Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Роль ренин-ангиотензиновой системы в регуляции артериального давления 9
1.1.1 Общая характеристика ренин-ангиотензиновой системы 9
1.1.2 Общая характеристика ATI иАТ2 рецепторов 16
1.2. Фармакологическое регулирование ренин-ангиотензиновой системы 20
1.2.1. Общая характеристика ингибиторов АПФ 21
1.2.1.1 Классификация ингибиторов АПФ 21
1.2.1.2 Механизмы действия ингибиторов АПФ 23
1.2.1.3 Фармакологические эффекты ингибиторов АПФ 26
1.2.1.4 Особенности фармакологических эффектов эналаприла 30
1.2.2 Общая характеристика антагонистов AT II 31
1.2.2.1 Фармакологические эффекты антагонистов ангиотензина II 33
1.2.2.2 Фармакологические эффекты лозартана 35
1.3. Фармакокинетика ингибиторов АПФ и антагонистов АТП 39
1.3.1. Ингибиторы АПФ 39
1.3.1.1 Сравнительная характеристика ингибиторов АПФ 39
1.3.1.2 Фармакокинетика эналаприла 42
1.3.2 Антагонисты АТП рецепторов 45
1.3.2.1 Сравнительная характеристика антагонистов АТП 45
1.3.2.2 Фармакокинетика лозартана 46
1.4. Применение ингибиторов АПФ и антагонистов AT II рецепторов в клинической практике 49
1.4.1. Применение ингибиторов АПФ
1.4.2. Применение антагонистов AT II 51
1.5. Проблема выбора препарата в кардиологии 52
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Выбор здоровых добровольцев 58
2.2. Препараты, исследуемые на биоэквивалентность 60
2.2.1. «Исследование биоэквивалентности Брозаара» 60
2.2.2. «Исследование биоэквивалентности Эналаприла-СТИ» 60
2.2.3. «Исследование биоэквивалентности Эналаприла-2» 60
2.2.4. «Исследование биоэквивалентности Эналаприла-3» 61
2.3. Дизайн исследования 61
2.3.1. Рандомизация добровольцев 61
2.3.2. Протокол проведения исследования 62
2.4. Аналитические методы определения неизмененных лозартана и эналаприла и их метаболитов в плазме крови здоровых добровольцев 64
2.4.1. Метод определения лозартана и его метаболита 66
2.4.2. Метод определения эналаприлата с помощью
иммуноферментного анализа 69
2.4.3. Метод определения эналаприла и эналаприлата с помощью ВЭЖХ
с масс-спектрометрическим детектированием 71
2.5. Расчет фармакокинетических параметров 75
2.6. Измерение гемодинамических параметров 76
2.7. Статистическая обработка результатов 76
Глава 3. Результаты исследования 77
3.1. Фармакокинетика препаратов лозартана и эналаприла 77
3.1.1. Фармакокинетика препаратов эналаприла 77
3.1.2. Фармакокинетика препаратов лозартана 83
3.2. Фармакодинамика препаратов лозартана и эналаприла 88
3.2.1. Влияние препаратов эналаприла на параметры гемодинамики 88
3.2.2. Влияние препаратов лозартана на параметры гемодинамики 97
Глава 4. Обсуждение результатов 102
Выводы 111
Список литературы 112
- Особенности фармакологических эффектов эналаприла
- Применение ингибиторов АПФ и антагонистов AT II рецепторов в клинической практике
- Аналитические методы определения неизмененных лозартана и эналаприла и их метаболитов в плазме крови здоровых добровольцев
- Влияние препаратов эналаприла на параметры гемодинамики
Введение к работе
Актуальность. В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания занимают ведущее место в общей структуре заболеваемости населения и является одной из важных причин потери трудоспособности, преждевременной инвалидизации и смерти [Оганов, 2002]. Артериальная гипертензия - самое распространенное среди сердечно-сосудистых заболеваний, которое наряду с сердечной недостаточностью представляет серьезную проблему для систем здравоохранения всего мира. По данным комитета экспертов ВОЗ, артериальная гипертензия встречается у 15-25% взрослого населения [WHO-MONICA Project, 1994], в то время как в возрасте старше 65 лет это заболевание встречается более чем в 50 % случаев [Graves, 1993]. В России артериальной гипертензией страдает около 40 % взрослого населения [Шальнова, 2003]. Одними из препаратов первого ряда при лечении артериальной гипертензии являются ингибиторы АПФ. Появившиеся уже более 20 лет назад, ингибиторы АПФ зарекомендовали себя как достаточно эффективные лекарственные средства в лечении и вторичной профилактике артериальной гипертензии и хронической сердечной недостаточности.
