Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Механизмы формирования острой экзогенной гипоксии. пути её фармакологической коррекции антигипоксантами (обзор литературы) 20
1.1. Основные механизмы адаптации организма к гипоксии 23
1.2. Гипоксические состояния экзогенной природы 25
1.2.1. Экзогенная гипоксическая нормобарическая гипоксия и её проявления .25
1.2.2. Экзогенная гипоксическая гипобарическая гипоксия и её проявления 28
1.3. Биоэлектрическая активность головного мозга на фоне острой экзогенной гипоксии 34
1.4. Энергетический обмен нейронов головного мозга на фоне острой экзогенной гипоксии 39
1.5 Фармакологическая коррекция остроформирующихся гипоксических состояний .45
1.6. Металлокомплексные соединения 52
1.7. Цинк и селен как факторы защиты организма .58
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .67
2.1. Экспериментальные животные .67
2.2. Селенсоддержащие металлокомплексные соединения (Zn2+) и вещества сравнения 67
2.2.1. Селенсоддержащие металлокомплексные (Zn2+) соединения 67
2.2.2. Вещества сравнения 68
2.3. Моделирование острой экзогенной гипоксии 69
2.3.1. Острая экзогенная гипоксия с гиперкапнией у мелких грызунов
2.3.2. Острая экзогенная гипобарическая гипоксия у мышей 71
2.3.3. Острая экзогенная гипоксия без гиперкапнии у крыс .72
2.3.4. Периодическая (интервальная) дыхательная асфиксия у кошек .74
2.3.5. Острая экзогенная гипоксия с гиперкапнией у кошек 75 2.4. Методы исследования .77
2.4.1. Регистрация ЭКГ у крыс и кошек .77
2.4.2. Регистрация параметров внешнего дыхания у крыс 78
2.4.3. Регистрация импеданскардиограммы и электрокардиограммы изолированного нефиксированного сердца 79
2.4.4. Измерение ректальной температуры у мышей, крыс и кошек .81
2.4.5. Определение стандартного энергетического обмена у крыс 81
2.4.6. Определение содержания кислорода и углекислого газа
во вдыхаемом воздухе 84
2.4.7. Определение средней летальной и средней эффективной доз химических соединений 84
2.4.8. Изучение условнорефлекторной деятельности мышей по пока-зателям избегательного оборонительного условного рефлекса 88
2.4.9. Регистрация вызванных потенциалов соматосенсорной коры у кошек 90
2.4.10. Статистическая обработка результатов исследования .92
Собственные исследования 91
Глава 3. Влияние исследованных веществ на продол-жительность жизни мышей и резервное время при экзогенных формах острой гипоксии и на ректальную температру 93
3.1. Влияние селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений и веществ сравнения на продолжительность жизни мышей в условиях острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией 95
3.1.1. Селенсодержащие металлокомплексные соединения 4
3.1.2. Вещества сравнения 101
3.2. Влияние селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений и веществ сравнения на резервное время мышей в условиях острой экзогенной гипобарической гипоксии 103
3.2.1. Селенсодержащие металлокомплексные соединения 103
3.2.2. Вещества сравнения .108
3.3. Влияние селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений и веществ сравнения на ректальную температуру мышей 111
3.3.1. Селенсодержащие металлокомплексные соединения 111
3.3.2. Вещества сравнения 116
3.3.3. Влияние веществ наиболее эффективных селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений и амтизола на динамику изменения ректальной температуры у мышей 117
3.4. Определение средней летальной и средней эффективной доз веществ Q1983 и Q2170 124
3.4.1. Определение средней летальной и средней эффективной дозы вещества Q1983 после в/б введения и введения внутрь (мыши) 126
3.4.2. Определение средней летальной и средней эффективной дозы вещества Q2170 после в/б введения и введения внутрь (мыши) 127
3.4.3. Определение средней летальной и средней эффективной дозы вещества Q1983 после введения внутрь (крысы) 129
ГЛАВА 4. Изучение свойств наиболее активного селенсодержащего металлокомплексного (zn2+) соединения – вещества Q1983
4.1. Влияние вещества Q1983 и амтизола на условнорефлекторную деятельность мышей 134 4.1.1 Влияние вещества Q1983 и амтизола на выработку у мышей избегательного оборонительного условного рефлекса 134
4.1.2. Влияние амтизола на характеристики избегательной реакции в составе сформированного избегательного оборонительного условного рефлекса 136
4.2. Влияние вещества Q1983 и амтизола после введения внутрь на электрическую активность миокарда крыс 139
4.2.1. Влияние вещества Q1983 и антигипоксанта амтизола после их введения внутрь на динамику формирования ЭКГ-комплексов у крыс в период инкубации .140
4.2.2. Влияние вещества Q1983 и антигипоксанта амтизола после их введения внутрь на динамику формирования у крыс ЭКГ-комплексов при развитии острой гипоксии с гиперкапнией 143
4.3. Влияние вещества Q1983 и амтизола после введения внутрь на параметры внешнего дыхания крыс 148
4.3.1. Влияние вещества Q1983 и антигипоксанта амтизола на параметры внешнего дыхания крыс в период инкубации 148
4.3.2. Влияние вещества Q1983 и антигипоксанта амтизола на параметры внешнего дыхания крыс при острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией 151
4.4. Потребление кислорода крысами в условиях острой экзогенной гипоксии на фоне действия веществ Q1983 и амтизола и их влияние на величину стандартного энергетического обмена 156
