Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.Литературный обзор
1.1. Медиаторная и метаболическая функции ГАМК 16
1.2. Структурная и функциональная характеристика ГАМК- рецепторов 17
1.2.1 Ионотропные ГАМКа-рецепторы 17
1.2.2 Метаботропные ГАМКв-рецепторы 19
1.2.3 ГАМКс-рецепторы 20
1.3. Роль ГАМК в регуляции кровообращения 21
1.3.1 Участие ГАМК-ергической системы в центральной регуляции кровообращения 21
1.3.2 Роль ГАМК-ергической системы в периферической регуляции сердца и сосудов 28
1.4 Антиангиналъные свойства ГАМК и ее аналогов: возможные механизмы 31
1.5. Антиаритмические свойства модуляторов ГАМК-ергической системы 37
1.6. Кардиопротекторное действие ГАМК и ее аналогов в условиях стрес-сорного повреждения миокарда 42
1.7. Алкоголизм иГАМК-ергическая система 49
ГЛАВА 2. Материалы и методы 57
ГЛАВА 3. Поиск веществ с противоишемическим действием среди производных гамк 78
3.1. Изучение влияния соединений на функциональное состояние очагаишемии миокарда при окклюзии коронарной артерии 78
3. 2 Изучение зависимости «доза- антиангинальный эффект» соединения РГПУ-147. 104
3.3. Фармакофорный анализ противоишемической активности молекулярных комплексов производных фенибута, карфедона толибута, мефебута и фепирона 109
3.4. Влияние соединения РГПУ-147 на зону некроза при экспериментальном инфаркте миокарда у кошек 117
3.5.Влияние соединения РГПУ-147 на функциональное состояние сердца в условиях окклюзии нисходящей ветви левой коронарной артерии 119
З.б.Заключение 124
ГЛАВА 4. Изучение антиаритмической активности структурных аналогов гамк 126
4.1 Изучение противоаритмических свойств новых структурных аналогов фенибута и карфедона на реперфузионной модели нарушения рима 127
4.2 Изучение противоаритмического действия наиболее активных структурных аналогов фенибута и карфедона на аконитиновой модели нарушений сердечного ритма 131
4.3 Изучение противоаритмических свойств наиболее активных соединений на хлоридкальциевой модели нарушений сердечного ритма 133
4.4 Заключение 134
ГЛАВА 5. Морфофункциональная оценка кардиопро-текторного действия соединений ргпу-147 и ргпу-195 в условиях длительного стрессорного воздействия 135
5.1 Изучение влияния соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 на функциональные резервы миокарда после длительного стрессорного воздействия 135
5.2 Морфологическая оценка кардиопротекторного действия соединения РГПУ-147 у животных, подвергшихся длительному стрессорному воздействию 141
5.3 Влияние исследуемых соединений на толерантность к физической на грузке стрессированных животных 147
5.4.3аключение 149
ГЛАВА 6. Кардиопротекторное действие производных гамк в условиях алкогольной интоксикации 151
6.1 Влияние новых производных ГАМК на функциональные резервы миокарда животных после острой алкогольной интоксикации 151
6.2 Влияние новых производных ГАМК на функциональные резервы миокарда животных в условиях хронической алкогольной интоксикации 159
6.3 Морфологическая оценка кардиопротекторного действия соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 в условиях хронической алкогольной интоксикации 165
6.4. Влияние исследуемых соединений на толерантность к физической нагрузке алкоголизированных животных 173
6.5 Заключение 175
ГЛАВА 7. Возможные механизмы кардиопротекторного действия соединений РГПУ-147 И РГПУ-195 176
7.1 Гемодинамические механизмы кардиопротекторного действия соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 176
7.1.1 Оценка центрального и периферического симпатотропного, прямого мио- и кардиотропного действия соединения РГПУ-147 176
7.1.2 Влияние соединения РГПУ-147 на основные показатели гемодинамики в условиях острой ишемии миокарда 180
7.1.3 Влияние соединения РГПУ-147 на основные показатели гемодинамики в условиях экспериментального инфаркта миокарда 186
7.1.4 Влияние соединения РГПУ-147 на объемную скорость ретроградного коронарного кровотока и ретроградное давлен ие у собак 189
7.1.5 Изучение влияния соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 на электрофизиологические и гемодинамические показатели сердца в условиях хронической алкогольной интоксикации 191
7.1.6 Влияние соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 на микроциркуляцию в сосудах брыжейки после хронической алкогольной интоксикации и длительного стрессорного воздействия 199
7.1.7 Влияние соединения РГПУ-147 на агрегацию эритроцитов 206
7.1.8 Мембранопротекторное действие исследуемых соединений 208
7.1.9.Заключение 212
7.2. Метаболический механизм кардиопротекторного действия соедине ний РГПУ-147 и РГПУ-195 214
7.2.1 Изучение антигипоксического действия соединения РГПУ-147 214
7.2.2 Влияние соединения РГПУ-147 на выраженность процессов ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов в условиях ишемического повреждения миокарда 214
