Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
Сорбционные свойства некрахмальных полисахаридов 8
1.1. Химическая структура и физико-химические свойства некрахмальных полисахаридов 9
1.2 Связывание тяжелых металлов некрахмальными полисахаридами 18
1.3. Связывание желчных кислот и холестерина некрахмальными полисахаридами 25
1.4. Связывание белка некрахмальными полисахаридами 28
1.5. Применение некрахмальных полисахаридов в биотехнологии 32
Заключение. 36
Глава II. Материалы и методы исследования 37
2.1. Общая характеристика изучаемых препаратов 37
2.2. Общая характеристика экспериментальных животных 39
2.3. Физико-химические и биохимические методы 40
2.4 Математическая обработка результатов 43
Собственные исследования
Глава III. Кинетика связывания белка сорбентами . 44
3.1. Кинетика связывания белка альгинатом кальция 45
3.2. Кинетика связывания белка пектатом кальция 45
3.3. Кинетика связывания белка активированным углем 47
3.4 Кинетика связывания белка микрокристаллической целлюлозой 48
3.5. Кинетика связывания белка попифепаном 48
3.6. Кинетика связывания белка полисорбом 48
3.7. Кинегика связывания белка диоктаэлрнческим сметном 49
Глава IV Равновесная сорбция белка сорбентами 51
4.1. Равновесная сорбция белка альгинатом кальция 51
4.2. Равновесная сорбция белка пектатом кальция 62
4.3 Равновесная сорбция белка активированным углем 76
4.4. Равновесная сорбция белка микрокристаллической целлюлозой 79
4 5 Равновесная сорбция белка полифепаном 84
4.6 Равновесная сорбция белка полисорбом 86
4 7 Равновесная сорбция белка диоктаэдрическим смектитом 92
Глава V Сорбция белка сорбентами в зависимости от рН среды 97
5 I Сорбция белка альгинатом кальция в зависимости от рН среды 97
5 2 Сорбция белка пектатом кальция в зависимости отрН среды 99
5 3 Сорбция белка активированным углем в зависимости от рН среды 100
5.4 Сорбция белка микрокристаллической целлюлозой в зависимости от рН среды 101
5.5 Сорбция белка ПОНИфеЯааом в зависимости от рН среды 102
5 6 Сорбция белка полисорбом в зависимости от рН среды 103
5 7 Сорбция белка диоктаэдрическим смектитом в зависимости от рН среды 103
Глава VI. Влияние альгината кальция и низкоэтерифицированного пектина на белковый обмен у крыс 105
Обсуждение 108
Выводы 125
Список литературы 127
- Связывание тяжелых металлов некрахмальными полисахаридами
- Равновесная сорбция белка альгинатом кальция
- Равновесная сорбция белка микрокристаллической целлюлозой
- Равновесная сорбция белка диоктаэдрическим смектитом
Связывание тяжелых металлов некрахмальными полисахаридами
Важным свойством не крахмальных полисахаридов является комплексообразующая способность. основанная на взаимодействии полисахаридов с ионами тяжелых и радиоактивных металлов. Она присуще всем, описываемым в данном обзоре, некрахмальным полисахаридам и зависит от заряда полисахарида, от наличия свободных функциональных групп, а также от условий среды, в которой протекает процесс.
Первые исследования и наблюдения, показывающие способность альгинатов и пектинов связывать и выводить тяжелые металлы и радионуклеотиды. по-видимому, относятся к 50-м годам Наряду с исследованиями проводимыми на экспериментальных животных и на добровольцах, проводятся исследования т vitro, на основании которых получают количественные характерисгики процесса сорбции, позволяющие осуществлять рациональный выбор комилексообразователей на основе их сродства к металлам.