4.4.1. Влияние вещества Q1983 и амтизола на величину стандартного энергетического обмена у крыс 158
4.4.2. Динамика изменения газового состава вдыхаемого крысами воздуха в условиях острой экзогенной гипоксии, а также на фоне действия вещества Q1983 и амтизола 159
Глава 5. Влияние вещества q1983 на работу изолированного сердца 163
Глава 6. Изучение влияния вещества q1983 на биоэлектрическую активность соматосенсорной коры головного мозга .171
6.1. Влияние вещества Q1983 на биоэлектрическую активность соматосенсорной коры при развитии периодической дыхательной асфиксии у кошек 173
6.2. Влияние вещества Q1983 на биоэлектрическую активность соматосенсорной коры при развитии острой экзогенной гипоксии 179
6.2.1. Биоэлектрическая активность соматосенсорной коры при развитии острой экзогенной гипоксии и после введения внутрь вещества Q1983 181
6.2.1.1. Биоэлектрическая активность соматосенсорной коры при развитии острой экзогенной гипоксии 181
6.2.1.2. Биоэлектрическая активность вызванных потенциалов соматосенсорной коры после введения внутрь вещества Q1983 185
Обсуждение результатов исследования .190
Выводы .245
Научно-практические рекомендации .248
Список литературы .2
- Биоэлектрическая активность головного мозга на фоне острой экзогенной гипоксии
- Селенсоддержащие металлокомплексные (Zn2+) соединения
- Селенсодержащие металлокомплексные соединения
- Влияние вещества Q1983 и антигипоксанта амтизола после их введения внутрь на динамику формирования ЭКГ-комплексов у крыс в период инкубации
Введение к работе
Актуальность проблемы. Повышение резистентности организма к гипоксии является одной из актуальных медицинских проблем Высотные полеты, освоение океана, производственная или спортивная активность в горах требуют решения задач по выживанию человека в условиях измененной газовой среды обитания [Братин Л X ,1979, Чиж ИМ, 1998, Белов СВ, 1999, Рябочкина АВ, 2000, Русак О Н , 2002, Крюков Е Н, 2003, Сафонов Г А , 2003]
В экстремальных ситуациях содержание Ог в доступном для дыхания воздухе может уменьшаться с различной скоростью Быстрое нарастание кислородного дефицита требует проведения неотложных мероприятий по защите людей [Березовский В А, 1975, Stokes, 1984, Бойко Ю Г , 1999] Как правило, в этих случаях либо осуществляется эвакуация пострадавших, либо задеиствуются специальные технические устройства При постепенном нарастании гипоксии в комплексе защитных мероприятий важное место отводится фармакотерапии, т е использованию различных лекарственных веществ - антигипоксантов, повышающих резистентность организма к недостатку кислорода [Волков Н И , 1998, Semenza, 1999, Колчинская А 3 , 2002, Лукьянова Л Д , 2004, Сороко С И , 2004]
В ряде работ имеются указания на то, что выбор антигипоксанта, тактика его применения во многом зависят не только от вида формирующегося гипоксиче-ского состояния, но и от скорости его нарастания [Коростовцева Н В,1976, Агаджанян Н А , 1978]
Большинство исследователей разделяют точку зрения, согласно которой приоритет в разработке антигипоксантов принадлежит веществам метаболического типа действия Подтверждением актуальности метаболической концепции терапии гипоксических состояний явились результаты, полученные в ходе изучения фармакологических свойств антигипоксантов, относящихся к производным аминотиолов, среди которых на сегодняшний день ведущее место занимают такие соединения, как амтизол и бемитил [Шабанов П Д , 2003, Зарубина И В , 2004]
Однако, как показали многочисленные наблюдения, протективное действие большинства антигипоксантов при быстро нарастающей гипоксии развивается относительно медленно и не всегда обеспечивает желаемый уровень защиты организма [Агаджанян НА, 1978, Березовский В А, 1993, Кошелев ВБ, 1998, Parfenov et al, 2000, Султанов Г А , 2004, Свиридонова С В , 2005]
Перспективы для изыскания антигипоксических средств значительно расширились в связи с появлением новой группы химических веществ - комплексных соединений биометаллов с природными антиоксидантами, синтез которых был осуществлен на базе НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ Российского онкологического научного центра РАМН [Parfenov et al, 2000, 2001] Многие металлсодержащие антиоксиданты продемонстрировали широкий спектр действия и высокую эффективность при разнообразных патологических состояниях, в том числе и при гипоксии [Алейникова ТЮ, 2001, Лебедева С А, 2003, Новиков BE и др , 2005, Цеева Ф Н , 2005, Левченкова О С , 2006, Протасова Н В , 2006, Евсеев А В и др , 2006, Яснецов С А , 2007, Катунин М П , 2007] В частности, было установлено, что комплексное соединение на основе цинка и N-ацетил-
L-цистеина (вещество 7tQ1104), относящееся к производным аминотиолов, значительно повышает вероятность успешного переживания животными различных видов острых экзогенных гипоксических состояний [Евсеев А В и др , 2006, Яснецов С А , 2007] Авторами были отмечены общие закономерности в механизмах реализации антигипоксического действия указанного вещества и эталонного антигипоксанта амтизола
Основанием для выполнения настоящей работы послужила противоречивость сведений, обнаруженных в литературе, касающихся механизмов формирования экзогенных гипоксических состояний в зависимости от скорости их нарастания Особый интерес был вызван отсутствием данных об эффективности антигипоксан-тов метаболического типа действия в случае их использования в качестве корректоров гипоксических состояний, развивающихся с разной скоростью
