Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема создания селективных анксиолитиков, сходных по противотревожным свойствам с бензодиазепинами, но не обладающих их гипноседативными, миорелаксантными, амнестическими эффектами, не вызывающих зависимости и синдрома отмены, является центральной в современной психофармакологии (Середенин СБ. с соавт., 1998; Briley М., Nutt D., 2000).
Фундаментальные исследования генетических различий в действии типичных транквилизаторов и анализ механизмов диссоциации их анксиолитического и седативного влияния показали, что анксиоселективный эффект может быть достигнут при коррекции изменений в ГАМКд рецепторе, развивающихся при эмоционально-стрессовой реакции и приводящих к снижению связывающей способности бензодиазепинового участка (Середенин СБ. с соавт., 1989; Середенин С.Б.с соавт., 1998; Seredenin S.B., 2003).
Итогом этих работ явился целенаправленный синтез, выполненный под руководством В.Л. Савельева, и фармакологическое изучение соединения 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]-бензимидазола дигидрохлорида, получившего название афобазол. Установлено, что афобазол предотвращает стресс индуцированное падение бензодиазепиновой рецепции в нейрональных мембранах и обладает селективными анксиолитическими свойствами (Середенин СБ. с соавт., 1998; Seredenin S.B., 2003). Экспериментальные результаты подтверждены в клинических исследованиях (Незнамов Г.Г. с соавт., 2001). Препарат зарегистрирован в РФ в качестве селективного анксиолитика 3 ноября 2005г, № ЛС - 000861.
Необходимым этапом разработки оригинального лекарственного средства является экспериментальное изучение его фармакокинетики и метаболизма. При этом выясняется, в каком количестве от введенной дозы препарат всасывается из места введения и поступает в системный кровоток и, соответственно, к месту его биологического действия. При введении внутрь важно знать, какая часть препарата подвергается биотрансформации, а какая попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Необходимо изучить основные пути метаболизма исследуемого соединения с идентификацией и дальнейшим изучением фармакологической активности метаболитов.
Другой задачей фармакокинетических исследований является изучение абсолютной и тканевой биодоступности соединений, что помогает выбрать оптимальный
путь введения препарата и оценить интенсивность его проникновения в орган-мишень (Жердев В.П., Литвин А.А., 2005).
Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН "Изучение механизмов эндо и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств". (№ госрегистрации 01.2006 06601).
Целью работы явилось экспериментальное изучение фармакокинетики афобазола и его метаболитов. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
Разработать аналитический метод количественного определения афобазола и его метаболитов в биологическом материале с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Провести идентификацию метаболитов афобазола на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.
Изучить фармакокинетику неизмененного афобазола и его основных метаболитов в плазме крови и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения.
Изучить фармакокинетику афобазола и его основных метаболитов в плазме крови крыс после однократного перорального введения.
Определить абсолютную биологическую доступность афобазола.
Изучить экскрецию неизмененного препарата и его метаболитов с мочой и калом в эксперименте.
На основании результатов проведенных исследований выработать рекомендации по фармакологическому изучению метаболитов афобазола.
Научная новизна работы. Впервые изучена биотрансформация и фармакокинетика нового селективного анксиолитика афобазола у крыс, определены стандартные фармакокинетические параметры. Установлено, что при различных путях введения афобазол подвергается интенсивной биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови и органах крыс регистрируются значительные концентрации его метаболитов. По данным масс-спектральных характеристик и встречного химического синтеза были идентифицированы 5 метаболитов афобазола. Установлено, что основными продуктами биотрансформации афобазола являются: метаболит М-3 (гидроксилированный по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла) и метаболит 11 (окисленный по морфолиновому кольцу).
Афобазол и его метаболиты определяются в плазме крови и органах животных в течение 3-х часов. В результате проведенного исследования установлено, что для
афобазола характерна средняя степень проникновения в орган-мишень мозг и высокая абсолютная биодоступность.
Практическая значимость работы. На основании данных исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии идентифицированы метаболиты афобазола. Синтезирован метаболит М-11, который предложен для дальнейшего фармакологического изучения. Перспектива создания лекарственных форм для орального применения афобазола подтверждена его высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте. Фармакокинетические параметры, установленные в настоящей работе, использованы для разработки схем применения афобазола в клинике, для проведения работ по оценке безвредности препарата.