7.2.3 Влияние соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 на активность антиоксидантных ферментов в условиях хронической алкогольной интоксикации 200
7.2.4 Влияние соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 на функциональное состояние митохондрий кардиомиоцитов живонтных после ишемического, хронического алкогольного и длительного стрессорного воздействий 222
7.2.5 Анальгетическая активность соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 в условиях хронической алкогольной интоксикации 230
7.2.6 Заключение 231
ГЛАВА 8. Изучение кардиотоксического действия со единения РГПУ-147 232
ГЛАВА 9. Изучение фармакокинетики соединения РГПУ- 147 235
9.1 Схемы проведения фармакокинетических исследований 236
9.2 Фармакокинетика соединения РГПУ-147 при внутривенном введении 238
9.3 Фармакокинетика соединения РГПУ-147 при внутрижелудочном введении 246
9.4 Гепатодуоденалъная циркуляция 252
ГЛАВА 10. Обсуждение результатов 254
Выводы 282
Список литературы 284
- Структурная и функциональная характеристика ГАМК- рецепторов
- Фармакофорный анализ противоишемической активности молекулярных комплексов производных фенибута, карфедона толибута, мефебута и фепирона
- Изучение противоаритмических свойств наиболее активных соединений на хлоридкальциевой модели нарушений сердечного ритма
- Морфологическая оценка кардиопротекторного действия соединения РГПУ-147 у животных, подвергшихся длительному стрессорному воздействию
Введение к работе
Актуальность темы. Сердце является органом-мишенью, испытывающим негативное воздействие различных повреждающих факторов (ишемия, стресс, алкогольная интоксикация и мн. др.), которые могут привести к существенным нарушениям метаболизма, структуры и функции сердечной мышцы. В основе патофизиологических механизмов повреждения миокарда лежат многие процессы: гиперсимпатикотония, активация перекисного окисления липидов и повреждение мембран кардиомиоцитов свободными радикалами и гидроперекисями, нарушения окислительного метаболизма (Меер-сон Ф.З., 1984; Голиков А.П. и др., 1989; Ланкин В.З. и др., 2000; Голиков А.П. и др., 2005). Повреждение мембран ведет к митохондриальной дисфункции, уменьшению синтеза АТФ и, как следствие этого, снижению насосной функции, сократимости и функциональных резервов сердца (Меерсон Ф.З., 1984; Бизунок Н.А. и др., 2008; Баранов В.Л. и др., 2008; Молотков О.В. и др., 2008). Снижение насосной функции и уменьшение минутного объема крови (МОК), компенсаторно, ведет к увеличению общего периферического сопротивления (ОПС), нарушению гемоперфузии тканей. Неблагоприятные метаболические и кардио- и гемодинамические сдвиги вызывают негативные изменения микроциркуляции (Халепо О.В. и др., 2007; Белостокая Г.Б. и др., 2008; Гошовская Ю.В. и др., 2008; Шиманская Т.В. и др., 2008).
Учитывая многофакторный характер патогенеза поражений сердца, можно считать целесообразным поиск препаратов-кардиопротекторов с по-литропными фармакологическими свойствами для устранения дисфункции миокарда и предупреждения необратимых изменений в кардиомиоцитах.
Одним из перспективных путей создания новых лекарственных препаратов остается принцип модификации структуры эндогенных физиологически активных соединений, в том числе и гамма-аминомасляной кислоты. Фармакологи Волгоградского Государственного медицинского университета: Морозов И.С., Петров В.И., Тюренков И.Н., Косицина А.Ф., Годовалова Л.А. и др. под руководством проф. Ковалева Г.В. совместно с химиками Россий-
ского Государственного педагогического университета (г.Санкт-Петербург) с 1973 г. изучают симпатикотропные свойства нейроактивных аминокислот, ведут активный поиск веществ с кардиоваскулярной и кардиопротекторной активностью. Накопленные к настоящему времени в ВолГМУ экспериментальные и клинические данные, а также результаты исследований отечественных и зарубежных авторов, позволяют считать перспективным поиск среди структурных аналогов ГАМК веществ с кардиопротекторным действием. Это предположение основано на том, что производные ГАМК могут ограничивать симпатические влияния на сердце и сосуды (Петров В.И., 1977; Петров В.И. и соавт., 1979; Cohen Р.В. et al., 1980; Przyklenk К. et al ., 2000), обладают антистрессорным действием (Меерсон Ф.З., 1984), оказывают нормализующее влияние на показатели кардио- и гемодинамики при острой ишемии миокарда (Тюренков И.Н. и соавт., 1981; 1999; 2002), а также коронаро-литическое (Цорин И.Б. и соавт., 1983; 1986; Чичканов Г.Г. и соавт., 1991; Покровский М.В. и соавт., 1995; Гречко О.Ю., 2000) антигипоксическое (Кресюн В.И. и соавт., 1990; Воронков А.В., 2003), антиоксидантное (Хан В.В., 1990; Higo К. et al., 1993; Гречко О.Ю., 2000; Harrison P., 2000), антиаг-регантное действие (Ледяев М.Я., 1986; Едигарова Л.В. и др., 2000; Воронков А.В., 2003; Luddens Н. et al., 1995).