Цель исследования: изучить динамику изменений электрической активности миокарда, параметров внешнего дыхания, биоэлектрической активности коры головного мозга при различных скоростях нарастания острой экзогенной і ипоксии и оценить протективные эффекты антигипоксантов - производных аминотиолов
Задачи исследования:
-
Разработать адекватную модель острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии (ОГ-Гк)
-
Провести в опытах на мышах сравнительный анализ эффективности некоторых производных аминотиолов - веществ 7cQ901, nQl 104, амтизола и бемитила при различной скорости нарастания острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией (ОГ+Гк), острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии и острой экзогенной гипобарической гипоксии (ОГ+Гб)
-
Изучить динамику изменений электрической активности миокарда и параметров внешнего дыхания у мышей при различных скоростях нарастания острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии, а также на фоне действия наиболее активных производных аминотиолов
-
Изучить динамику изменений электрической активности миокарда у кошек при различных скоростях нарастания острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии, а также на фоне действия наиболее активных производных аминотиолов
-
Изучить динамику изменений биоэлектрической активности коры мозга у кошек при различных скоростях нарастания острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии, а также на фоне действия наиболее активных производных аминотиолов
Научная новизна. В работе впервые изучено-влияние новых (tcQ901, rcQ1104) и известных (амтизол, бемитил) производных аминотиолов на мышей при различной скорости нарастания острой экзогенной нормобарической гипоксии с гипер-
капнией, острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии, а также при различной скорости нарастания острой гипобарической гипоксии
Получены и проанализированы новые данные о динамике изменений электрической активности миокарда, параметров внешнего дыхания мышей в условиях различной скорости нарастания острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии
Выявлены особенности динамики протективного действия наиболее эффективных производных аминотиолов (вещество 7tQ 1104, амтизол) в зависимости от скорости нарастания изученных нормобарических видов экзогенных гипоксии
Впервые в опытах на кошках проведен анализ антигипоксической активности вещества 7tQl 104 по показателям вызванных потенциалов соматосенсорной коры и изменениям электрической активности миокарда при различной скорости нарастания острой экзогенной нормобарической гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии
Научно-практическое значение. Результаты исследований продемонстрировали высокую эффективность цинксодержащего производного аминотиолов -вещества tiQ1104 (патент № 2265608 от 26 06 04) при различных скоростях нарастания экзогенных гипоксических состояний Рекомендуется дальнейшее углубленное исследование протективных эффектов указанного химического соединения на различных моделях острых гипоксических состояний, а также поиск новых антигипоксических веществ среди цинксодержащих антиоксидантов
По итогам работы предложен и внедрен новый способ моделирования состояния острой экзогенной гипоксии у животных - «Устройство для моделирования острой экзогенной нормобарической гипоксии без гиперкапнии у мелких лабораторных животных» (Патент на изобретение № 2251158 от 27 04 05) БРИЗом Смоленской государственной медицинской академии зарегистрированы 5 рационализаторских предложений
Основные положения, выносимые на защиту:
1 Скорость нарастания гипоксии является фактором, предопределяющим рези
стентность животных к нормобарическим и гипобарическим гипоксическим
состояниям
-
Эффективность производных аминотиолов зависит от скорости нарастания нормобарических и гипобарических гипоксических состояний
-
Новые производные аминотиолов - вещества nQ901 и 7tQl 104 в опытах на мышах оказывают более выраженный защитный эффект при всех скоростях нарастания экзогенных гипоксических состояний в сравнении с амтизолом и бемитилом
-
Новое производное аминотиолов - вещество kQI 104 в опытах на кошках существенно увеличивает продолжительность активного функционального состояния коры мозга независимо от скорости нарастания нормобарических гипоксических состояний
Личный вклад соискателя. Автор непосредственно принимал участие в реализации работы по всем разделам диссертации, включая создание модели, организацию и постановку экспериментов, статистический анализ полученных данных, обобщение и анализ результатов работы Экспериментальная часть работы выполнена на базе научной лаборатории кафедры нормальной физиологии ГУ ВПО СГМА (заведующий -дмн, профессор В А Правдивцев)
Номер государственной регистрации диссертационной работы - 01200502631 (протокол № 12 от 7 декабря 2004 г )