Альгинаты В 1964 г A Haug показал, что сродство альгиновой кислоты к радиоактивным металлам снижается в следующей последовательности: Ва Pb Си Sr Cd Са Zn Nt Со Мп Fe Mg. В 1968 г М.Ю. Долматова и А.П. Пантелеева изменили эту последовательность и она стала выглядеть так: Pb Си Ва Sr Са Со Мп, Zn, Fe. Позже было установлено, что альгинат кальция сорбирует ионы (при рН 4) в ряду РЬ Си Cd Ni Zn Со [133] Авторы получили следующие константы связывания (сродства) Kw=14,507 кг л/моль2, Ко,=649 кг л/моль2. К(-и=203 кг л/моль", Krj=172 кг л/моль2, Кд-,=30,8 кг л/моль2, К ЗО кг л/моль3, К( „=24,4 кг л/моль2. Следует отметить, что в условиях in vitro сорбционная емкость альгината натрия в несколько раз выше сорбционной емкости альгиновой кислоты и альгината кальция [51]
Согласно современным представлениям, связывание миогозарядных ионов происходит в GG-блоках (реже - в GjW-блоках) макромолекул альгинатов [92, 119, 157]. Эти структуры имеют зигзагообразную конформацию, что обеспечивает возможность реализации большого числа координационных взаимодействий между ионами металлов и функциональными группами молекул альгината (модель "коробки для яиц"). В тоже время как Л/А/-блоки альгинатов, имеющие плоскую конформацию, связывают ионы металлов сравнительно слабо, лишь за счет кулоновских взаимодействий. Так, ЕЕ. Браудо и соавторы (20016), исследуя взаимодействие альгината с ионами свинца, установили, что максимальные значения констант связывания выше у альгината с более высоким содержанием GG-блоков Помимо высокого сродства к ионам свинца, альгинат способен связывать избыток свинца, возможно за счет соосаждения. Для альгината, содержащего 47% GG-блоков, степень связывания достигала 500 ионов свинца на 1 мономерное звено Используя метод ядерно-магнитного резонанса, D.Larmer и соавторы (2003) показали, что кальций специфически связывается с GjW-блоками альгината, в то время как связывание магния было низким и неспецифичным. ТА. Davis и соавторы (2003b) Изучали взаимодействие альгинатов с различным содержанием GG-блоков с двумя типами ионов металлов одновременно Были получены следующие константы сродства для пары кадмий-кальций КА ,гя=0-43±0.10 (содержание GG-блоков 0.23). К(су,го=1.32±0.02 (содержание GG-блоков 0,81), для пары магний-кальций К,д,к,(о=]8.0±1.4 (содержание GG-блоков 0,81): для пары магний-кадмий К пгНб-ОіО.0 (содержание GG-блоков 0,75)
Для повышения сродства альгинатов к кадмию, проводят иммобилизацию микроорганизмов на альгинате [75] Бактерии способны концентрировать тяжелые металлы внутри клеток или в поверхностных структурах, извлекая их из разбавленных растворов Сорбционная емкость при этом повышается в 2 раза. Причем, иммобилизированные таким образом альгинаты можно использовать от 5 до 30 раз [74. 169] Альгинат кальция с иммобилизированной Pseudomonas aeruginosa был использован для одновременного удаления ионов свинца, меди и кадмия из воды При этом свинец сильно ингибировал адсорбцию меди и кадмия из раствора [77]. Проводится иммобилизация, как живых, так и убитых микроорганизмов. поскольку, наряду с утилшацией микроорганизмами ионов металлов имеет место сорбция физического характера, обусловленная наличием фосфатных и уроновых групп в составе клеточной стенки бактерий Так. при сорбции кадмия им м оби лиз про в энным и живыми и убитыми fungal mycelia of Trameles versicolor сорбцнонные емкости составляли 102.3±3.2 мг/г и 120.6±3.8 мт/г. соответственно [63]. При сорбции кадмия. ртути и цинка иммобилизиров энными живыми Funaha trogn сорбционные емкости составили 164,8, 333 и 42.1 мг/г. соответственно а убитыми- 191.6. 403,2 и 54 мг/г [71]
Альгинат достаточно эффективно связывает ионы золота и в меньшей степени ионы серебра. Так, исследуя связывание ионов золота и серебра альгинатом кальция Е Torres и соавторы (2005) получили следующие сорбционные емкости: 290 мг/г для золота (при рН 2) и 52 мг/г для серебра (при рН 4) В процесс сорбции оказались вовлеченными карбоксильные и гидроксильные функциональные группы. Происходило восстановление Аиъ до Ли" и Agn до Aga с формированием наночастиц.
Для эффективного использования альгинатов в качестве комплексообразователей и ионообменников большое значение имеет химическая стойкость этих полисахаридов Для повышения устойчивости апьгинатов в щелочной среде их сшивают полифунциональными соединениями [116] При этом металлосвязывающая способность сшитых и несшитых алыинатов остается практически одинаковой.