Лечащие врачи в настоящее время широко используют ингибиторы АПФ в своих назначениях, однако часто лечение оказывается мало эффективным из-за неправильно подобранной дозы. Помочь практикующим врачам могло бы знание фармакокинетических характеристик назначаемых ими препаратов, а также точное представление о связи концентрации препарата с его терапевтическим эффектом. Все это особенно актуально при лечении сердечнососудистых заболеваний.
Высокая востребованность инновационных лекарственных препаратов (брэндов) с доказанной клинической эффективностью приводит к появлению на мировом фармацевтическом рынке большого количества воспроизведенных препаратов (генериков), причем их доля год от года возрастает. В России доля генериков достигает 90% от общего числа представленных на рынке лекарственных средств. Такая широкая распространенность генерических препаратов определяется в основном их более низкой по сравнению с брэндами стоимостью. Макроэкономический аспект производства генериков обычно играет решающее значение в определении стратегии развития фармацевтических рынков большинства государств. Это касается и препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Среди всего спектра кардиологических препаратов одним из наиболее часто воспроизводимых лекарственных средств является эналаприл. Только в России зарегистрировано около 50 его генериков. Этот факт послужил одной из основных причин выбора препаратов эналаприла и препарата близкой группы лозартана в качестве объекта исследования. Между тем, из опыта практического применения разных препаратов эналаприла известно, что генерические препараты эналаприла обладают не одинаковой терапевтической эффективностью [Марцевич, 2003; Недогода, 2000] несмотря на то, что каждый из них был признан в свое время биоэквивалентным брэнду. Это является поводом для непрекращающихся дискуссий по поводу достаточности исследования биоэквивалентности воспроизведенных препаратов для заключения об их терапевтической эквивалентности. Решением данного вопроса могло бы послужить одновременное изучение фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных средств с целью их сопоставления. Однако такие исследования проводятся редко, во-первых, из-за их
сложности и высокой стоимости, а главное, они выполняются у здоровых добровольцев, для которых измерение терапевтической эффективности часто не представляется возможным.
Целью исследования было комплексное фармакокинетическое и фармакодинамическое изучение новых отечественных препаратов эналаприла и лозартана в сравнении с зарегистрированными в России оригинальными препаратами.
Задачи исследования
Изучить сравнительную фармакокинетику и биоэквивалентность новых отечественных препаратов эналаприла Эналаприл-СТИ (ЗАО «Леке», Россия), Эналаприл (ЗАО «Мир-Фарм», Россия) и Эналаприл (ЗАО «Северная Звезда», Россия) в сравнении с оригинальным препаратом Ренитек («MSD», Нидерланды) двойным слепым рандомизированным перекрестным методом у здоровых добровольцев.
Изучить сравнительную фармакокинетику и биоэквивалентность нового отечественного препарата лозартана Брозаар (ЗАО «Брынцалов А», Россия) в сравнении с оригинальным препаратом Козаар («MSD», Нидерланды) двойным слепым рандомизированным перекрестным методом у здоровых добровольцев.
Изучить влияние препаратов эналаприла и лозартана на гемодинамику здоровых добровольцев и сопоставить полученные результаты с данными фармакокинетического исследования.
Разработать методы определения эналаприла, лозартана и их метаболитов в плазме крови человека.
