Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Гексоген и тринитротолуол как объекты химического и химико-токсикологического исследования 13
1.1. Физические свойства гексогена и тринитротолуола 13
1.2. Получение объектов исследования и их применение 14
1.3. Токсикологическая характеристика 17
1.4. Идентификация объектов исследования 20
1.5. Количественное определение 25
1.6. Изолирование и очистка ароматических и гетероциклических нитропроизводных 33
1.7. Метаболизм, распределение в теплокровных организмах и сохраняемость в трупном материале ароматических и гетероциклических нитропроизводных 38
Глава 2. Идентификация гексогена и тринитротолуола 47
2.1. Идентификация по электронным и колебательным спектрам 47
2.2. Идентификация хроматографическими методами 48
2.3. Идентификация хромогенными реакциями 59
Выводы ко второй главе 61
Глава 3. Количественное определение рассматриваемых соединений 64
3.1. Определение фотометрическим методом 64
3.2. Определение методом ВЭЖХ 69
Выводы к третьей главе 74
Глава 4. Выделение и очистка объектов исследования 76
4.1. Очистка хроматографическими методами и особенности хроматографического поведения исследуемых веществ 76
4.1.1. Использование колоночного варианта хроматографирования 76
4.1.2. Использование тонкослойной хроматографии 79
4.2. Оценка степени очистки извлечений из биологического материала в контрольных опытах 80
Выводы к четвертой главе 84
Глава 5. Определение гексогена и тринитротолуола в биологическом материале 85
5.1. Сравнительное изучение изолирования исследуемых соединений из биологической ткани различными изолирующими агентами 85
5.2. Определение гексогена в биологическом материале 87
5.2.1. Определение с использованием в качестве изолирующего агента ацетона 87
5.2.1.1. Поиск оптимальных условий изолирования исследуемого вещества 87
5.2.1.2. Методики определения гексогена в ткани трупных органов и биожидкостях 90
5.3. Определение тринитротолуола в биологическом материале 95
5.3.1. Определение с использованием в качестве изолирующего агента ацетонитрила 95
5.3.1.1. Поиск оптимальных условий изолирования исследуемого вещества 95
5.3.1.2. Методики определения тринитротолуола в ткани трупных органов и биожидкостях 99
5.4. Определение гексогена и тринитротолуола при их совместном присутствии в биологическом материале 103
5.4.1. Определение с использованием в качестве изолирующего агента смеси ацетонитрил-ацетон (1:1) 103
5.4.1.1. Поиск оптимальных условий изолирования исследуемого вещества 103
5.4.1.2. Методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях 109
5.4.1.3. Методика определения рассматриваемых соединений в модельных смесях с почвой и пробах почвы с места взрыва 113
Выводы к пятой главе 115
Глава 6. Распределение в организме теплокровных и сохраняемость исследуемых соединений в трупном материале 118
6.1. Распределение тринитротолуола в организме теплокровных животных 118
6.2. Сохраняемость объектов исследования в трупном материале 121
Выводы к шестой главе 128
Общие выводы 142
Список литературы 147
Приложение
- Получение объектов исследования и их применение
- Идентификация хроматографическими методами
- Использование колоночного варианта хроматографирования
- Определение с использованием в качестве изолирующего агента ацетона
Введение к работе
Актуальность темы. Гексоген и тринитротолуол широко известны в качестве взрывчатых средств и используются как при геологических работах, так и в военном деле. Они обладают значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку, в связи с чем являются потенциальными объектами судебно-химического исследования.
Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществами в процессе их производства и хранения, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды остатками боеприпасов и отходами химических производств.
ІХ>5о гексогена и тринитротолуола для лабораторных животных (мышей, крыс) составляет примерно 400-500 мг/кг.
Летальная доза тринитротолуола для человека составляет 1-2 г.
Широкое применение гексогена и тринитротолуола, их токсичность, наличие случаев отравления, в том числе и со смертельным исходом, обусловливает необходимость изучения этих соединений в судебно-химическом отношении.
До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования гексогена и тринитротолуола из объектов биологического происхождения, их обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемых соединений в биологическом (трупном) материале.