Пектины М.Т Kartei и соавторы (1999) изучали сорбцию тяжелых металлов пектинами в водных растворах Было показано, что сродство пектинов к тяжелым металлам снижается в следующей последовательности: РЬ Си Со Ni Zn Cd. При этом большее сродство к ионам свинца и меди проявлял свекловичный пектин, к ионам кобальта - яблочный пектин, а к ионам никеля - цитрусовый пектин. Все пектины проявляли крайне низкое сродство к ионам цинка и кадмия Н.Ш. Кайшевой с соавторами (1992) было установлено, что комплексообразование пектинов с ионами металлов лучше протекает в щелочной среде. С усилением мегаллических свойств элементов образование комплексов происходит интенсивнее ЕЕ. Браудо и соавторы (2001а) оценивали сродство пектина с нулевой степенью этерификации к ионам свинца, кальция и стронция Максимальное значение константы связывания для РЬ составило 5,8 104 л/моль, для Са - 2,6 10J л/моль, для Sr -2.6 10э л/моль. Было установлено, что взаимодействие пектина с ионами свинца носит кооперативный характер и имеег место ев с рхстехи о метрическое связывание, ітротекаюшее по механизму соосаждения [43J Отмечено, что при низких концентрациях ионов пектин обнаруживает более высокое сродство к ионам кальция, чем к ионам стронция Высокое сродство пектина к ионам свинца означает, что свинец будет поглощаться пектином в максимальном количестве и при наличии ионов других металлов будет замещать их в элементарных ячейках контактных зон.
Связывание ионов металлов пектинами зависит от степени этерификации последних Чем меньше степень этерификации. тем выше сорбционная емкость В работе И.С Сергущенко и соавторов (2004) показано, что сорбционная емкость низкоэтерифицнрованного пектина со степенью этерификации 2,5% в отношении свинца, меди и кадмия в 1.5-3 раза превышает таковую высокоэтерифицированного пектина со степенью этерификации 61%.
Р Нате! и соавторы (2001) показали, что иммобилизация бактерий Pseudomonas putida и Saccharomyces cerevisiae на пектате кальция способствуег повышению связывания ионов кадмия из водного раствора с 10. 7мг/г до 13. 8мг/г.
Равновесная сорбция белка альгинатом кальция
Изотермы сорбции иммуноглобулина (рис. 10А), бычьего сывороточного альбумина (рис. ПА), инсулина (рис. I2A) и гиалуронидазы (рис 13А) выпуклые относительно оси абсцисс на начальном участке и имеют пологий характер возрастания. При дальнейшем увеличении концентрации наблюдается выход кривых на плато. Форма полученных кривых позволяет отнести их к классу L. Это так называемая нормальная кривая или изотерма Лэнгмюра (194]. В координатах Скэтчарда изотермы сорбции иммуноглобулина (рис. 10Б), бычьего сывороточного альбумина (рис. ПБ), инсулина (рис 12Б) и гиалуронидазы (рис ІЗБ) образуют прямые линии, описаны в уравнения Лэнгмюра.
Изотерма сорбции рибонуклеази имеет вид L-изотермы с наличием плато в области малых концентраций (рис. НА). При повышении концентрации сорбция продолжает расти Изотерма сорбции в координатах Скэтчарда имеет волнообразный вид, что говорит о сложном характере взаимодействия между альгинатом и рибонуклеазой (рис. І4Б). Экспериментальные данные представленные в координатах Хилла не предполагают наличие положительной кооператив но сти (рис 14В). График в координатах Бьеррума не позволяет достоверно говорить о существовании более чем одного типа мест связывания (рис 14Г)
Изотерма сорбции цитохрома также относится к классу L (рис. 15А). Она отличается от вышеописанных L-изотерм тем, что ее начальный участок проходит близко к оси ординат, что указывает на сильное сродство альгината кальция к цитохрому В координатах Скэтчарда (рис 15Б) изотерма образует вогнутую линию, что указывает на наличие так называемой отрицательной кооперативности или нескольких мест связывания с различными константами диссоциации [187] Эти два случая дискриминируют с помощью полулогарифмических координат или координат Бьеррума. Количество точек перегибов в этих координатах соответствует количеству типов мест связывания [5] Исходя из вида графика изотермы сорбции цитохрома в полулогарифмических координатах, нельзя предположить существование более чем одного типа мест связывания (рис 15В).
