов для перехода к цветению, пролин необходим для нормального развития пыльцы и семян (Schawacke et al., 1999).
Сигналом к синтезу пролина в стрессовых условиях может быть накопление ионов кальция и активных форм кислорода, а также гормонов – абсцизовой и салициловой кислот. Еще одним сигнальным посредником, задействованным в процессах индуцирования синтеза пролина, может быть пероксид водорода (Yang et al., 2010). Одним из перспективных способов оценки засухоустойчивости растений является определение уровня абсцизовой кислоты. Данный фитогормон, накапливаясь в растениях при дефиците воды, запускает ряд процессов, направленных как на ограничение испарения воды листьями за счет уменьшения их площади и закрытия устьиц (Davies et al., 2005), так и повышение устойчивости растений к обезвоживанию: запуск антиоксидантных систем, синтез осмопротекторов и т.д. (Шакирова, 2001).
Устойчивость растений к тепловому и водному стрессам также связана и с физическими свойствами мембран и индукцией генов стрессовых белков (Александров и др., 1994; Sung et al., 2003; Wahid et al., 2007). Установлена прямая корреляция между термостабильностью мембран и выносливостью растений разных видов к тепловому шоку (Wahid et al., 2007). Одной из важных составляющих ответов растений на действие повышенных температур и водного дефицита является экспрессия генов и синтез белков теплового шока (БТШ). Во многих работах приводится зависимость термовыносливости растений от индукции БТШ (Vierling et al., 1991; Александров и др., 1994; Wahid et al., 2007). Некоторые из них синтезируются не только при повышенной температуре, но и при других стресс-факторах. При этом каждая клетка синтезирует десятки тысяч копий различных молекул белков теплового шока, затем количество их начинает уменьшаться, т.е. синтез БТШ имеет кратковременный характер. Длительный синтез невозможен из-за энергозатратности процесса. Действие белков теплового шока приурочено к начальному периоду ответа растений на повышение температуры. БТШ, временно защищая организм от гибели, тем самым создают условия для его последующей долговременной адаптации (Лозовская и др., 1982; Кузнецов и др., 2005).
Оптимизация условий культивирования каллусных культур in vitro сосны обыкновенной
В каждом опыте по оптимизации условий культивирования было задействовано не менее 8 различных генотипов сосны обыкновенной из Ступинского насаждения, опыт выполнялся в трехкратной повторности, брали не менее 10 асептических эксплантов для каждого генотипа.
Рядом авторов было показано, что на безгормональной питательной среде каллусные культуры останавливаются в росте с последующей гибелью в течение 1 -го пассажа. В связи с этим в наших исследований в качестве индукторов каллусогенезов использовали а-НУК, 2,4Д, 6-БАП, кинетин в различных концентрациях и сочетаниях:
а-НУК - (2) мг/л;
2,4Д - (1-2) мг/л;
6-БАП - (0,5-1) мг/л;
кинетин -(1) мг/л.
Испытано 5 вариантов питательных сред, различающихся гормональным составом:
№1 - У2 MS + кинетин (0,5 мг/л) + 6-БАП (0,5 мг/л);
№2 - у2 MS + кинетин (1 мг/л) + 2,4-Д (1 мг/л);
№3 - у2 MS + кинетин (1 мг/л) + 2,4-Д (2 мг/л);
№4 - у2 MS + 6-БАП (0,5 мг/л) + НУК (2 мг/л) + 2,4-Д (1 мг/л);
№5 - у2 MS + 6-БАП (1 мг/л) + 2,4-Д (1 мг/л).
Установлено, что скорость формирования первичной каллусной ткани (СК) на питательных средах № 1, 4, 5 наступает достоверно раньше - на 5,7±0,3; 5,7±0,7; 6,3±0,3 сутки соответственно (рисунок 12а), чем на вариантах сред № 2 и 3, где каллус формируется к 8,3±0,3 и 10,0±1,2 суткам. Показатели частоты формирования каллусной ткани (ЧК) на средах № 1, 4, 5 также превышали таковые показатели на вариантах питательных сред № 2 и 3: 92,0±2,9; 95,0±2,3 и 89,0±5,0% против 86,0±2,0 и 77,0±8,3 соответственно (рисунок 12б).