Апробация и публикация материалов диссертации. Результаты и основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на проблемной комиссии СГМА «Физиология и патология нервной системы» (2004, 2007), ежегодных итоговых заседаниях Смоленского отделения физиологического общества (2004-2007), 33 и 34-й конференциях молодых ученых СГМА (2005, 2006), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), XI Международной конференции «Новые медицинские технологии и квантовая медицина» (Москва, 2005), IV Международной конференции «Гипоксия механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), Межрегиональной научно-практической конференции «Типовые патологические процессы» (Уфа, 2005), 6-й научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной медицины» (Смоленск, 2007), XX Съезде физиологического общества им И П Павлова (Москва, 2007)
Апробация диссертации состоялась 1 июня 2007 г на совместном заседании кафедр нормальной физиологии, фармакологии, клинической фармакологии, оперативной и топографической хирургии, патологической физиологии, общей химии, общей гигиены Смоленской государственной медицинской академии
По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 1 в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК Зарегистрированы Патент на изобретение и 5 рационализаторских предложений
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных экспериментальных исследований, обсуждение результатов, выводы, научно-практические рекомендации, список литературы Материалы диссертации изложены на 177 страницах машинописного текста Работа содержит 9 таблиц и 45 рисунков Библиографический указатель содержит 217 источников, из них 152 - источники отечественные и 65 - иностранные
Работа поддержана грантом РФФИ (№ 07-04-96437 от 30 мая 2007 г ) Исследования проводились в рамках договора о совместной научно-практической деятельности между НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им Н Н Блохина РАМН и Смоленской государственной медицинской академией «Синтез и изучение
фармакологической активности новых физиологически совместимых антиоксидан-тов»
Биоэлектрическая активность головного мозга на фоне острой экзогенной гипоксии
Развитие научных направлений, имеющих непосредственное отношение к фармакологии, физиологии, патофизиологии и медицине экстремальных состояний, позволяет рассматривать участие гипоксического фактора в процессах жизнедеятельности как с положительной стороны (реже), так и с отрицательной (чаще) (Рябов Г. А., 1998; Шевченко Ю. Л. И соавт., 2000; Чеснокова Н. П. и соавт., 2006; Шабанов П. Д. и соавт., 2010; Sutton J. R., 1990; Corral L. et al., 2014; Schiffer T. A. et al., 2014).
Термин «гипоксия» впервые предложил американский физиолог К. Дж. Виггерс в 1941 г. (греч. hypo – ниже; позднелат. oxygenium – кислород), вместо применявшегося ранее понятия «аноксемия» (греч. an – отрицательная частица; позднелат. oxygenium – кислород и греч. hima – кровь).
Как известно, гипоксия представляет собой состояние, характеризующееся снижением уровня обеспечения организма молекулярным кислородом (О2), или же связанное с проблемой утилизации газа в ходе осуществления внутриклеточных окислительно-восстановительных реакций. В любой из указанных ситуаций организм демонстрирует признаки кислородного голодания различной степени выраженности (Литвицкий П.Ф., 2010; Стасюк О.Н., 2012; Nyakas C. et al., 1996; Rabalais N., et al., 1999; Muhm J.M., 2007; Eldridge F. et al., 2008; Di Stasi L.L., 2014).
Следует отметить, что проявления кислородной недостаточности также могут возникать вследствие ишемии тканей и органов. Однако, ишемические состояния согласно патогенетическим механизмам их формирования проявляются не только снижением показателя напряжения О2 в страдающих биологических тканях, но в значительной степени обусловлены проблемами доставки к ним энергетических субстратов и, в первую очередь, глюкозы (Цыбина Т. А. и соавт. 2007; Бойко Е. Р. И соавт., 2010; Klatzo I., 1995; Adam-Vizi V., Chinopou-los C., 2006; Lage R., 2008). В связи с этим, ишемию приходится расценивать как более тяжелое и опасное явление, т. к. на её фоне гораздо быстрее снижается энергетический потенциал клеток, что в первую очередь обусловлено кризисом производства АТФ в митохондриальном компартменте (Генинг Т. П., Иванская H. H., 2006; Верткин А. Л., 2007; Perhonen M., 1995; Balaban R. S., 2006; Hansen J. M., 2006; Chandel N. S., 2010).
Как правило, в исследованиях, изучающих общие и местные влияния гипоксии на организм, феномен кислорододефицита рассматривается с позиций патологии. В большинстве учебных пособий по патофизиологии гипоксию характеризуют как типический патологический процесс (Зайчик А. Ш., Чурилов Л. П., 1999; Литвицкий П. Ф., 2009). Однако в ходе реализации различных режимов активности человек может испытывать на себе влияние физиологической гипоксии. Так, например, кислородный дефицит возникает в мышцах при условии их продолжительного сокращения (Лябах Е. Б., Маньковская И. Н., 2008; Fegan J. M., Tishler M. E., 1989; Verges S. Et al., 2010). Из-за напряжения мыслительных процессов также происходит снижение содержания О2 в мозговой ткани и, особенно, в коре головного мозга (Бурых Е. А., Сергеева Е. Г., 2008; Brambrink A., Orfanakis A., 2010). Признаки гипоксии иногда могут выявляться в органах с относительно низким уровнем метаболизма (печень, почки, желудочно-кишечный тракт) при отсутствии патологических изменений, но при существенном увеличении их функциональной активности (Ларин В. Л., 1990; Васильев К.Ю. и соавт., 2009; Nobili V. et al., 2014; Sun S. et al., 2014).