В связи с вышеизложенным, целью исследования является: Цель исследования. Комплексное изучение кардиопротекторных свойств и возможных механизмов действия структурных аналогов ГАМК в условиях ишемии миокарда, длительного стресса, хронической алкогольной интоксикации и обоснование перспективности создания на их основе новых лекарственных препаратов.
Диссертация является плановой, выполнена как фрагмент научной темы «Создание лекарственных препаратов с нейро- и кардиопротекторным действием на основе структурных аналогов ГАМК» (№ гос. регистрации 01200314502) кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ.
Задачи исследования. В соответствии с поставленной целью планировалось решение следующих задач.
1.Обосновать возможность разработки новых кардиопротекторных средств на основе аналогов ГАМК.
2. Используя данные скрининга и компьютерного прогноза, выявить
среди новых структурных аналогов ГАМК соединения, оказывающие выра
женное антиангинальное действие, провести анализ зависимости между их
химической структурой и противоишемическим действием.
3.Исследовать действие наиболее активного соединения на зону некроза экспериментального инфаркта миокарда, вызванного окклюзией нисходящей ветви левой коронарной артерии и оценить инотропные резервы сердца.
Провести морфофункциональную оценку кардиопротекторного действия исследуемых соединений в условиях длительного стрессорного и алкогольного поражения миокарда.
Изучить возможные механизмы кардиопротекторного действия исследуемых соединений: влияние на центральные и периферические симпатические структуры, гемодинамику и метаболизм кардиомиоцитов в условиях ишемии, длительного стрессорного воздействия и хронической алкогольной интоксикации.
5.Изучить нейрохимические основы кародиопротекторного действия ГАМК.
б.Определить фармакокинетические характеристики наиболее перспективного вещества с кардиопротекторным действием.
7. Изучить кардиотоксическое действие соединения — лидера в условиях 6-ти месячного введения его в нарастающих дозах.
Новизна исследования:
Впервые проведен целенаправленный поиск веществ с кардиопротекторным действием среди 89 новых структурных аналогов ГАМК, в том числе и органических солей и композиций на основе фенибута, карфедона, мефебу-та, толибута и фепирона, позволивший выявить соединения с выраженной
противоишемической активностью. Проанализирована зависимость между химической структурой производных ГАМК и их антиангинальным действием, выделены дескрипторы, определяющие специфическую активность соединений.
Выполнено полное доклиническое исследование кардиопротекторных свойств соединений РГПУ-147 и РГПУ-195 при ишемическом, стрессорном и алкогольном поражении сердца и изучены возможные механизмы их действия, включающие:
1 .тормозное действие на центральные симпатические структуры,
2.ВЛИЯНИЄ на системные показатели кардио- и гемодинамики, коллатеральное кровообращение, микроциркуляцию и факторы, ее определяющие,
3.влияние на метаболизм миокарда: течение кислороддефицитных состояний, процессы ПОЛ, активность ферментов антиоксидантной системы, процессы дыхания и окислительного фосфорилирования.
Изучены нейрохимические основы кардиопротекторного действия соединения РГПУ-147. Впервые выполнено доклиническое изучение фармако-кинетических свойств соединения РГПУ-147, а также проведено исследование кардиотоксического действия соединения РГПУ-147 при 6-ти месячном введении крысам в дозах 50 мг/кг (терапевтическая), 250 мг/кг (доза в 5 раз превышающая терапевтическую), 700 мг/кг (токсическая).
Практическая значимость: На основе выявленных закономерностей зависимости между структурой и кардиопротекторной активностью исследуемых соединений даны рекомендации по направленному синтезу и дальнейшему поиску высокоактивных и малотоксичных веществ с отмеченным действием в ряду производных ГАМК.