Исходя из вышеизложенного, разработка методики судебно-химического исследования гексогена и тринитротолуола является актуальной.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического исследования гексогена и тринитротолуола.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить особенности хроматографической активности исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов;
выявить оптимальные условия идентификации и количественного определения гексогена и тринитротолуола;
изучить особенности взаимодействия исследуемых соединений с рядом цветореагентов. Показать возможность применения отдельных реакций восстановления и образования молекулярных продуктов типа п-донор- тг-акцептор в условиях анализа биологического материала;
- провести изучение возможности применения твердофазной
экстракции для концентрирования и очистки объектов исследования;
исследовать особенности изолирования объектов исследования различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений;
изучить особенности распределения объектов исследования в организме теплокровных животных;
- определить сроки сохраняемости объектов исследования в трупном
материале.
Научная новизна исследования. Изучены отдельные закономерности хроматографического поведения гексогена и тринитротолуола в сорбентах с гидроксилированной поверхностью при использовании различных подвижных фаз; определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.
На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения гексогена и тринитротолуола методами ТСХ и ВЭЖХ.
Исследованы особенности электронных и колебательных спектров поглощения гексогена и тринитротолуола. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.
Впервые для идентификации и количественного определения гексогена и тринитротолуола предложены хромогенные реакции с N,N-диметилформамидом и с 2,6-бис-[бис-(|3-оксиэтил)-амино]-4,8-ди-1М-пиперидина-пиримидо(5,4-с!)пиримидином, а также методы, основанные на поглощении ими УФ-излучения в различных средах.
Впервые для изолирования гексогена и тринитротолуола из биологического материала в качестве изолирующего агента предложена смесь ацетон-ацетонитрил (1:1). На основе использования в качестве изолирующего агента данной смеси и очистки методом хроматографии разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно измененного трупного материала.
В опытах на животных (кролики) исследованы особенности распределения тринитротолуола в организме теплокровных.
Изучены сроки сохранения данных веществ в трупном материале.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
- методики изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения 2,4,6-тринитротолуола и гексогена (проект информационного письма; акт апробации в ГУЗ « Кур-
ское областное бюро судебно-медицинской экспертизы Комитета здравоохранения Курской области» от 25.12.2007; акт апробации в ЭКЦ УВД по Липецкой области от 29.11.2007);
- методика качественного определения гексогена по поглощению в
смеси ацетонитрил-вода (6:4) (внедрена в учебную (практические занятия)
и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии
Белгородского государственного университета с 15.05.2006);
- методика количественного определения гексогена на основе
поглощения в УФ- части спектра (внедрена в учебную (практические
занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и
фармакогнозии Белгородского государственного университета с
15.05.2006);
- методика качественного определения 2,4,6-тринитрометилбензола в
ткани печени (внедрена в учебную (практические занятия) и научную
работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского
государственного университета с 06.04.2006);
-методика количественного определения 2,4,6-
тринитрометилбензола в ткани печени (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 13.04.2006);
-методика количественного определения 2,4,6-
тринитрометилбензола в ткани лёгких (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 13.04.2006);
- методика определения 2,4,6-тринитротолуола (2,4,6-ТНТ) методом
ВЭЖХ с применением нормальнофазного сорбента (внедрена в учебную
(практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 23.05.2006);
Связь задач исследования с проблемным
планом фармацевтических наук. Работа выполнялась в
соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической,
токсикологической и аналитической химии Курского государственного
медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация»
межведомственного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04
«Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии,
токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер государственной регистрации 01.200.208428.
Основные положения,выносимые на защиту:
- результаты изучения хроматографической активности гексогена и
тринитротолуола в тонких слоях и колонках сорбентов с
гидроксилированной и привитой поверхностями;
-особенности поглощения электромагнитного - излучения исследуемыми веществами в УФ и ИК- областях спектра;
- оптимальные условия взаимодействия анализируемых веществ с
рядом цветореагентов;
- методики идентификации и количественного определения
гексогена и тринитротолуола хроматографическим и фотометрическим
методами;
- методики изолирования из биологического материала гексогена и
тринитротолуола;
особенности распределения тринитротолуола в организме теплокровных;
- сохраняемость гексогена и тринитротолуола в трупном материале.