Однако по показателю жизнеспособности каллусных культур среда №4 дает лучшие результаты по сравнению с остальными (рисунок 12в): к завершающему этапу культивирования (20-25сутки) наименьшее количество культур с имеющимися очагами мертвой ткани отмечается именно на этом варианте среды, что достоверно выше по сравнению с остальными. То есть, если к 15 суткам культивирования на питательных средах 1, 2, 3, 5 более 50% каллусных культур имеют очаги мертвой ткани, то на варианте №4 процент каллусов с участками некроза составляет всего лишь 34,0±1,4%.
В связи со всем вышесказанным в наших дальнейших исследованиях мы использовали вариант среды №4: MS + 6-БАП (0,5 мг/л) + НУК (2 мг/л) + 2,4-Д (1 мг/л).
Создание тест-систем на базе биотехнологических приёмов основывается на получении клеточных культур in vitro, моделировании стрессовых ситуаций, получении быстрых ответов, доступных для учёта, позволяющих делать выводы о физиологическом состоянии интактных растений. Обширные, хорошо разработанные приёмы, методы получения каллусных культур in vitro, описания которых можно найти во многих обзорах, руководствах (Murashige et al., 1962; Яцына и др., 1997; Терлецкая, 2008; Филиппова, 2010) позволяют получать каллусные культуры, используя любые части растения.
При подборе наиболее оптимального типа экспланта для получения первичных каллусных культур in vitro использовали стеблевые сегменты молодых и двулетних побегов сосны обыкновенной.
Было установлено, что частота каллусогенезов (ЧК) у эксплантов, различающихся по возрасту, неодинакова (рисунок 13): на однолетних достоверно больше, чем на двулетних. Объясняется это, вероятнее всего, следующим. Каллус, как правило, формируется из камбиальной зоны побега. За счет активного деления меристематических клеток камбия осуществляется рост деревьев по диаметру, а так же происходит формирование каллуса в случае поранения растения (Крамер и др., 1963).
В процессе получения эксплантов для дальнейшего роста каллусных культур из двулетних побегов в асептических условиях ламинар-бокса мы удаляли с них слой первичной коры, включающей в себя: пробку (рисунок 14), паренхиму (рисунок 14.2), флоэму (рисунок 14.3) с целью исключения дополнительной возможности инфицирования введенного в культуру материала, так как в течение жизни в коре накапливаются различные возбудители инфекций и поллютанты. В связи с тем, что зона камбия граничит со слоем первичной коры (рисунок 14), возможно, в ходе её срезания удалялся и слой камбия, то есть возможность формирования каллусной ткани сводилась к минимуму.
Таким образом, применение двулетних побегов в качестве эксплантов для получения каллусных культур in vitro становится нецелесообразным, либо необходимо разрабатывать новые режимы стерилизации, исключающие удаление первичной коры с побега.
В дальнейших экспериметах по получению первичных каллусных культур мы использовали однолетние зеленые побеги сосны (рисунок 15).
Цитогенетический анализ семенного потомства деревьев сосны обыкновенной в годы, различающиеся по погодным условиям
Проанализировано семенное потомство одних и тех же деревьев сосны обыкновенной в различающиеся по погодным условиям годы.