Результаты доклинического изучения соединений под лабораторным шифром РГПУ-147 и РГПУ-195, проявляющих выраженные кардиопротек-торные свойства при ишемическом, стрессорном и алкогольном поражении миокарда, свидетельствуют о перспективности создания на их основе новых
препаратов для клинического применения в кардиологии, клинике внутренних болезней
Положения, выносимые на защиту:
1.Поиск веществ с кардиопротекторным действием среди структурных аналогов ГАМК является перспективным направлением в разработке и создании лекарственных препаратов для лечения ишемической болезни сердца, предупреждения стрессорного и алкогольного поражения миокарда.
2.Выявленная зависимость между химической структурой производных ГАМК и их противоишемическим действием открывает возможности для целенаправленного синтеза и поиска новых низкотоксичных и высокоактивных веществ в этих химических рядах.
3. Наиболее продуктивным путем поиска веществ с кардиопротектор
ным действием является модификация структуры активных аналогов ГАМК
(фенибута, карфедона, толибута, мефебута и фепирона) путем химического
связывания с органическими кислотами (лимонной, янтарной, яблочной,
глутаминовой, никотиновой, феруловой) для формирования новых солей и
композиций. Соли и композиции оказывают значительно более выраженное
кардиопротекторное действие, чем их основания.
4. Среди солей и композиций со структурными аналогами ГАМК
большими кардиопротекторными свойствами в условиях ишемии миокарда,
длительного стресса и хронической алкогольной интоксикации обладает со
единение РГПУ-147 (цитрат фенибута).
5. Кардиопротекторная активность вещества обусловлена его симпа-тоингибирующим и антистрессорным действием, которое реализуется через активацию ГАМКа- и, в меньшей степени, ГАМКВ- рецепторов. Тормозное действие соединения на центральные симпатические структуры способствует благоприятным изменениям гемодинамики, что существенно влияет на метаболизм кардиомиоцитов.
Реализация результатов исследования.
Рекомендации, разработанные на основе выявленных закономерностей между химической структурой и антиангинальнои активностью производных ГАМК используются при синтезе новых веществ на кафедре органической химии Российского Государственного педагогического университета им.А.И.Герцена(г.Санкт-Петербург).
Система методических подходов к изучению кардиопротекторной активности новых веществ применяется при проведении исследований в лаборатории фармакологии сердечно-сосудистых средств НИИ фарамкологии ВолГМУ, на кафедре фармакологии, кафедре фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ.
Результаты работы включены в лекционный материал для студентов лечебного, педиатрического, фармацевтического факультетов, слушателей факультета усовершенствования врачей и провизоров на кафедрах фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, фармакологии Пятигорской фармацевтической академии, органической химии Российского государственного педагогического университета им.А.И.Герцена г.Санкт-Петербурга.
Данные о кардиопротекторном действии указанных веществ вошли в комплект документов, переданных в ОАО «Валента Фармацевтика» для представления в ФК МЗ и СР на получение разрешения к проведению клинических испытаний.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Республиканской научно-практической конференции «Проблемы диагностики и лечения сердечнососудистых заболеваний» (Саратов, 1997), Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии" (Санкт-Петербург, 1999), VI, VII, VIII, IX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999, 2000, 2001, 2002), 56-й региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров
(Пятигорск, 2001), научной конференции: Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии (Тунис, 2005), научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции (Пятигорск, 2005), международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры фармакологии ДГМА (Дагестан, Махачкала. ИПЦ. ДГМА 2006), 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», д/о «Подмосковье» (Москва, 2006), III Съезде научного общества фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007). По теме диссертации опубликовано 54 печатных работы. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 348 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 74 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), методов исследования (глава II), экспериментальной части (главы 3-9), обсуждения результатов (глава 10) и выводов. Список литературы включает 248 отечественных и 350 иностранных источников.