Не случайно гипоксические тренировки были включены в комплекс упражнений в качестве обязательного элемента базовой подготовки для определённых категорий здоровых людей – спортсменов, военнослужащих, работников МЧС, деятельность которых предполагает необходимость преодоления значительных, а порой и критических физических нагрузок. В настоящее время общепризнано, что кратковременная гипоксия выполняет в организме роль натурального сигнала, инициирующего полимодальные реакции, включая и рефлекторные, приводящие целостный организм в активное состояние, повышающие чувствительность органов-мишеней к действию внешних и внутренних раздражителей.
Изменения, возникающие в организме в ответ на формирование гипокси-ческого статуса, протекают в 3 этапа, которые тесно связанны друг с другом и с трудом поддаются чёткому разграничению: 1) первичный ответ на воздействие собственно гипоксического фактора; 2) каскад вторично обусловленных гипоксией нарушений; и 3) формирование комплекса компенсаторных и приспособительных реакций, развивающихся на фоне кислородной недостаточности (Барабой В. А., 2006; Литвицкий П. Ф., 2009; Fedoroff N., 2006).
Степень манифестации и последовательность возникновения постгипокси-ческих осложнений, как известно, в значительной мере предопределяются этиологией гипоксии и скоростью нарастания кислородной недостаточности (Балыкин М. В., Каркобатов Х. Д., 2012; Gusy R. D., Schumacker P. T., 2006). Так, например, после острой кровопотери (циркуляторная гипоксия) компенсаторные реакции быстрого типа системы гемодинамики обеспечивают удовлетворительные показатели снабжения кровью головного мозга на протяжении длительного периода, в первую очередь за счёт вовлечения механизмов, оеспе-чивающих централизацию кровообращения. При этом локализованные на периферии органы (почки и печень) могут серьёзно страдать с возможностью развития в них необратимых изменений. Последнее нередко приводит организм к гибели даже после восстановления объёма циркулирующей крови и прекращении гипоксического воздействия (Абдуллаев Х. Т. и соавт., 2009; Bienholz A. et al., 2014; Michalitsi V. et al., 2014; Nobili V. et al., 2014).
Селенсоддержащие металлокомплексные (Zn2+) соединения
В связи с тем, что в опытах на животных определение основного обмена – показателя, наиболее объективно характеризующего скорость течения энергоёмких процессов в организме, не представляется возможным, у крыс регистрировали параметр, известный в литературе как «стандартный энергетический обмен» (СтЭО) (Васильева Л. Л. и соавт, 1961).
В ходе выполнения ряда опытов для точного определения концентраций О2 и СО2 газа во вдыхаемом экспериментальными животными воздухе были применены электронные газоанализаторы АНКАТ-7631М (кислородный) и ГИАМ-301 (углекислотный).
Забор воздушных проб из камер, в которых находились животные, осуществляли с помощью шприца (1 мл), снабженного эластичным переходником (диаметр – 1 мм). В последующем пробу воздуха медленно пропускали через входные каналы газоанализаторов. Результат измерения фиксировали в процентах.
Оценку острой токсичности и средней эффективности зарекомендовавших себя с положительной стороны металлокомплексных селенсодержащих веществ в опытах с моделированием у животных состояния острой экзогенной гипоксиии проводили путём установления средних летальных и средних эффективных доз веществ по методу В. Б. Прозоровского и соавт. (1978).
С учётом ориентировочной эффективной дозы исследуемого вещества, мышам и крысам вводили 4 последовательные дозы из числа указанных в первой строке таблицы 2. Последовательность доз соответствовала логарифмам 1,0; 1,1; 1,2; … 1,9. Каждая доза проходила испытание на 3-х животных. Таким образом, для установления показателя требовалось 12 животных. определение необходимо для отличия от результата 1012; – достоверность средних LD50 и ED50 по большей из ошибок Р = 0,07. Достоверность прочих LD50 и ED50 0,05. Представленную в таблице 2 шкалу применяли в соответствии с рекомендациями авторов, согласно которым величины указанного порядка наиболее часто применяются в практике подобного рода исследований. При этом реальные дозы могут отличаться от предлагаемых в 10, 100, 1000 раз и т. д., т. е. дозы 10,0; 12,6; 15,8 … и т. д. должны быть интерпретированы как 1,00; 1,26; 1,58 … или 100; 126; 158 … . Соответственно при этом изменяется порядок устанавливаемых показателей LD50 и ED50.
Показатели острой токсичности и эффективности, а также размах их отклонений в пределах ошибки находили на пересечении горизонтальной строки, содержащей полученный результат, с вертикальной колонкой, соответствующей первой дозе.
Последовательность 0132 представлена в 4-й строке табл. 2 - «Последовательность реакций». На пересечении этой строки с колонкой, соответствующей первой из испытанных доз - 200 (в таблице - 20,0), содержится искомое значение LD50+SX или же ED50+SX, которое ровно 304 (250-360) мг/кг.