В 2010г. на территории всего ЦЧР действовали 2 антициклона (Шакина, 2011): весенний и летний. Первый наблюдался с последних чисел апреля до середины мая, стал причиной аномально теплой погоды. Он сдвинул основные репродуктивные процессы сосны на более ранние сроки: пыление пришлось на 10 мая, вслед за ним переместились и остальные репродуктивные процессы (рост пыльцевых трубок, оогенез, оплодотворение и др.). Летняя засуха (атмосферная и почвенная) началась с III декады июня (рисунок 29, приложение В, таблица 1). В этот год были зафиксированы 3 температурных рекорда за последние десятилетия в каждый летний месяц: 28 июня – 38.9С (общее отклонение от нормы в июне +3,9С), 29 июля – 40.1С (общее отклонение от нормы в июле +6,7С – рекорд), 2 августа – 40.5С (общее отклонение от нормы в августе +7,1С – рекорд)(http://www.pogodaiklimat.ru). Запасов влаги в почве почти не осталось – от 0 до 5 мм. Дождей в ЦЧР не было около 6 декад: в июне выпало всего лишь 49% нормы осадков, в июле – 47%, в августе – 56% (http://www.pogodaiklimat.ru). Закончилась засуха в середине III декады августа. Её основное воздействие на генеративную сферу пришлось в это время.
На территории Воронежской области действие весеннего антициклона пришлось на завершающую фазу формирования пыльцы и ее вылет в шишках 1-го года развития, а прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок (2-я половина мая – 1-я половина июня) проходили в оптимальных условиях. Таким образом, к середине июня пыльцевые трубки завершили свой рост, шишки, закончив процесс геотропического движения, перешли в состояние покоя и находятся в тени отросшей хвои текущего года.
Выход репродуктивных структур из состояния покоя, интенсивный рост пыльцевых трубок и формирование семяпочек в шишках 2-го года развития начались в начале мая на фоне повышенного температурного режима, отсутствия осадков, пониженного запаса влаги в почве. Возможно, это послужило причиной уменьшения числа семян в шишках, а также отсутствия или небольшого числа мелких недоразвитых капсул в структуре зрелых шишек. Выжившие после гидротермического шока семяпочки и пыльцевые трубки продолжили свое развитие. Во второй половине мая формирование мужских и женских гамет в шишках 2-го года развития происходило в оптимальных погодных условиях вплоть до оплодотворения. Оплодотворение у сосны, если исходить из суммы эффективных температур необходимых для данного процесса в регионе, также было ранним – первые числа июня. А поскольку основная засуха началась в конце июня, то процессы оплодотворения, проэмбриогенеза и большая часть раннего эмбриогенеза, несколько смещенные относительно средних региональных сроков, у сосны успели пройти до ее начала засухи. Таким образом, благодаря сдвигу репродуктивных процессов в начале мая и оптимальным погодным условиям во II и III-й декаде мая основные критические точки репродуктивного цикла не попали под ее действие.
В этот год были нарушены репродуктивные процессы у сосны обыкновенной, что привело к опаду шишек 2-го года развития на всей территории Воронежской области. В этот год шишки удалось собрать только с деревьев сорта-популяции сосна Острогожская (Кузнецова, 2015 (а, б)).
В 2014 году наблюдалась поздняя осенняя засуха. В августе и сентябре наблюдалось незначительное повышение температуры воздуха: +2,6С и +1,1С соответственно, однако в сентябре выпало 8% от нормы осадков (http://www.pogodaiklimat.ru, приложение В, таблица 3). В основном эта засуха оказала воздействие на вегетативную сферу сосны: пожелтение и опад хвои. Кроме того наблюдалось раннее раскрывание шишек (Кузнецова, 2015 (а,б)).
2015г. – оптимальный по климатическим условиям. Анализ вели по 4-м параметрам: частота и спектр патологий митоза, частота встречаемости микроядер, митотическая активность.
Известно, что даже у организмов, существующих в оптимальных условиях, спонтанно возникают клетки, несущие различные хромосомные изменения, хотя частота и спектр таких нарушений обычно невелики. В норме клетки, имеющие несбалансированные хромосомные изменения, элиминируются из клеточной популяции, большая часть нарушений в структуре ДНК репарируется (Захаров, 1995). В то же время считают, что у каждого вида система репарации защищает геном до определенного уровня воздействия мутагенного фактора (Шафикова, 1999). По достижении критических нагрузок защитные механизмы клетки не могут устранить повреждающее действие стрессовых факторов.