Количественные характеристики, полученные на основании линеаризованных кривых иммуноглобулина, бычьего сывороточного альбумина, инсулина, гиатуронидазы, рибонуклеазы и цитохрома приведены в таблице 1
Значения коэффициентов регрессии линеаризованных уравнений L-изотерм указывают на то, что данные изотермы хорошо описываются уравнением Лэнгмюра, за исключением изотермы сорбции рибонуклеазы Данная изотерма недостроена и продолжает расти, поэтому она лучше описывается уравнением Фрейндлиха. При вычислении констант линеаризованного уравнения Лэнгмюра метод подбора по квадратам отклонений лучше аппроксимировал экспериментальные данные Для вычисления констант линеаризованного уравнения Фрейндлиха был использован метод наименьших квадратов.
Значения максимальной сорбционной емкости и констант диссоциации, вычисленных методом Скэтчарда, также приведены в таблице 1 Сравнивая константы сродства, вычисленные этими методами видно, что сродство альгината кальция к данным белкам снижается в следующей последовательности цитохром инсулин бычий сывороточный альбумин гиалуронидаза иммуноглобулин рибонуклеаза Максимальная сорбциоиная емкость альгината кальция снижается в ряду рибонуклеаза иммуноглобулин цитохром бычий сывороточный альбумин гиалуронидаза инсулин. Изотерма сорбции рибонуклеазы является неполной, вследствие чего количественные показатели сорбции вычислены с большой погрешностью и носят недостоверный характер
Изотерма сорбции дезоксирибонуклеазы носит сигмоидный характер (S-образная кривая) (рис. 16) В области низких концентраций сорбция отсутствует, начальный участок кривой лежит на оси абсцисс. При увеличении концентрации сорбшюнная емкость в узком интервале резко увеличивается, и продолжает расти. Такая кривая может говорить о кооперативном связывании молекул дезоксирибонуклеазы с альгинатом кальция, означая, что процесс сорбции происходит в два этапа [64]
Изотерма сорбции, представленная в координатах Скэтчарда (рис. 18А), отклоняется от прямой линии и имеет восходящий участок, что может указывать на то, что сродство к каждой последующей молекуле белка альгината кальция возрастает, те на положительную кооперативность. Для достоверного определения положительной ко оперативности, изотерма сорбции дезокс!1рибонуклеазы представлена в координатах Хилла (рис 18Б) В координатах Хилла предположение о наличии положительной кооперативности подтверждается: тангенс угла наклона кривой равен 1,9. Константа диссоциации (Kj), найденная по точке пересечения графика с осью абсцисс, равна 2,4 При кооперативном связывании процесс сорбции характеризуется начальной константой ионизации (Ко), параметром кооперативности или константой равновесия для агрегации двух молекул белка на сорбенте (п) и общей константой связывания (К) Параметр кооперативности равен 1,9 (наклон кривой в точке половинного насыщения) (рис.16, вставка) и совпадает с величиной, найденной из графика Хилла Общая константа связывания, определяемая как обратная величина равновесной концентрации при половинном насыщении равна 3,03 Начальная констанга, найденная из соотношения К0-К/п, равна 1,6
Изотерма сорбции дезоксирибонуклеазы в координатах Бьеррума позволяет предположить наличие двух мест связывания (рис. 17) Изотерму продифференцировали для более четкого определения точек перегиба (рис. 17, вставка). О наличие нескольких мест связывания говорит также и кинетическая кривая связывания дезоксирибонуклеазы, имеющая несколько точек перегиба (рис. 1).
Изотермы сорбции трипсина и химотрипсина также можно отнести к сигмоидным кривым (рис 19А, рис 20А). Кривые, вогнутые относительно оси абсцисс, при дальнейшем росте концентрации переходят в выпуклые Изотермы, представленные в координатах Скэтчарда, имеют возрастающий участок (рис 19Б, рис 20Б) Угол наклона прямой в координатах Хилла меньше 45. что не подтверждает наличие положительной кооперативное (рис. 19В, рис. 20В) Вид изотерм сорбции трипсина и химотрипсина в координатах Бьеррума не позволяег предположить существование более чем одного типа мест связывания (рис. 18Г, рис 19Г). Константа диссоциации. вычисленная по точке перегиба в координатах Бьеррума, для трипсина составила 1.2 мг/мл, а для химотрипсина - 5,5 мг/мл.