Научная новизна. Впервые изучена фармакокинетика новых отечественных препаратов Эналаприл-СТИ (ЗАО «Леке», Россия), Эналаприл (ЗАО «Мир-Фарм», Россия), Эналаприл (ЗАО «Северная Звезда», Россия) и Брозаар (ЗАО «Брынцалов А», Россия). Показано, что все изученные препараты биоэквивалентны оригинальным препаратам Ренитек и Козаар, однако средние фармакокинетические профили лозартана и его активного метаболита при приеме Брозаара ощутимо отличаются от таковых при приема Козаара.
Практическая значимость. Разработаны оригинальные
методики, позволяющие определять с высокой чувствительностью и точностью концентрации эналаприла, лозартана и их активных метаболитов в биологических жидкостях человека.
Заключение о биоэквивалентности препаратов Эналаприл-СТИ (ЗАО «Леке», Россия), Эналаприл (ЗАО «Мир-Фарм», Россия), Эналаприл (ЗАО «Северная Звезда», Россия) и Брозаар (ЗАО «Брынцалов А», Россия) оригинальным препаратам позволило выпустить на отечественный фармацевтический рынок новые российские препараты, соответствующие мировым стандартам лечения и обладающие более низкой стоимостью, что делает их доступными для широкого использования населением..
Показана целесообразность комплексного фармакокинетического и фармакодинамического подхода к исследованиям биоэквивалентности в случае препаратов, для которых возможно фиксирование фармакодинамического эффекта у здоровых добровольцев.
Особенности фармакологических эффектов эналаприла
На основании различий в фармакологических и биохимических свойствах выделяют как минимум два типа рецепторов к ангиотензину II. На сегодняшний день более изучены свойства AT і -рецепторов и в меньшей степени - свойства АТг-рецепторов [Chiu et al., 1989; Mukoyama et al., 1993; Murphi et al., 1991; Iwai et al., 1991; Iwai, Inagami, 1992; Sandberg et al., 1992; Kakar et al., 1992]. Оба типа рецепторов относят к классу трансмембранных семипетлевых рецеторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками (G-белками) [Herblin, 1991]. Совокупные данные свидетельствуют о крайних различиях в свойствах этих рецепторов, особенно в отношении регуляции клеточного роста, артериального давления и апоптоза.
АТррецептор, первичная структура которого представлена полипептидной цепью, состоящей из 359 аминокислотных остатков, соответствющей белку с м.м. 41 кДа, кодируется участком ДНК с открытой рамкой считывания. С-концевая последовательность рецептора богата сериновыми, треониновыми и тирозиновыми остатками с тремя соответствующими участками фосфорилирования протинкиназой-С. Некоторые из этих участков подвергаются фосфорилированию под воздействием антагониста и играют важную роль в процессе инетрнализации, десенситизации и транспорта рецепторов. Аминокислотная последовательность на 20-35% гомологична остальным рецепторам, сопряженным с G-белками. Две пары дисульфидных мостиков образуемых четыремя остатками цистеина, локализованы в экстрацеллюлярном домене. Это объясняет чувствительность ATi рецепторов к действию сульфгидрильных реагентов, например, дитиотреитолу [Murphy etal., 1991].
Исследования свойств рецепторов проводили с использованием высокоселективных непептидных антагонистов — лозартана для АТГ рецеторов и PD 123319 для АТ2-рецепторов. Показано, что ATi -рецепторы в отличие от АТ2-рецепторов [Morsing, Adler et al., 1999) имеют принципиальное значение в ремоделировании тканей матрикса, в то время как АТ2-рецепторы опосредуют развитие гипертрофии гладких мышц в аорте у крыс со спонтанной гипертензией [Tsuzuki et al., 1996 et al., Tsuzuki, 1996].
Вследствие подавления экспрессии АТ2-рецепторов наблюдалось повышение уровня артериального давления [Hein et al., 1995]. В работах Gohlke [Gohlke et al., 1998], продемонстрировано, что AT2-опосредованная продукция цГМФ в аорте крыс с гипертензией стимулируется брадикинином и NO.