Структурная и функциональная характеристика ГАМК- рецепторов
ГАМКа-рецепторы представляют собой пентамерный гликопротеино-вый комплекс, формирующий хлорный канал. В состав рецептора входят 16 субъединиц в различных комбинациях. В настоящее время известно 7 типов субъединиц: альфа (а)ьб, бета (р)ьз, гамма (у)і.3 (уг -субъединица представлена двумя подтипами, различающимися по длине полипептидной цепи - угь (long) и y2s (short), дельта (5), эпсилон (Б), пи (п), тета (9) (Сергеев П.В., 1999; Rudolph U. et al., 2001; Simeone T.A. et al., 2003; Drafts B.C. et al., 2004; Boehm S.L. et al., 2004). ГАМКа-рецепторы, различные по субъединичному составу, обнаружены в областях переднего мозга, мозжечке, кохлеарном ядре, в центральных и средних миндалевидных ядрах, в паллидуме, черной субстанции и нижней оливе, в обонятельной луковице, обонятельном бугорке, гиппокампе и фрон-то-темпоральной лимбической области, в таламусе, зубчатой извилине, стриатуме, базальных ганглиях, сетчатом таламическом ядре, миндалине, в среднем мозге, ядрах моста и черепно-мозговых нервов (Pirker S. et al., 2000; Tretter V. et al., 2001; Axmacher N. et al., 2004; Wu X.Q. et al. 2004; Zheng H. et al., 2004; Boehm S.L. et al., 2006). Многочисленными исследованиями показано, что ГАМКа-рецепторы содержат несколько топографически отличающихся связывающих сайтов, предназначенных как для взаимодействия с основным медиатором, так и для аллостерических регуляторов. Выявлены места связывания с бензодиазепи-нами, барбитуратами, нейростероидами, агонистами и антагонистами ГАМК, 0-1 этанолом, Zn (Балашов A.M., 2005; Crestani F. et al., 2001; Nagaya N. et al., 2001; Kaufmann W.A. et al, 2003; Корр С et al., 2003; Casagrande S. et al., 2003; Hosie A.M. et al., 2003; Miczek K.A. et al., 2003; Bianchi M.T. et al., 2003; Reddy D.S, 2003; Moragues N. et al., 2003; Jones B.L. et al., 2006; Paoletti A.M. et al., 2006; Jones B.L. et al., 2006; Serra M. et al., 2007). ГАМК, связываясь с ГАМКа-рецепторами, формирует ингибиторный постсинаптический потенциал, в основе которого лежит усиление проницаемости возбудимых мембран для ионов хлора, которые под влиянием концентрационного градиента устремляются из внеклеточной среды в клетку и вызывают тем самым стойкую гиперполяризацию мембраны нейронов и снижение возбудимости нервной ткани.
В синаптическом ответе ГАМКа-рецепторы определяют быстрый компонент синаптического тока. Эффект активации этих рецепторов зависит от электрохимического градиента для ионов хлора на синаптической мембране. 1.2.2 Метаботропные ГАМКв-рецепторы ГАМКв -рецепторы обнаружены в 1981 году, локализованы пре- и постсинаптически, относятся к метаботропным и связаны с тримерным G белком. У млекопитающих они состоят из двух субъединиц типа В1 и В2 и представляют собой аллостерически регулируемый гетеродимер (активно функционирующий ГАМКв-рецептор) (Couve A. et al., 2001; Couve A. et al., 2002; McCarson K.E, 2006). Субъединица Bl делится на подтипы В la, Вів и Blc, Bid, B2- на B2a,B2b, B2c (Ng G.Y. et al., 2001; Kulik A. et al., 2003; ). Области, содержащие самые высокие плотности ГАМК В 1а, ГАМК Bib и ГАМК В2- субъединицы отмечены в неокортексе, таламусе, мозжечке, на межнейронах стриатума, в бледном шаре и черной субстанции, в паравен-трикулярном, супраоптическом, аркуатном, вентромедиальном, дорсомеди-альном и др. ядрах гипоталамуса, в соме и дендритах кортико-кортикальных проекций пирамидальных нейронов, в области СА1 гиппокампа (Princivalle A.P.et al., 2001; Backberg M. et al., 2003; Waldvogel HJ. et al., 2004; Chen L. et al., 2004). В спинном мозге ГАМКВ 1 и ГАМКВ 2- субъединицы располагаются в поверхностных слоях задних рогов и на мотонейронах глубоких слоев передних рогов (Charles К.J., 2001). Пресинаптические ГАМКв-рецепторы снижают высвобождение ней-ротрансмиттеров, уменьшая пресинаптический вход кальция. В постсинапти-ческих локусах они запускают цепь реакций, что способствует открыванию калиевых каналов, связанных с G - белком. В результате этого возникают медленные тонические постсинаптические токи (ТПСП). Механизм активации ГАМКв-рецептора самой аминокислотой или агонистами носит название «Венерина мухоловка». Суть этого механизма заключается в следующем: ли-ганд попадает в пространство между двумя лопастями, расположенными на N-конце ГАМКВ 1-субъединицы рецептора, после чего лопасти, имеющие шарнирную область, смыкаются и молекула агониста оказывается заключенной в это пространство. Рецептор меняет конформацию и протомер В2 активирует через G-белок три пути передачи сигнала: с помощью а-субъединицы - аденилатциклазу, синтезирующую цАМФ, комплекс субъединиц Ру активирует кальциевые и калиевые каналы, что способствует прохождению этих ионов через клеточную мембрану. 1.2.3 ГАМКс-рецепторы Относительно ГАМКс-рецепторов вопрос до конца не решен. Они являются ионотропными и существует мнение об объединении их с ГАМКа-рецепторами (также ионотропными).