Во многих исследованиях показано, что одним из наиболее информативных параметров, достоверно отражающих уровень повреждения ДНК и степень воздействия того или иного стрессового фактора на состояние генеративной сферы сосны обыкновенной, является частота патологий митоза (ПМ). Его значение характеризует интенсивность мутационного процесса в клеточных популяциях организма (Буторина и др., 2000; Сенькевич, 2007; Калаев, 2009; Пардаева и др., 2013). Исследование нарушений митотических циклов позволяет выявлять ранние изменения цитогенетической системы организма, когда еще нет видимых фенотипических проявлений этих изменений, и прогнозировать возможное в дальнейшем состояние системы в изменяющихся условиях окружающей среды. Метод учета хромосомных аберраций как на стадиях метафазы, анафазы, телофазы дает возможность получить подробную информацию о наличии или отсутствии пролиферативной активности клеток, её частоте, позволяет косвенно охарактеризовать иммунный статус организма, предоставляя возможность оценить цитогенетическую стабильность организма.
Известно, что у организмов, существующих и в оптимальных условиях, спонтанно возникают клетки, несущие различные хромосомные изменения (спонтанные мутации), хотя уровень частоты и спектра подобных нарушений обычно невелик. В норме такие клетки, имеющие хромосомные изменения, элиминируются из клеточной популяции, большая часть нарушений в структуре ДНК репарируется (Захаров и др., 1995). Однако система репарации защищает геном до определенного уровня воздействия стрессового фактора (Шафикова, 1999), по достижении критических нагрузок защитные механизмы клетки не могут устранить повреждающее действие стрессора.
Проростки анализировали для каждого дерева отдельно, так как перед нами стояла задача по выявлению реакции отдельных генотипов на стрессовые условия в виде засухи.
Рядом исследователей установлено, что в средней полосе России для сосны обыкновенной уровень частоты ПМ в норме не должен превышать 5% (Дорошев, 2004; Буторина и др., 2005, 2007; Федорков, 2011).
Из таблицы 3, рисунка 30 видно, что по данному параметру ни в один год исследования значительных превышений не отмечено. Если обратить внимание на показатель частоты ПМ в 2012г. (весенняя засуха), то можно увидеть завышенное значение только для потомства д. 18 сосны Острогожской – 5,1±2,3%. Для деревьев Ступинской популяции в этот год собрать шишки вовсе не удалось, урожай полностью отсутствовал. Оба факта объясняются действием засухи 2012г., результатом которой был неурожай шишек по всему ЦЧР (Пардаева и др., 2017).
В другие годы исследования потомство отдельных деревьев сильнее реагировало на засушливые погодные условия. Так для д.90, 96, 98 из насаждения «Ступино» в различные годы значения уровня ПМ колебалось от 1,9±0,5% (д. 96 в 2011г.) до 4,5±1,1% (д.98 в 2015г.). Однако стоит отметить, что для д.012 в 2014г. также отмечался повышенный уровень частоты ПМ - 4,5±1,1%, в то время как в другие годы исследования это значение не превышало 1,6±0,6%. Данный факт можно объяснить влиянием осенней засухи.
В случае, когда хромосомные аберрации не восстанавливаются, могут возникать микроядра (рисунок 31), которые, в свою очередь, приводят к цитогенетической нестабильности клеточных популяций (Ильинских и др., 2013; Буторина и др., 2005).
Алгоритм использования биотест-системы на основе каллусных культур in vitro и цитогенетического анализа в лесной селекции и семеноводстве сосны обыкновенной
В настоящий момент в лесной селекции и семеноводстве сосны обыкновенной в основном используются только классические подходы для оценки генотипов (отбор плюсовых деревьев по фенотипическим признакам, оценка их семенного потомства, изучение морфологических признаков генеративной сферы и др.). Для повышения эффективности процесса селекции необходимо применение новых подходов, учитывающих индивидуальный анализ деревьев на молекулярном, субклеточном и клеточном уровнях.