Функции АТ2-рецепторов в миокарде остаются пока не выясненными. Недавние исследования показали, что стимуляция АТ2-рецепторов в культуре клеток неонатальных кардиомиоцитов и фибробластов приводила к ингибированию AT і -опосредованного роста клеток. [Booz et al., 1996, van Kesteren et al., 1997]. Эти данные согласуются с ранее продемонстрированным эффектом ингибирования апоптоза АТ рецеторами и усилением апоптоза АТ2-рецепторами в культуре клеток неонатальных кардиомиоцитов [Hayashida et al., 1996]. Из этого следует, что ангиотензин II оказывает одновременно противоположное действие на рост клеток путем активации двух различных подтипов рецепторов.
Поскольку АТ( - и АТ2 -рецепторы антагонистичны друг другу по своим свойствам в отношении действия на миокард, и в особенности на клеточных рост, становится особенно важным их относительный уровень экспрессии и долевое соотношение при различных сердечных патологиях с точки зрения функционирования и структуры миокарда.
Соотношение уровня экспрессия ATi и АТ2 рецепторов может влиять на гипертрофию миокарда и фиброз. Показано, что количество АТ2 рецепторов в миокарде возрастает через 1 день после экспериментального инфаркта [Nio et al., 1995], затем снижается в течение 7 последующих дней. У крыс с гипертензией отношение количества АТ2 к ATi рецепторов повышено. [Lopez et al., 1994]. Принимая во внимание имеющиеся данные, можно предположить, что АТ2 рецепторы играют определенную роль в ремоделировании кардиоваскулярной ткани.
Есть предположения, что при сердечной недостаточности, блокада ATi приводит к повышению уровня и ренина, и ангиотензина; ангиотензин стимулирует АТ2-рецеторы, которые в сою очередь опосредуют терапевтический эффект антагонистов АТгрецеторов [Sugaya et al., 1995]. Передача сигнала рецепторами, сопряженными с G-белками, часто сопровождается быстрой десенситизацией, т.е. отсутствием клеточных реакций в ответ на длительное воздействие агонистом. Изучение pV адренэргических рецепторов выявило три главных механизма десенситизации рецепторов: 1) разобщение с G-белком, 2) секвестрация рецептора эндосомальными визикулами, 3) даун-регуляция общего числа рецепторов [Benovic et al., 1988; Dohlman et al., 1991; Ferguson et al., 1996]. В отличие от АТ2-рецептора, который не интернализируется и не десенситизируется, AT]-рецептор подвергается быстрой интернализации при стимуляции агонистом. Полагают, что именно С-концевой учаток АТЬ богатый серином и треонином, подвергается фосфорилированию и может играть существенную роль в десенситизации рецепторов этого типа.
Для большинства рецепторов цитокинов и факторов роста, механизм инициации рецепторопосредованного сигнала заключается в лиганд-зависимом автофосфорилировании по тирозину и димеризации. Фосфорилированный рецептор образует димеры и в результате происходит запуск внутриклеточных сигнальных каскадных механизмов в ответ на стимуляцию цитокинами и факторами роста. ATi-рецептор может подвергаться индуцированной агонистом димеризации и этот процесс играет роль в модулировании рецепторной интернализации [Hebert et al., 1998; Maggio et al., 1996; Ng et al., 1996; Nimchinsky et al., 1997; Romano et al 1996., Cvejic, Devil 1997]. Подробное изучение процесса димеризации и его роли в активации рецепторов до конца не выяснено и требует дальнейших исследований.