Для установления доверительных границ разностей полученных показателей 360 - 304 = 56 и 304 - 250 = 54 следует умножить разности на 2,36 (t0j05 при числе степеней свободы п - 1 = 7). Полученные результаты (132 и 127) необходимо отнести к среднему значению и в итоге установить доверительные границы с 95 % вероятностью: 160-418. 2.4.8. Изучение условнорефлекторной деятельности мышей по показателям избегательного оборонительного условного рефлекса
Изучение условнорефлекторной деятельности мышей осуществляли с помощью специализированной установки (собственная модификация), адаптированной для решения конкретных задач исследования «Установка для выработки и регистрации актограмм избегательных оборонительных рефлексов у мелких лабораторных животных» (Рацпредложение № 1507).
Предварительно у мышей-самцов массой 20-25 г. вырабатывали отчётливый избегательный оборонительный условный рефлекс (Анохин П. К., 1968). Источником условного сигнала служил тон звукогенератора частотой в 1000 Гц, подававшийся в течение 5 с. В качестве безусловного подкрепления использовали 3-секундное болевое раздражение кожи лапок животного переменным электрическим током частотой 50 Гц, подававшееся за 1 с до момента выключения звукогенератора. После определения болевого порога в дальнейшем использовали подкрепляющий ток, силовые характеристики которого превышали порог в 1,5 раза.
В опытах животное помещали под стеклянный купол, установленный на платформе с электродным полом площадью 350350 мм. Местом активного избегания действия безусловного раздражителя служил пластиковый шест высотой 270 мм, диаметром 10 мм, расположенный по центру платформы. Основание шеста совмещали с датчиком давления. Во всех опытах условный сигнал опережал болевое подкрепление на 4 с. Сочетание условного сигнала и безусловного подкрепления проводили по 20 раз с интервалами 3-5 мин. ежедневно в течение 5 дней в одно и то же время суток (10.00). Наличие избегательного оборонительного условного рефлекса констатировали после возникновения устойчивой реакции в виде запрыгивания животного с платформы на шест в ходе предъявления условного сигнала.
Селенсодержащие металлокомплексные соединения
Как видно из графика контрольной группы, по мере ухудшения газовой среды на начальных этапах развития ОГ+Гк у крыс формировалась тахикардия. Максимальную частоту следования ЭКГ-комплексов обычно регистрировали на 15 мин. опыта (576±18/мин). В то же самое время на ЭКГ отмечали увеличение амплитуды зубцов R (рис. 22-Б).
Последующая динамика ЭКГ (через 15-20 мин. после начала опыта) демонстрировала прогрессирующее ухудшение электрической активности сердечной мышцы, что рассматривали как прекращение периода относительного благополучия. Так, например, через 30 мин. после помещения животных в условия ОГ+Гк частота ЭКГ-комплексов составляла уже 348±15/мин, а к 40 мин. – всего 121±12/мин, что расценивалось как состояние близкое к агонии (рис. 22-В, Г). Электрическая активность миокарда у крыс сохранялась некоторое время после остановки дыхания (рис. 22-Д)
По мере нарастания явлений острой гипоксии, наблюдали дальнейшее снижение амплитуды зубцов R, его расширение, увеличение амплитуды зубца Т в сочетании с заметным увеличением длительности интервала QT. К исходу 46 мин. опыта большинство крыс погибло, что сопровождалось остановкой дыхания и грубыми изменениями ЭКГ с последующим её исчезновением.
Как уже было отмечено в разделе 4.2.1, введение крысам вещества Q1983 (n=9) внутрь в дозе 100 мг/кг сопровождалось значительным снижением частоты следования ЭКГ-комплексов. В опытах по изучению влияния вещества Q1983 на характеристики ЭКГ в условиях ОГ+Гк было установлено, что через 90 мин. (период инкубации) после введения внутрь вещества частота следования желудочковых комплексов была в среднем 295±14/мин и в дальнейшем рассматривалась как контроль (рис. 23).
Первые 80 мин. пребывания животных в условиях ОГ+Гк не сопровождались статистически значимыми изменениями частоты ЭКГ-комплексов, которая на этот момент составляла 257±12/мин (рис. 24-А, Б).
Влияние вещества Q1983 (100 мг/кг, внутрь) на динамику формирования ЭКГ-комплексов у крыс при развитии ОГ+Гк. А – ЭКГ непосредственно после помещения животного в условия опыта; Б – ЭКГ через 70 мин. ОГ+Гк; В – ЭКГ через 80 мин.; Г – ЭКГ через 95 мин. (терминальное состояние); Д – ЭКГ через 100 мин.
Интервал времени, проявляющийся относительной стабильностью электрической активности миокарда в условиях формирующейся острой гипоксии, в работах А. В. Евсеева (2007), С. А. Яснецова (2008) обозначен как «период исследовании.
В течение последующих 25 мин. нарастания гипоксии наблюдали изменения ЭКГ, демонстрирующие ослабление электрической активности миокарда (рис. 24-В, Г, Д). Последнее, в основном, касалось частотных характеристик ЭКГ, т.к. существенных изменений амплитуды зубцов не отмечали. В итоге, через 100-105 мин. после помещения крыс в условия ОГ+Гк электрическая активность миокарда дестабилизировалась и исчезала.