Однако, надо отметить, что на настоящий момент известны селективные агонисты и антагонисты ГАМКс-рецепторов фармакологически индифферентные в отношении ГАМКа-рецепторов. В свою очередь, ГАМКс-рецепторы не чувствительны к модуляторам и агонистам ГАМКа-рецепторов (Krehan D. et al., 2003)/ Отличаются оба типа рецепторов и по локализации, структуре и функциям (Bormann J., 2000). ГАМКс-рецепторы являются гомомерными белками, состоящими из рі_з субъединиц (Zhang Z.H. et al., 2001), они представляют собой пентамер, 5 субъединиц формируют ионный канал, имеется экстрацеллюлярный домен с местами связывания лигандов и других модуляторов активности рецептора. ГАМК, взаимодействуя с рецептором, способствует открытию канала. Субъединицы, формирующие ГАМКс-рецептор, состоят из длинного внеклеточного N-концевого, четырех трансмембранных и короткого С-концевого, также внеклеточного, доменов. Интрацеллюлярно между 3 и 4 трансмембранными доменами образуется петля, имеющая сайты связывания с различными внутриклеточными белками. Есть мнение, что этот тип рецепторов локализуется в субкортикальной визуальной системе, верхнем холмике, гипофизе, гиппо-кампе, сетчатке, спинном мозге и желудочно-кишечном тракте (Johnston G.A. et al., 2003; Boiler M. et al., 2003). Физиологическая роль и фармакология ГАМКС- рецепторов в настоящее время мало изучены. Однако, понятно, что они имеют отличный от ГАМКа-рецепторов фармакологический профиль (поскольку он зависит от субъединичного состава рецептора).
Фармакофорный анализ противоишемической активности молекулярных комплексов производных фенибута, карфедона толибута, мефебута и фепирона
На основании проведенного скрининга веществ с противоишемиче-ским действием среди структурных аналогов ГАМК, были найдены соединения, обладающие данным видом активности. Далее при использования ИТ «Микрокосм» были выявлены фармакофоры, которые обуславливают выраженную противоишемическую активность известных структурно-разнородных лекарственных веществ и новых структурно-сходных молекулярных комплексов, производных ГАМК со сложными органическими кисло-" тами; определены фармакофоры, общие для обеих групп соединений; рассчитаны показатели фармакофорного сходства молекулярных комплексов производных ГАМК и структур известных противоишемических препаратов;: выявлены наиболее общие закономерности, описывающие противоишемиче-ские свойства соединений этих двух классов. Исследование начиналось с формирования обучающих выборок!, База данных включала структуры 205 известных лекарственных веществ» с выраженной противоишемической активностью и 205 достоверно неактивных соединений (материалы взяты из справочников Negwer М-., Scharnow H.G. Organic-Chemical Drugs and Their Synonyms, Видаль, Энциклопедия лекарств, Лекарственные средства). Активные соединения были разделены на два класса: с высоким и умеренным уровнями активности. Структурные формулы всех 410 соединений обучающей выборки преобразованы, программой-транслятором в дескрипторы языка QL (Васильев П.М., 2001).
Сформированная модель обобщенного образа класса известных противоишемических препаратов включала 15297 QL-дескрипторов — в среднем 37 дескрипторов на одно соединение, что свидетельствует о достаточно высоком структурном разнообразии этих веществ. Для трех градаций противоишемической активности «высокая», «умеренная» и «активно» с использованием трех стратегий прогноза в ИТ «Микрокосм» выполнен расчет девяти интеграль ных решающих правил. Оценка точности полученных QSAR-зависимостей была произведена путем тестирования на обучающей выборке способами автопрогноза, скользящего и перекрестного контролей. Адекватный прогноз всех трех уровней противоишемической активности в ряду структурно-разнородных соединений возможен с применением всех трех стратегий, но наиболее эффективной является консервативная стратегия (табл. 9). Это свидетельствует о том, что механизмы противоишемического действия k известных лекарственных веществ основаны на «стандартных», общих для всех этих соединений, закономерностях. Для определения точности прогноза в ИТ «Микрокосм» противоишемической активности молекулярных комплексов производных ГАМК была использована количественная характеристика противоишемической активности 27 новых производных ГАМК-соотнесенная с контролем (в процентах) площадь под кривой изменения величины зубца ST: S5 - при окклюзии 5 мин.; S3o - при окклюзии 30 мин.; S5 + S30 - суммарно по двум окклюзиям. Полученные экспериментальные данные были подвергнуты кластерному анализу, в результате которого выявлены следующие границы между классами высокой и низкой противоишемической активности молекулярных комплексов производных ГАМК: S5 32 %; S30 47 %; S5 + S30 72 %. Структурные формулы указанных 27 соединений также были преобразованы в дескрипторы языка QL.