В соответствии с «Правилами создания и выделения объектов лесного семеноводства (лесосеменных плантаций, постоянных лесосеменных участков и подобных объектов)» в Российской Федерации организация лесного семеноводства предусматривает выполнение ряда мероприятий, включая отбор плюсовых деревьев, их генетическую оценку по семенному потомству в испытательных культурах, создание архивов клонов, маточных и лесосеменных плантаций (Правила создания и выделения объектов лесного семеноводства, 2016). На разных этапах реализации комплекса мероприятий по лесному семеноводству данный документ предусматривает оценку древесных растений по устойчивости к неблагоприятным факторам среды. В частности, в п.6 говорится «При селекционной инвентаризации в категорию плюсовых отбираются деревья, отличающиеся прямоствольностью, полнодревесностью, хорошим очищением стволов от сучьев, отсутствием вильчатости, устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, вредителям и болезням» (Правила создания и выделения объектов лесного семеноводства, 2016). Также в п. 30, посвященному оценке семенных потомств плюсовых деревьев в испытательных культурах, указано, что «на первом этапе (по достижении потомствами II класса возраста) из дальнейшего использования исключаются деревья, потомства которых характеризуются резко выраженной неустойчивостью к болезням, вредителям и другим неблагоприятным факторам среды, а также занимающие низшие ранги в испытываемой совокупности по селектируемому признаку» (Правила создания и выделения объектов лесного семеноводства, 2016). В связи с этим актуальной является разработка подходов по оценке устойчивости деревьев к различным стрессовым факторам.
В качестве неблагоприятного фактора среды, относительно которого оценивается устойчивость деревьев, нами выбрана засуха. Объясняется это тем, что ввиду глобального потепления климата, количество и сила засух в последние десятилетия увеличиваются (Фролов и др., 2014; Переведенцев и др., 2007). Кроме того, имеются работы, в которых установлена корреляционная связь между засухоустойчивостью сосны обыкновенной и её высотой. В частности, показана возможность использования водоудерживающей способности хвои как интегрального признака для оценки устойчивости и роста растений при создании объектов единого генетико-селекционного комплекса (Котов и др., 1995, 2002).
Для оценки деревьев сосны обыкновенной по устойчивости к засухе, мы рекомендуем использовать биотест-систему на основе каллусных культур in vitro и цитогенетический анализ семенного потомства. У видов, размножающихся семенным путем, к числу которых относится и сосна обыкновенная, наиболее чувствительна к засухе генеративная сфера (Кузнецова, 2010). Цитогенетический анализ семенного потомства в силу своей высокой чувствительности позволяет оценить степень влияния того или иного стрессового фактора, в том числе и засухи, на состояние генеративной сферы сосны обыкновенной (Духарев и др., 1988).
Для иллюстрации возможности комплексного использования биотест системы на основе каллусных культур in vitro и цитогенетического анализа популяции сосна Острогожская и Ступинской популяции. Результаты проведенных исследований, подтверждают факт разделения стратегий выживания растений в экстремальных условиях. В таблице 7 приведены данные, полученные нами при использовании различных методик: на основе биотехнологического метода культуры ткани in vitro исследовали степень стрессоустойчивости исходных деревьев сосны обыкновенной; с помощью цитогенетического анализа семенного потомства (в таблице 7 приведены данные 2010 и 2015гг.) характеризовали состояние генеративной сферы отдельных деревьев в годы засух, а также в годы оптимальные по погодным условиям.
Из таблицы 7 следует, что часть исследуемых деревьев имели высокие показатели согласно результатам, полученным на основе использованных методик (д. 83, 94, 10, 28, 41). Так, например, семенное потомство д. 83 из Ступинской популяции в год аномальной засухи (2010г.) характеризуется низким уровнем частоты ПМ (1,1±0,1%). Уровень МА в оптимальный год – 2015г. (следовал за 2014г. – год осенней засухи) также в пределах нормы – 7,1±0,4%. Что касается каллусогенной способности эксплантов данного дерева в условиях культивирования с дополнительной стрессовой нагрузкой, то для д. 83 также отмечаются высокие показатели. Первые следы каллусной ткани стали появляться уже к 5 суткам культивирования, показатель частоты каллусогенезов составил 87,8±3,6%, интенсивность прироста каллусной ткани отмечается высшим баллом – 3. Жизнеспособность каллусов д.83 была высокой не только на среде без усиленной стрессовой нагрузки (21,3±0,3сут.), но и в моделируемых условиях засухи на среде с добавлением NaCl (1%) – 18,9±1,0сут.