В группе животных получивших амтизол (n=9) в дозе 100 мг/кг по истечении периода инкубации частота следования ЭКГ-комплексов была порядка 470/мин. После помещения крыс в условия ОГ+Гк электрическая активность миокарда демонстрировала тенденцию к усилению (рис. 25-А, Б).
Однако через 20 мин. частотные характеристики ЭКГ начинали снижаться. Достоверность различий с исходными данными отмечали спустя 30 мин. гипоксического воздействия (рис. 23). Далее ситуация развивалась так же, как в группе контроля – частота следования ЭКГ-циклов в течение последующих 30 мин. быстро деградировала. Агония развивалась обычно в промежутке времени от 55 до 65 мин. (рис. 25-В, Г, Д).
Следует подчеркнуть, что в отличие от вещества Q1983, на фоне действия амтизола у крыс в процессе переживания условий ОГ+Гк период относительного благополучия отсутствовал, несмотря на достоверное протективное действие данного антигипоксанта (29,2 %).
Запись пневмобарограмм – кривых, отражающих особенности внешнего дыхания экспериментальных животных, позволила сравнить влияния вещества Q1983 и антигипоксанта амтизола на частотные и амплитудные показатели дыхания у крыс как в период инкубации, так и в условиях состояния острой гипоксии с гиперкапнией. Вещества животным вводили внутрь в дозе 100 мг/кг.
Влияние вещества Q1983 и антигипоксанта амтизола на параметры внешнего дыхания крыс в период инкубации Опыты выполнены на 17 крысах-самцах массой 170-220 г. Результаты регистрации пневмобарограмм показали (рис. 26), что частота следования дыхательных волн у интактных крыс в среднем составляет 182±11/мин (рис. 26-А), что согласуется с данными других исследователей (Слоним А. Д., 1976; Яснецов С. А., 2008; Prosser C. L., 1973; Baker H. J. et al., 1979; Suckow M. A. et al., 2005).
В ходе оценки влияний вещества Q1983 (n=8) и антигипоксанта амтизола (n=9) на характеристики пневмобарограммы крыс было установлено, что действие металлокомплексного соединения существенно снижает лёгочную вентиляцию – частота и глубина дыхания у животных прогрессивно уменьшались. В частности, статистически значимые изменения частотных характеристик были зафиксированы к 14 мин. периода инкубации. Через 15 мин. после введения вещества Q1983 частота дыхательных волн составляла 135±13/мин (рис. 26-Б). При этом МОД (рис. 28) уменьшался более чем в 2 раза (-55,1 %). Последующие 15 мин. наблюдения (30-я мин. опыта) частота и глубина дыхания крыс продолжала снижаться и стабилизировалась на 116-126/мин (рис. 26-В, Г, Д), оставаясь в этих пределах вплоть до завершения периода инкубации. Максимальное снижение частотных характеристик на фоне действия вещества Q1983 составило 43,1 % от исходного значения, т. е. частота дыхательных движений у крыс снизилась почти в 2 раза при МОД равном 31,9 % от исходного значения (рис. 26).
В группе крыс получивших амтизол внутрь в дозе 100 мг/кг (рис. 27) достоверные изменения внешнего дыхания были выявлены через 25 мин после введения антигипоксанта. На этот момент частота дыхания составила 145±13/мин против 178±12/мин в исходном состоянии (рис. 27-А, Б, В), т.е. уменьшалась на 18,5 %. Существенных изменений параметра глубины дыхания отмечено не было. На протяжении последующего отрезка времени вплоть до завершения периода инкубации каких-либо значимых изменений частотно-амплитудных характеристик пневмобарограмм не определялось (рис. 27-Г, Д). В целом, влияние амтизола, введённого внутрь, на параметры внешнего дыхания крыс можно рассматривать как относительно мягкое в сравнении с аналогичным эффектом вещества Q1983.
Влияние вещества Q1983 и антигипоксанта амтизола после их введения внутрь на динамику формирования ЭКГ-комплексов у крыс в период инкубации
Общепризнанно, что состояние острой экзогенной гипоксии у человека обычно вызывается существенным снижением содержания О2 в доступном для дыхания воздухе или же вдыхаемой газовой смеси (Абазова И. С., 2012; Балыкин М. В., Каркобатов Х. Д., 2012; Brattacharya N. et al., 1970; Haddad G. G., Lister G., 1996; Bao X. et al., 2002; Kemp P. J., 2006). В связи с этим, согласно цели и задачам настоящего исследования, пристальное внимание уделялось выбору способов воспроизведения в эксперименте гипоксических состояний экзогенной природы. Совокупность, отобранных в качестве тестирующих (скрининговых) моделей острой гипоксии, позволила охватить спектр наиболее типичных ситуаций, при развитии которых человек может испытывать значительный дефицит О2.