Полученная модель обобщенного образа класса противоишемических производных ГАМК включала 1116 QL-дескрипторов - в среднем 41 дескриптор на одно соединение. Таким образом, структурное разнообразие новых изучаемых веществ несколько выше структурного разнообразия известных противоишемических препаратов, что свидетельствует о достаточной представительности этой обучающей выборки. Расчет решающих правил и оценка их точности по трем градациям противоишемической активности «высокая S5», «высокая S30» и «высокая S5 + S30» для новых производных ГАМК были выполнены так же, как и в случае известных противоишемических веществ. С наибольшей точностью прогноз высокого уровня противоишемической активности в ряду структурно-сходных молекулярных комплексов ГАМК возможен для показателя S5 - с применением всех трех стратегий, но лучшие результаты получены по рисковой стратегии (табл. 10). Для показателей S3o и S5 + S3o приемлемый по точности прогноз высокой противоишемической активности может быть осуществлен по консервативной и рисковой стратегиям, но лучшей также является рисковая стратегия. Это свидетельствует о том, что противоишемиче-ское действие новых производных ГАМК в основном определяется специфическими механизмами, учитывающими характерные особенности строения каждого индивидуального соединения.
Изучение противоаритмических свойств наиболее активных соединений на хлоридкальциевой модели нарушений сердечного ритма
Согласно данным литературы, избыток СаС12 вызывает аритмии через Са-индуцированное освобождение Са2+ из саркоплазматического ретикулума и путем генерации «входящего тока», поэтому любое соединение, которое ограничивало бы поступление Са в цитоплазму, вероятно, способно предупреждать аритмии, вызванные введением экзогенного кальция. Известна роль ГАМК в регуляции транспорта Са и изменении концентраций цито-плазматического и мембраносвязанного Са . В этой связи нам представлялось целесообразным исследовать возможное антиаритмогенное влияние новых производных фенибута и карфедона на модели хлоридкальциевой аритмии. В контрольной серии экспериментов введение 200 мг/кг в/в СаСІг вызывало различного рода аритмии, в том числе частую желудочковую экстра-систолию, пароксизмальную тахисистолию и фибрилляцию сердца, соответственно, в 30 и 80%. В целом грубые нарушения ритма, приводившие к гибели животных, развивались в 90% случаев (таб. 15). На хлоридкальциевой модели НРС верапамил и обзидан в дозах 0,25 мг/кг в/в оказывали выраженное антиаритмическое и противофибриллятор-ное действие. Так, фибрилляция желудочков и смертность отмечались, соответственно, в 40 и 20%, что было существенно ниже, чем в контроле. В 20 и 80% наблюдений аритмии отсутствовали (таб. 15). В группе животных, получавших соединение РГПУ-147 в дозе 50 мг/кг в/в за 15 минут до введения СаСЬ, фибрилляция и гибель регистрировались, соответственно, в 36,4 и 27,2% случаев, что достоверно ниже по сравнению с контрольной группой. У. 7 из 11 крыс нарушения ритма практически не возникали (таб. 15). Новый сукцинатсодержащий аналог фенибута РГПУ-149 в дозе 50 мг/кг в/в оказался малоэффективным на хлоридкальциевой модели НРС. Соединения РГПУ-151, РГПУ-153 и РГПУ-156 в дозах 50 мг/кг в/в также пре дупреждали развитие аритмий, вызванных введением СаСЬ, однако выражение уступали по активности препаратам сравнения верапамилу и обзида-ну. Таким образом, на хлоридкальциевой модели нарушения ритма цит-ратсодержащий аналог фенибута — соединение РГПУ-147 оказывало выраженное противоаритмическое действие, сопоставимое с верапамилом и обзи-даном. Соединения РГПУ-151, РГПУ-153 и РГПУ-156 в меньшей степени предупреждали нарушения сердечного ритма и уступали по эффективности препаратам сравнения.
Сукцинатсодержащий аналог фенибута - соединение РГПУ-149 проявляло незначительную активность на данной модели НРС. Таким образом, изучение антиаритмических свойств производных ГАМК показало, что на модели реперфузионных аритмий соединения РГПУ 147 (цитратсодержащий аналог фенибута), РГПУ-149 (сукцинатсодержащий аналог фенибута), РГПУ-151 (никотинатсодержащий аналог фенибута), РГПУ-153 (оксалатсодержащий аналог фенибута) и РГПУ-156 (никотинатсодержащий аналог карфедона) предотвращают развитие НРС и снижают процент случаев летального исхода животных при реперфузии. Эти вещества были взяты для изучения их противоаритмического действия на других моделях аритмий. На аконитиновой модели нарушений ритма сердца наибольшей про-тивоаритмической активностью обладало соединение РГПУ-147, по силе действия оно сопоставимо с эталонными препаратами верапамилом и обзи-даном. На хлоридкальциевой модели НРС наибольшей активностью обладает также соединение РГПУ-147, эффект его сопоставим с препаратами сравнения верапамилом и обзиданом. Более слабая противоаритмическая активность на данной модели НРС обнаружена у соединений РГПУ-151, РГПУ-153 и РГПУ-156, они уступали по силе действия обзидану. У соединения РГПУ-149 противоаритмическая активность практически отсутствовала. На основании проведенного исследования можно сделать вывод, что наиболее выраженной антиаритмической активностью на различных моделях НРС обладает соединение РГПУ-147. Можно также считать перспективным поиск веществ с противоаритмическим действием среди структурных аналогов ГАМК.