Применение ингибиторов АПФ и антагонистов AT II рецепторов в клинической практике
Все антагонисты рецепторов АТ-П характеризуются высокой селективностью к AT і-рецепторам, однако отличаются по своим фармакокинетическим характеристикам, а также метаболизму и степенью сродства к ATt-рецепторам (табл. 3). Взаимодействие с АТГ рецепторами может быть как обратимым (эпросартан, лозартан), так и необратимым (кандесартан, вальсартан, тельмисартан, Е3174) [Song et al., 2000]. Уровень биодоступности может значительно колебаться: от 13% у эпросартана до 60 - 80% у ирбесартана. Большинство антагонистов АТ-П, за исключением лозартана и ирбесартана, выводятся почками и с желчью. Лозартан метаболизируется в печени в активные и неактивные соединения и выводится в основном с желчью (порядка 80%, Song et al., 2000]. В сравнительном исследовании трех антагонистов АТ-П у 12 здоровых добровольцев было показано, что уровень и длительность блокады AT]-рецепторов после приема 150 мг ирберсартана существенно выше, чем после приема 50 мг лозартана и 80 мг вальсартана [Mazzolai et al., 1999].
Лозартан (МК954, DuP753) представляет собой 2-бутил-4-хлоро-1 [[2 -(1 Л-тетразол-5-ил)[1,Г-бифенил]-4-ил] метил]- 1Я-имидазол-5 метанол (рис. 4). Эффективность лозартана (производное имидазола) обусловлена большей частью активностью одного из его метаболитов - ЕЗ 174 [Соа, Wagstaff, 1996; Lo, Wissel et al., 1992]. В организме человека было выявлено 3 его возможных пути метаболизма [Csajka et al., 1997; Lankford et al., 1997]. Но только один из них (карбоксилирование лозартана), приводит к образованию метаболита Е3174 [Furtek, Lo, 1992; Lo et al., 1992], который в 10-40 раз активнее исходной формы и обладает гораздо более продолжительным действием из-за медленного ферментативного расщепления в крови (рис. 5).
Лозартан быстро абсорбируется после приема внутрь и подвергается карбоксилированию с образованием основного фармакологически активного метаболита Е3174 [Azizi et al., 1999, Carini et al., 1988; Chiu et al., 1988]. Биодоступность лозартана после приема в дозе 50мг составляет 33%, в дозе 100мг - 23%, причем она не зависит от возраста больного [Csajka et al., 1997]. В плазме крови лозартан и его основной метаболит связаны с белками: лозартан - на 92%, метаболит - на 99%. Через гематоэнцефалический барьер лозартан и его активный метаболит не проникают. Максимальная концентрация достигается в крови после приема 1 таблетки в дозе 50 мг через 1,2 ч. Период полувыведения лозартана составляет 1,5 — 2 ч, а его основного метаболита Е3174 -6 - 9 ч. В исследовании, проведенном у 12 здоровых добровольцах в возрасте от 18 до 30 лет, площадь под фармакокинетической кривой AUCo-24 после приема 50 мг лозартана составила 426 ± 283 нг-ч/мл для лозартана и 1928 ± 762 нг-ч/мл для Е3174 [Meadowcroft et al, 1999]. Период полу выведения в этом исследовании составил 1,9 ± 0,1 ч для лозартана и 4,7 ± 0,6 ч для Е3174. В другом исследовании, проведенном у 20 здоровых добровольцах в возрасте от 18 до 65 лет, при приеме 50 мг лозартана AUC0.24 составила 369 нг-ч/мл, а период полувыведения был равен 3,64 ч [Zhi et al, 2002]. В эксперименте после в/в введения лозартана с мочой экскретируется около 11% неизмененного препарата и 55% в виде основного метаболита. Фармакокинетические параметры лозартана изменяются в зависимости от тяжести почечной недостаточности: снижается клиренс, и, по некоторым данным [Csajka et al., 1997], препарат аккумулируется в организме; при этом гемодиализ не очищает кровь от лозартана и его метаболита. В тоже время имеются другие данные об отсутствии аккумуляции у больных с почечной недостаточностью или при диализе.