Совокупность данных диссертационного исследования вошла в комплект документов, представленных для регистрации афобазола в качестве лекарственного средства в Министерство здравоохранения и социального развития РФ. Апробация работы. Основные результаты работы доложены на IV Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006г), XV Международном конгрессе по фармакологии "Pharmacology in the 21st Century: A Bridge between the Past and the New Molecular Frontiers" (Пекин, 2006г), научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону, 2006г), XW Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2007г), на лабораторной конференции лаборатории фармакокинетики ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва, 2007г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезисов. Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, библиографический указатель, включающий работы на русском (23) и иностранных языках (105), 27 таблиц, 31 рисунок. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АФобазол - 2-(2-морфолиноэтилтио)-5-этоксибензилимидазола дигидрохлорид. М.м. 380,35. Белый кристаллический порошок, хорошо растворим в воде, умеренно в спирте. В работе использовалась субстанция препарата сер. 080400IP производства Erregierre SpA., Италия. В отделе химии ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН были синтезированы метаболиты афобазола1: М-3 - 2-(2-морфолиноэтилтио)-5-гидроксибензимидазол; М-6 - 2-(2-оксиэтилтио)-5-этоксибензимидазол; М-7 - 2-(2-морфолиноэтилсульфинил)-5-этоксибензимидазол; М-11 - 2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5-этоксибензимидазол; М-14 - 2,3-дигидро-6(7)-этокситиазоло[3,2-а]бензимидазол.
Экспериментальные животные. Фармакокинетику афобазола и его метаболитов после внутрибрюшинного, внутривенного и перорального введения изучали на беспородных крысах (самцы массой 200±20г). Животным однократно внутрибрюпшнно, перорально и внутривенно вводили водный раствор афобазола в дозе 25 мг/кг. Образцы крови и органов получали после декапитации животных в дискретные интервалы времени: 0,017; 0,042; 0,083; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2,0 и 3,0 ч. На каждый интервал времени использовали по 8 животных.
Изучение экскреции проводили на 20-ти крысах-самцах массой 180-200г. Животные были разбиты на 2 группы по 10 особей в каждой (2 контрольных и 8 опытных). Животным первой группы вводили афобазол внутрибрюшинно, второй -перорально в дозе 25 мг/кг. У каждой крысы первой группы собирали суточную мочу и кал, у крыс второй группы собирали суточный кал.
Масс-спектрометрический анализ афобазола и его метаболитов в плазме крови крыс. Масс-спектры метаболитов определяли, используя жидкостной хроматограф Agilent Technologies модели 1100 с масс-спектрометрическим и диодноматричным детекторами со следующими техническими характеристиками: дегазатором модели G1322A, насосом модели G1311A, скоростью потока 0,7 мл/мин. Детектирование проводили в режиме как позитивной, так и негативной ионизации по полному ионному току, при этом напряжение на фрагменторе составило 70В, температура азота - 350 С,
1 Синтез осуществлен
| канд. хим. наук В.Л. Савельевым | и канд. хим. наук Т.Я. Можаевой
расход - 11 мл/мин, давление небулайзера - 240 кПа, напряжение на капилляре -3500В2.
Метод количественного определения афобазола и его метаболитов в плазме крови, гомогенатах органов, тканей и экскрементов крыс с применением ВЭЖХ. Анализ биологических образцов крыс, содержащих афобазол и его метаболиты, проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе "Perkin Elmer" (США), состоящем из изократической помпы - «РЕ-290», УФ-детектора - «РЕ-230» и компьютера с соответствующим пакетом программ для обсчета хроматограмм.
Условия хроматографирования: аналитическая колонка Luna С-18 (2) "Phenomenex" (4,6x250 мм; 5 мкм); подвижная фаза - 0,1 М глициновый буфер (рН 3,4): ацетонитрил (100:25); скорость подвижной фазы - 1,5 мл/мин; детектирование -300 нм. Количество афобазола и его метаболитов в хроматографических фракциях определяли методом нормализации по данным калибровки с внешним стандартом. В изучаемом диапазоне 0,125-5,0 мкг/мл концентраций отмечена линейная зависимость между концентрациями анализируемых соединений и соответствующих площадей пиков, которые описывались следующими уравнениями: для афобазола- S=-25,04+350,84xC (г=0,9998); для М-6 - S = -3,83+228,03хС (г=0,9996); для М-7 - S = -14,04+571,49хС (г=0,9999) и для М-11 - S -18,51+283,81хС (г=0,9994), где S - площадь хроматографического пика афобазола/метаболита. В этих условиях времена удерживания составили, соответственно, для афобазола - 5,3 мин, М-6 - 3,25 мин, М-7 - 4,15 мин и М-11 - 7,20 мин. Предел обнаружения разработанного метода для неизмененного препарата, М-6 и М-11 составляет 100нг/мл, для М-7-70нг/мл.