В экспериментах с использованием мелких лабораторных животных, подвергаемых воздействию острой экзогенной гипоксии, нашли широкое применение две простые в воспроизведении модели гипоксии: 1) острая гипоксия с гиперкапнией (ОГ+Гк); 2) острая гипобарическая гипоксия (ОГ+Гб). В первом случае животное помещают в герметично замкнутую ёмкость. Во втором – животное помещают в вакуумную камеру для осуществления «подъёма на высоту». Обе названные методики нередко используют для скрининга антигипо-ксантов среди вновьсинтезированных химических соединений (Лукьянова Л. Д., Романов В. Е., 1990; Девяткина Т. А. и соавт., 2003).
Как уже было отмечено, в последние годы появились сведения о высокой антигипоксической активности целого ряда новых металлокомплексных соединений, содержащих в качестве металла цинк (II) (Алейникова Т. Ю., 2001; Евсеев А. В. и соавт., 2006в; Лебедева С. А. и соавт., 2013; Kostova I., Balkansky S., 2013). Тем не менее, к серьёзным недостаткам указанных химических веществ и прочих известных антигипоксантов, способных реально защитить организм от последствий острой гипоксии экзогенной природы, относят их чрезвычайно низкую эффективность после приёма внутрь.
В связи с этим на первом этапе исследования было проведено изучение влияний 9 новых металлокомплексных соединений, а именно Q1969, Q1970, Q1981, Q1983, Q1987, Q1978, Q2083, Q2170 и Q2252, на резистентность мышей к острой экзогенной гипоксии после их парентерального и энтерального введения.
В качестве препаратов сравнения были использованы известные антигипо-ксические вещества, относящиеся к производным аминотиолов – амтизол, мек-сидол и метапрот (Шабанов П. Д., 2009; Новиков В. Е., Левченкова О. С., 2012).
Согласно собственным данным, продолжительность жизни мышей, находившихся в условиях ОГ+Гк, в разных группах контроля (без фармакологического воздействия) варьировала от 22,38±2,43 до 29,65±3,16 мин. и составила в опытах с в/б введением веществ 25,6 ±2,03 мин., а в опытах с введением внутрь – 26,0±2,31 мин. Таким образом, исходный уровень резистентности животных к воздействию ОГ+Гк в целом не отличался от данных приведенных в литературе (Левченкова О. С., 2006; Евсеев А. В., 2008; Яснецов С. А., 2008).
По мере ухудшения характеристик доступного для дыхания мышей воздуха визуально отмечали постепенное усиление двигательной активности животных, особенно к концу опыта, причём длительность периода агонии составляла в среднем 3 мин.
В опытах с моделированием у мышей состояния ОГ+Гб было установлено, что на момент достижения высоты в 11 000 м (смертельная площадка) продолжительность резервного времени (контрольный показатель при ОГ+Гб) варьировала в пределах от 4,36±0,62 до 6,03±0,76 мин. для различных групп. В среднем показатель составил для групп, получавших в/б инъекции веществ 5,20±0,37 мин., а для групп, получавших изученные вещества энтеральным путём –5,11±0,25. Результаты этих опытов также соответствовали данным литера 192 туры для однотипных условий (Новиков В. Е., Катунина Н. П., 2002; Левченко-ва О. С. и соавт., 2005; Bernardi L. et al., 2001; Netzer N., 2013).
По итогам скрининга, защитное действие 9 новых селенсодержащих ме-таллокомплексных (Zn2+) соединений после их парентерального и энтерального введения мышам в условиях ОГ+Гк и ОГ+ГБ выявлялось в различной степени.
Так, после в/б введения в ходе формирования ОГ+Гк положительно зарекомендовали себя 7 из 9 соединений, исключая вещества Q2083 и Q2252. Наиболее отчётливый дозозависимый эффект введения продемонстрировали соединения Q1983 и Q2170. Например, в дозах 25, 50 и 100 мг/кг вещество Q1983 повышало резистентность мышей к гипоксии с гиперкапнией соответственно на 35,1, 99,1 и 178,8 %. В этих же дозах вещество Q2170 обеспечивало прирост продолжительности жизни мышей на 94,8, 190,8 и 244,9 %.
После введения внутрь защитное действие при ОГ+Гк было отмечено только у 4-х веществ – Q1969, Q1983, Q1987 и Q2170. Наиболее яркий эффект вновь обнаружили соединения, показавшие максимальную активность после в/б введения, а именно Q1983 и Q2170. Следует отметить, что среди изученных соединений встречались вещества, демонстрировавшие на обеих моделях острой гипоксии достоверный негативный эффект, например, Q2078.
На фоне нарастания у мышей состояния ОГ+Гб положительный эффект после в/б введения веществ был выявлен у тех же 7 соединений – Q1969, Q1970, Q1981, Q1983, Q1987, Q2083, Q2170. По уровню своей активности и спектру эффективных доз с наилучшей стороны себя проявило вещество Q1983. Так, при ОГ+Гб данное соединение после в/б введения в дозе 25 мг/кг увеличивало резервное время мышей на 220,9 %, а в дозе 50 мг/кг – на 410,4 %. Столь же заметный эффект вещества Q1983 был обнаружен и после его введения внутрь. Однако в дозе 100 мг/кг результат действия вещества был либо незначительным, либо не выявлялся.