Механизм биотрансформации лозартана исследовался in vivo на препаратах микросом печени человека, мышей, крыс и in vitro на крысах. Окисление лозартана катализируется ферментами микросомальной фракции (CYP) в присутствии NADFH и молекулярного кислорода, и ингибируется SKF 525-А при участии цитохрома Р450.
Аналитические методы определения неизмененных лозартана и эналаприла и их метаболитов в плазме крови здоровых добровольцев
Исследования антагонистов АТ-П продолжаются. До сих пор их применение в клинической практике ограничено, чаще их назначают пожилым людям при плохой переносимости ингибиторов АПФ. В последние годы особое внимание уделяется комбинированному применению ингибиторов АПФ и антагонистов АТ-П. При выборе терапии надо учитывать, что антагонисты AT II лучше переносятся больными по сравнению с ингибиторами АПФ: при непереносимости последних из-за сухого кашля и других побочных эффектов 83% больных смогли лечиться антагонистами АТ-П в течение 12 нед. (исследование SPICE; Murray et al, 1999]. Для усиления антигипертензивного эффекта в течение суток лозартан можно комбинировать с небольшими дозами гидрохлоротиазида (12,5 - 25 мг) 1 раз в день; при этом гипокалиемия, вызываемая тиазидным диуретиком, может быть выражена в меньшей степени. Лозартан совместим также с ингибиторами АПФ, блокаторами Р-адренорецепторов и антагонистами кальция. У больных с почечной гипертонией лозартан снижает АД и улучшает функцию почек, вызывая статистически достоверные изменения [Goa, Wagstaff, 1996]: 1) увеличение эффективности почечного кровотока, 2) снижение фракции фильтрации, 3) уменьшение сопротивления почечных сосудов, 4) снижение в зависимости от дозы выраженности протеинурии, фракционного клиренса альбумина и иммуноглобулина G, 5) некоторое повышение уровня калия и понижение уровня мочевой кислоты в сыворотке крови. При АГ назначают начальную дозу в 25 мг либо 50мг 1 раз в день, затем ее можно увеличить до 50 мг 2 раза в день или 100 мг 1 - 2 раза в день. Для усиления антигипертензивного эффекта можно комбинировать 50 мг лозартана с 12,5 мг гидрохлоротиазида.
В совместных рекомендациях по лечению артериальной гипертонии, разработанных ВОЗ и Международным обществом по артериальной гипертонии (1999), блокаторы рецепторов-AT і были признаны препаратами первой линии для лечения больных с АГ.
Больным с заболеваниями печени в анамнезе, особенно при циррозе печени, необходимо уменьшать дозу лозартана, так как в этих случаях концентрация лозартана в плазме значительно увеличивается. Лозартан можно назначать при сопутствующих АГ заболеваниях: сахарном диабете, подагре, а также гиперлипидемии [Dickstein, 2001].
Проблема оптимизации фармакотерапии сердечно-сосудистых заболеваний остается актуальной, несмотря на широкий спектр антигипертензивных лекарственных средств. Ингибиторы АПФ являются препаратами первого ряда в лечении артериальной гипертензии благодаря доказанной эффективности, хорошей переносимости и протекторным свойствам в отношении органов-мишеней. Однако наличие на рынке лекарственных средств различных генериков одного препарата делает необходимым сопоставление не только их фармакокинетических свойств, но и проверки их терапевтической эквивалентности. В России, по данным фармакоэпидемиологического анализа 1500 амбулаторных карт пациентов с гипертонической болезнью, 67% больных гипертонической болезнью ежемесячно тратят на свое лечение $1,5-2, 14% - $2-5 и 9% - свыше $5. При этом для 92% респондентов цена за одну упаковку имеет решающее значение [Недогода и др., 2000]. По данным приведенного исследования, 42% пациентов с гипертонической болезнью используют ингибиторы АПФ либо в качестве монотерапии, либо в сочетании с другими гипотензивными препаратами, причем 63% из них принимают различные генерики эналаприла. Это является особенно важным, когда высокая стоимость многих ингибиторов АПФ становится препятствием для их применения больными.