Относительная ошибка метода для афобазола не превышала - 9,09%, для М-6 -8,47%, для М-7 - 9,35% и для М-11 - 8,33%.
Обработка биологических проб, экстракция афобазола и его метаболитов из биологических образцов. Афобазол и его метаболиты экстрагировали из плазмы крови, гомогенатов органов (тканей) и экскрементов диэтиловым эфиром. К опытным образцам добавляли 20-ти кратный объем диэтилового эфира и экстрагировали в течение 15 мин на электрическом встряхивателе. Экстракцию проводили дважды.
2 Масс-спектрометрический анализ метаболитов афобазола проведен на базе Государственного научного центра по антибиотикам Министерства промышленности, науки и технологий РФ
Эфирные экстракты объединяли и упаривали в токе азота. Сухой остаток растворяли в 0,3-1 мл подвижной фазы, 50 мкл полученного раствора вводили в петлю инжектора хроматографа. Процент экстракции афобазола составил 90,10 ± 2,04; М-б - 89,9 ± 2,43; М-7 - 91,0 ± 3,10 и М-11 - 91,9 ± 2,23 (среднее из трех определений на точку).
Глюкуроноконъюгированные фракции метаболитов афобазола определяли в моче после ее предварительной инкубации с добавлением фермента Р-глюкуронидазы в количестве 3000 ед на 1,0 мл при температуре 23С в течение 24 часов. Затем добавляли 20-кратный объем диэтилового эфира и встряхивали в течение 15 минут. Дальнейшая процедура соответствовала извлечению изучаемых соединений из плазмы крови, гомогенатов органов (тканей) и экскрементов.
Фармакокинетические параметры. используемые для интерпретации экспериментальных данных. Основные фармакокинетические параметры рассчитаны модельно-независимым методом (программа "M-IND") (Агафонов А.А., Пиотровский В.К., 1991):
AUCo-ю (мкг/млхч) - площадь под фармакокинетической кривой (площадь под кривой концентрация лекарственного вещества - время) после внутривенного и перорального введения крысам. AUCo.» рассчитывается от момента введения до бесконечности времени;
Со (мкг/мл) - концентрация препарата в плазме крови после внутривенного введения в нулевой момент времени;
Тт8Х (ч) - время достижения максимальной концентрации препарата в плазме крови после перорального введения;
Стах (мкг/мл) - максимальная концентрация лекарственного вещества (ЛВ) в плазме крови после перорального введения;
Cmax/AUC (ч"1)- параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток;
MRT (ч) - среднее время пребывания ЛВ в организме;
Kei (ч"1) - константа элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма;
ti/2ei (ч) - период, за который выводится половина введенной и всосавшейся дозы ЛВ.
fT - тканевая доступность, рассчитывается по формуле: fT = AUCT о-ш / AUCP о-», где AUCj о-» - AUC в ткани, AUCP о-ю- AUC в плазме крови;
firms - степень превращения фармакологического вещества в метаболит, выражающаяся отношением AUCmo-^/AUC 0-«> . где AUCm О-оо " площэдь под фармакокинетической кривой метаболита; AUCo **> площадь под фармакокинетической кривой исходного соединения;
fa - абсолютная биодоступность, рассчитывалась по формуле:
fa = AUCPoo-<»/AUC,vo«»xlOO%, где AUCpoo-oo- AUC в плазме крови после перорального введения препарата, AUC,vo-<» - AUC в плазме крови после внутривенного введения препарата.
Статистическая обработка полученных результатов. Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы "Excel v.7.0". В таблицах представлены средние арифметические значения величин (х), стандартные отклонения (SD), стандартная ошибка среднего арифметического (S х), коэффициент вариации (C.V.) Достоверность различий для сравниваемых концентраций исследуемых соединений оценивали с помощью критерия Стьюдента (программа "Statistica 5.0") (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2001).
Поскольку на каждую временную точку использовали по 8 животных, результирующая фармакокинетическая кривая была построена по усредненным концентрациям, поэтому при расчетах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов.
Рисунки были выполнены с использованием графического редактора "Origin v.7.0"