Морфологическая оценка кардиопротекторного действия соединения РГПУ-147 у животных, подвергшихся длительному стрессорному воздействию
Анализ литературных данных показывает, что длительные или сильные эмоционально-стрессовые состояния приводят к нарушению ультраструктуры миокарда. Патологические изменения наблюдаются в сарколемме, микроциркуляторном русле, митохондриях, миофибриллах. Изменения заключаются в нарушении целостности мембран миоцитов и митохондрий, исчезновении запасов гликогена, образовании жировых капель в саркоплазме, появлении в цитоплазме эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла пиноцитозных пузырьков, выходе эритроцитов в межклеточное пространство, возникновении областей пересокращения миофибрилл, нередко с образованием контрактурных участков (Клейменова Н.Н. и др., 1983). Все это свидетельствует о нарушениях метаболизма и функции кардиомиоцитов. В этой связи нами изучено влияние соединения РГПУ-147 на морфологические изменения миокарда белых нелинейных крыс-самцов массой 270-350 г. после длительного стрессорного воздействия. Животные были разделены на 4 группы по 6 в каждой: 1-ая группа - интактные животные (позитивный контроль), 2-я группа - негативный контроль, животные, получавшие за 60 минут до стрессирования физ. р-р внутрибрюшинно в течение 2-х недель 1 раз в день, 3-я и 4-я группы опытные, за 60 минут до стрессирования животным вводились соединения РГПУ-147 в дозе 50 мг/кг и препарат сравнения фенибут (50 мг/кг) в аналогичном контрольным группам режиме. Морфологическое исследование сердца показало, что у интактных животных контрольной группы миокард левого желудочка представлен параллельно расположенными кардиомиоцитами с овальными ядрами в центре и умеренно эозинофильной саркоплазмой.
При постановке ШИК-реакции отмечено неравномерное распределение гликогена в различных отделах миокарда левого желудочка. В саркоплазме кардиомиоцитов обнаруживается умеренное количество гликогена в виде гранулярного диффузно распределенного ШИК-позитивного материала, который в несколько большем количестве находится в периферических субсарколеммальных отделах клеток. При окраске «на ишемию» ГОФПК (гематоксилин-основной фуксин пикриновая кислота) в миокарде большинства интактных животных саркоплазма кардиомиоцитов не обладает фуксинофилией (Рис. 11 А, В) В миокарде стрессированных животных в большинстве случаев обнаруживаются небольшие участки повышенной ацидофилии саркоплазмы кардиомиоцитов в субэндокардиальных и субэпикардиальных отделах, а также в межжелудочковой перегородке, что свидетельствует о метаболических изменения в сосудах микроциркуляторного русла, проявляющиеся в умеренно выраженном полнокровии, интерстициальном отеке. При постановке ШИК-реакции в 60% случаев гликоген обнаруживается в небольшом количестве в виде пылевидного ШИК-позитивного материала в саркоплазме отдельных кардиомиоцитов в субэндокардиальных и центральных отделах миокарда. В 40% случаев гликоген не обнаруживается в саркоплазме кардиомиоцитов, что свидетельствует о достаточно выраженном снижении энергетического резерва клеток. При окраске ГОФПК в большинстве случаев в субэндокардиальных и центральных отделах миокарда присутствуют очаги фуксинофилии саркоплазмы кардиомиоцитов, что свидетельствует об ишемическом повреждении миокарда и развитии ацидоза при стрессе (Рис. 12, 13). У большинства стрессированных животных, получавших фенибут, в миокарде левого желудочка обнаруживаются участки повышенной ацидофилии саркоплазмы кардиомиоцитов в субэндокардиальных и субэпикардиаль-ных отделах. В миокарде отмечается умеренно выраженное полнокровие сосудов, что свидетельствует о незначительных нарушениях кровообращения.
При постановке ШИК-реакции гликоген обнаруживается в небольшом количестве в виде гранулярного ШИК-позитивного материала в периферических отделах саркоплазмы кардиомиоцитов. Содержание гликогена несколько ниже, чем у интактных животных, однако выше, чем у группы стрессированных животных, что свидетельствует о незначительном снижении энерге 1