Вопросы сравнения и противопоставления оригинальных препаратов и их воспроизведенных копий (генериков) в условиях, когда многие пациенты с артериальной гипертонией ориентированы на лечение более дешевыми лекарственными средствами, имеют огромное значение для повседневной клинической практики. В этой связи каждый практикующий врач, принимая решение назначить генерик, должен быть абсолютно уверен в его фармацевтической, фармакокинетической и терапевтической эквивалентности оригинальному препарату. Более того, врач должен быть в полном объеме вооружен информацией о профиле безопасности оригинальных и генерических препаратов [Лопатин, 2004].
Проблема воспроизведенных лекарственных средств (генериков) в последние годы заставляет обратить на себя пристальное внимание как практикующих врачей, так и ученых-фармакологов. Между тем, на сегодняшний день даже нет однозначного, признанного всеми ответа на вопрос, что считать генерическим лекарственным средством. Вот лишь некоторые из определений генериков. В России Минздравом рекомендовано считать генериком воспроизведенное лекарственное средство, не отличающееся лекарственной формой и содержанием действующих веществ от соответствующего оригинального лекарственного средства [Проведение качественных исследований биоэквивалентности лекарственных средств, 2004 г.]. Под оригинальным препаратом понимают лекарственное средство, произведенное фирмой-разработчиком по собственной технологии, прошедшее все фазы клинических испытаний и, как правило, защищенное патентом. По истечении срока патента другие фирмы имеют право воспроизводить это лекарственное средство, и эти копии называются генериками. В другом определении говорится, что генерик — это лекарственный продукт, обладающий доказанной терапевтической взаимозаменяемостью с оригинальным инновационным лекарственным средством аналогичного состава, выпускаемый иным производителем, но не разработчиком оригинального препарата и без лицензии разработчика [Белоусов, 2003]. Таким образом, в идеале под генериком понимают препарат с доказанной терапевтической взаимозаменяемостью с оригинальным препаратом, однако терапевтическая эффективность генериков изучается редко, поскольку существующие правила их регистрации не предусматривают обязательного проведения клинических испытаний. Соответствие генерика оригинальному препарату доказывают в первую очередь на основании фармацевтической и фармакокинетической эквивалентности (биоэквивалентности).
Влияние препаратов эналаприла на параметры гемодинамики
В день исследования волонтер прибывал к 8 часам утра в Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины (последний прием пищи - не позднее 21 часа накануне). Врач, руководящий исследованием, проводил клиническое обследование, измерял параметры гемодинамики - систолическое и диастолическое артериальное давление (САД и ДАД соответственно) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) — и делал запись в индивидуальной карточке добровольца.
Добровольцы были проинформированы о том, что во время всего исследования они должны соблюдать стандартный режим: не подвергаться физической и психической нагрузке, не употреблять спиртные напитки, кофе и чай, а также не принимать никакие другие лекарственные препараты. В обязанности добровольцев также входило информирование врача-исследователя о любых изменениях режима и самочувствия во время и после проведения исследования.
После получения полной информации о ходе исследования, при наличии письменного согласия волонтера, наличии у него всех критериев включения и отсутствии критериев исключения, проводилось страхование добровольца в соответствии с требованиями клинических испытаний, а затем доброволец госпитализировался в специальную палату 2-го клинического (кардиологического) отделения ГЫИЦ ПМ МЗ РФ на все время фармакокинетического исследования.
Приблизительно в 9 часов утра волонтер принимал таблетку одного из исследуемых препаратов по принципу случайности выбора. Дата приема исследуемых препаратов (госпитализации) запротоколирована. Таблетки принимали внутрь, не разжевывая, запивая 100 мл воды.