Количественные характеристики параметров изотерм сорбции дезоксирибонуклеазы, трипсина и химотрипсина представлены в таблице 2 Низкие значения коэффициента регрессии линеаризованного уравнения Лэнгмюра изотермы сорбции дезоксирибонуклеазы указывает на то, что эта изотерма плохо описывается данным уравнением При вычислении констант линеаризованного уравнения Лэнгмюра метод подбора по критерию Чебышева был единственным, достаточно хорошо описавший экспериментальные данные. Уравнение Фрейндлиха тоже не способно описать процесс сорбции дезоксирибонуклеазы альгинатом кальция, на что указывают низкое значение коэффициента регрессии и высокое значение константы Фрейндлиха ( 1). Изотермы сорбции трипсина и химотрипсина плохо описываются уравнением Фрейндлиха Несколько лучше они описываются уравнением Лэнгмюра, параметры которого вычислены методом подбора по квадратам отклонений (табл. 2).
Равновесная сорбция белка микрокристаллической целлюлозой
Изотермы сорбции иммуноглобулина (рис. 37 А), человеческого сывороточного альбумина (рис. 38А), инсулина (рис 39А) и трипсина (рис. 40А) имеют вид L-кривых. В координатах Скэтчарда все изотермы имеют вид вогнутой к оси абсцисс линии (рис. 37Б, 38Б, 39Б, 40Б) Но вид изотерм сорбции иммуноглобулина (рис 378), человеческого сывороточного альбумина (рис 38В), инсулина (рис 39В) и трипсина (рис. 40В) в координатах Бьеррума не позволяет предположить наличие более одного типа мест связывания
Рнс. 37. Изотерма сорбции иммуноглобулина микрокристаллической целлюлозой (А), представленная в координагах Скэтчарда (Б) и координатах Бьеррума (В).
Количественные характеристики процесса сорбции белка микрокристаллической целлюлозой представлены в таблице 6. Как видно из таблицы, уравнение Фрейндлиха лучше описывает сорбцию данных белков микрокристаллической целлюлозой Об этом свидетельствует более высокие линейные коэффициенты уравнения Фрейндлиха. Для вычисления параметров более приемлемым является метод подбора по квадратам отклонений. В таблице 6 приведены также константы, вычисленные методом Скэтчарда. Поскольку изотерма в координатах Скэтчарда имеет вид вогнутой кривой, максимальную сорбционную емкость находили по точкам пересечения с осью абсцисс асимптот, проведенных через участки изотермы сорбции, полученные при малых и больших концентрациях белка. Константу диссоциации вычисляли из координат Бьеррума. Согласно полученным константам.
Большее сродство микрокристаллическая целлюлоза проявляет к человеческому сывороточному альбумину и инсулину Максимальная сорбционная емкость выше в отношении иммуноглобулина и трипсина.
Равновесная сорбция белка диоктаэдрическим смектитом
Изотермы сорбции иммуноглобулина (рис 49 А), человеческого сывороточного альбумина (рис. 50А), инсулина (рис 51А) и трипсина (рис. 52А) диоктаэдрическим смектитом имеют вид L-кривых Кривые связывания инсулина (рис 51Б) и трипсина (рис. 52Б), представленные в координатах Скэтчарда имеют вид прямых. Кривые связывания иммуноглобулина (рис. 49Б) и человеческого сывороточного альбумина (рис. 50Б) в координатах Скэтчарда имеют вид вогнутых кривых Вид изотерм сорбции иммуноглобулина (рис 49В) и человеческого сывороточного альбумина (рис. 50В) в координатах Бьеррума не позволяет предположить наличие более чем одного типа мест связывания.
Как видно из таблицы 9 сорбция иммуноглобулина и человеческого сывороточного альбумина лучше описывается уравнением Фрейндлиха, а сорбция инсулина и трипсина - уравнением Лэнгмюра. Константы уравнения Лэнгмюра вычислены методом подбора по квадратам отклонений. Согласно полученным константам, диоктаздрический смектит проявляет большее сродство к иммуноглобулину и человеческому сывороточному альбумину Значения максимальной сорбционной емкости диоктаэдрического смектита примерно одинаковы в отношении протестированных белков. Для человеческого сывороточного альбумина и иммуноглобулина значение максимальной сорбционной емкости найдено по точке пересечения с осью абсцисс асимптот проведенных через участки изотермы, полученные при малых и больших концентрациях белка. Константа диссоциации найдена из координат Бьеррума