Для других деревьев (д. 90, 96, 98, 4, 18) были характерны низкие показатели цитогенетических параметров и каллусогенных реакций. Так, для д.98 в 2010г. (аномально засушливое лето), отмечался высокий уровень ПМ, однако не превышающий норму в 5%, – 3,0±0,6%, низкий уровень МА в потомстве 2015г. – 5,1±0,2%. Формирование каллуса пришлось на 10-12 сутки культивирования. Интенсивность прироста каллусной ткани составила 1,2±0,2 балла, частота каллусогенезов – 50,3±6,8%, жизнеспособность культур – 7,3±0,3сут., что в 3 раза меньше, чем у д.83. Стоит отметить, что в условиях моделируемой засухи, на питательной среде с добавлением NaCl (1%), рост каллусной ткани д.98 полностью прекращался, и к 10-15 суткам культивирования наблюдалась их 100% некротизация.
Также выделялись деревья, для которых показатели каллусогенных реакций были невысокими (д. 012), однако значения цитогенетических параметров демонстрировали хорошие результаты. Несмотря на то, что для семенного потомства д.012 2010г. отмечались невысокие значения ПМ (1,3±0,1%) и незначительно пониженный уровень МА – 5,5±0,8%, показатели каллусогенных реакций были низкими. Каллусная ткань формировалась только в 52,0±1,4% случаев. И, несмотря на то, что интенсивность каллусогенезов на эксплантах данного дерева оценивалась достаточно высоко – 2,4±0,3 балла, жизнеспособность была непродолжительной – 7,0±4,5сут. На питательной среде с добавлением селективного фактора, рост каллусной ткани полностью прекращался.
Из изученных деревьев по результатам оценки для проведения селекционных работ можно рекомендовать использовать деревья 83, 94, 10, 28, 41, чьи эксплаты демонстрируют лучшие результаты каллусогенной активности и чье потомство отличается наименьшим количеством патологий, а также уровнем митотической активности, не выходящим за пределы нормы, в годы засух.
Таким образом, но основе полученных данных, можно говорить о возможности комплексной оценки деревьев сосны обыкновенной по засухоустойчивости на основе анализа каллусогенной активности и результатов цитогенетического анализа.
Для повышения эффективности селекционного процесса был разработан алгоритм использования биотест-системы на основе каллусных культур in vitro и цитогенетического анализа в лесной селекции и семеноводстве (рисунок 39).
На этапе отбора плюсовых деревьев рекомендуется использование биотест-системы на основе каллусных культур in vitro для оценки их засухоустойчивости. При селекции сосны обыкновенной на продуктивность ствола, помимо обозначенных в «Правилах выделения и создания объектов лесного семеноводства» требований к плюсовым деревьям по высоте и диаметру, показатели каллусогенных реакций могут являться одним из критериев оценки устойчивости к неблагоприятным факторам среды.
При создании архивов клонов и маточных плантаций, плюсовые деревья прошедшие дополнительную оценку по засухоустойчивости, следует в первую очередь включать в состав архивов клонов и маточных плантаций. Закладка архивов клонов и маточных плантаций требует больших финансовых и трудовых затрат, поэтому желательно на данных объектах концентрировать плюсовые деревья, которые в будущем будут с большей вероятностью использованы при создании лесосеменных плантаций более высоких порядков (повышенной генетической ценности и II порядка). На наш взгляд, плюсовые деревья, при отборе которых кроме использования традиционных критериев, дополнительно оценивают устойчивость к неблагоприятным факторам среды, с наименьшей вероятностью будут выбраковываться на этапе предварительной и окончательной генетической оценки по семенному потомству.