Для отбора крови использовали разовые кубитальные катетеры (с нулевого фона до 12 часов) и одноразовые шприцы (все последующие отборы). Образцы крови отбирались из локтевой вены в количестве 5 мл в стеклянные пробирки с добавлением гепарина в дискретные интервалы времени. При изучении биоэквивалентности Брозаара пробы отбирались до приема препарата и через 1; 1,5; 2; 3; 5; 7; 10 и 24 часа после приема препарата, а при изучении метаболита лозартана - дополнительно через 0,5; 2,5 и 4 часа после приема. При изучении биоэквивалентности Эналаприла-1 и Эналаприла-2 пробы отбирались до приема препарата и через 1; 2; 4; 6; 10; 12; 24 и 32 часа после приема препарата. При изучении биоэквивалентности Эналаприла-3 пробы отбирались до приема препарата и через 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5; 8; 12; 24 и 30 часов после приема препарата. Пробы центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, полученную плазму хранили при (-20С) до анализа. Стабильность концентраций лозартана и эналаприла в плазме крови при (-20С) в течение 2 месяцев подтверждена экспериментально - в контрольных образцах с известным их содержанием убыль определяемых веществ в течение всего срока хранения (9 недель) не регистрировалась.
Непосредственно перед отбором каждого образца крови проводилось измерение параметров гемодинамики (САД, ДАД, ЧСС). Все измерения, а также забор крови, осуществлялись в положении сидя. Стандартный легкий завтрак допускался через 3 часа, обед — через 6 часов, ужин - через 10 часов после приема препарата. Для решения поставленных задач были разработаны иммуноферментный и хроматографические методы определения. Концентрации неизмененного лозартана и его активного метаболита в плазме крови добровольцев определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектированием. Концентрации неизмененного эналаприла и эналаприлата в плазме крови добровольцев определяли с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием и методом иммуноферментного анализа (ИФА). Методы определения выбраны на основе анализа данных литературы и с учетом аналитических возможностей лаборатории ФКИ.
В работе использовали субстанции лозартана, эналаприла и эналаприлата, предоставленные фирмами - производителями изучаемых препаратов. Субстанцию метаболита лозартана синтезировали по методу [King, Anthony О., 1990] с незначительными модификациями. Целевое вещество получали по следующей методике.
Растворяли 0,02 г (0,356 мМ) КОН в 2 мл воды и добавляли калиевую соль лозартана 0,1 г (0,217 мМ). Образовавшийся гомогенный раствор охлаждали на водяной бане со льдом и при интенсивном перемешивании медленно по крупицам добавляли перманганат калия 0,07 г (0,443 мМ), следя, чтобы температура не поднималась выше 10 градусов. Полученную бурую суспензию перемешивали еще 3 часа, позволяя температуре медленно подняться до комнатной, и при комнатной температуре еще перемешивали 2 часа. Реакционную смесь отфильтровывали через небольшой слой тонкого силикагеля, чтобы отделить от диоксида марганца, и промывали 2 мл воды. Затем прозрачный раствор подкисляли соляной кислотой до рН 2 и отфильтровывали выпавший осадок. Полученную кислоту очищали следующим образом. Растворяли высушенный осадок в 5 мл этилацетата и пропусткали сухой хлористый водород до насыщения. Выпавшую соль отфильтровывали, промывали этилацетатом и сушили на фильтре. Далее соль растворяли в смеси 5 мл этилацетата и 5 мл воды, переливали в делительную воронку, добавляли 5N КОН до рН 4 и отделяли органический слой. Раствор кислоты сушили сульфатом магния. После отделения неорганической соли и упаривания растворителя в вакууме досуха получили 0.05 г кислоты. Выход составил 52%. Чистоту полученного соединения контролировали с помощью ПМР и МС.
Матричные растворы с концентрацией 1 мг/мл готовили с использованием 30%-ного метанола, из этих растворов готовили растворы стандартных образцов.
Для экстракции и элюентов использовались уксусная кислота, ацетонитрил, этиловый эфир уксусной кислоты, гексан, метанол, дигидрофосфат натрия, дигидрофосфат калия ацетат натрия - все реактивы производства "Merck" (ФРГ). Вода - двухступенчатая очистка обратным осмосом и деионизированная (Millipore, Франция).