Апробация работы. Основные положения работы апробированы на Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), на 67-ой, 69-ой и 71-ой научых сессиях КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Чернозёмного научного центра РАМН (Курск, 2002, 2004, 2006), на III Международной научно-практической конференции «Экологические проблемы современности» (Пенза, 2007), на научно-практической конференции, посвященной 65-летию образования судебно-медицинской экспертизы Вооружённых Сил Российской Федерации «Проблема судебно-медицинской экспертизы в условиях реформирования вооружённых сил и Генеральной прокуратуры Российской Федерации» (Москва, 2008).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 публикациях, 1 из которых —патент на изобретение.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, общей схемы исследования, общих выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 173 страницах. Список цитируемой литературы включает 204 источника, среди которых 141 на русском и 63 на иностранных языках.
В первой главе (обзор литературы) приводятся известные данные о гексогене и тринитротолуоле, о близких по структуре и свойствам нитроароматических соединениях, как объектах химического и химико-токсикологического исследования.
Вторая глава диссертации посвящена вопросам идентификации гексогена и тринитротолуола.
Третья глава включает экспериментальные данные по вопросам количественного определения рассматриваемых веществ.
В четвертой главе представлены результаты изучения особенностей выделения и очистки анализируемых соединений хроматографическими методами.
Пятая глава посвящена вопросам изолирования гексогена и тринитротолуола из объектов биологического происхождения и особенностям определения рассматриваемых соединений в извлечениях из биологического материала.
В шестой главе приводятся данные, характеризующие распределение в организме теплокровных и сохраняемость анализируемых веществ в трупном материале.
Получение объектов исследования и их применение
Гексоген впервые был получен Ненцем в 1897 г. Гексоген по химической структуре близок к известному лекарству гексаметилентетрамину, использующемуся для лечения мочевыводящих путей. В 1899 году Ганс Геннинг получил патент на один из способов его производства, надеясь, что гексоген окажется лучшим лекарством, чем гексаметилентетрамин. Однако, в аптеки гексоген не попал, так как вовремя выяснилось, что он сильнейший яд. В 1920 г. Герц показал, что гексоген является взрывчатым веществом, превосходящим тротил, и предложил получать гексоген непосредственным нитрованием гексаметилентетрамина концентрированной азотной кислотой. В настоящее время — это основной способ его получения. Гексоген может быть синтезирован путём обработки гексаметилентетрамина нитритом натрия и азотной кислотой. Известны методы получения гексогена на основе реакции поликонденсации формальдегида в присутствии нитрата аммония, нитрованием пергидротриазинов со сформированным триазиновым кольцом, нитрованием гексаметилентетрамина пентоксидом азота в дихлорэтане.
Выход конечного продукта возрастает вдвое при дополнительном введении в реакционную смесь нитрата аммония и уксусного ангидрида. В зависимости от метода получения гексоген в качестве основных примесей содержит: оксигексоген (при нитролизном методе синтеза) или октоген (при уксусноангидридном методе) [99]. Полученный кустарным способом гексоген, как правило, содержит значительное количество нестойких кислых примесей, снижающих его химическую стойкость, такой продукт не подлежит длительному хранению и разлагается до гексаметилентетрамина с выделением ряда конденсированных и газообразных продуктов гидролиза [96]. 2,4,6-ТНТ впервые был получен немецким химиком Вильбрандом в 1863 году, но лишь в начале 20 века нашел применение в качестве взрывчатого вещества. 2,4,6-ТНТ получается путем нитрования толуола нитрующей смесью. Образование конечного продукта происходит через промежуточные стадии. Вначале в ароматическое ядро толуола вводится одна нитрогруппа -образуется смесь орто- и пара- изомеров. Смесь содержит небольшое количество м-нитротолуола (около 4 %). В дальнейшем пара- и орто-нитротолуолы превращаются в 2,4-динитротолуол. Из орто-нитротолуола в небольшом количестве образуется 2,6-динитротолуол. 2,4- и 2,6-динитротолуолы в заключительной стадии нитрования переходят в 2,4,6-тринитротолуол. 2,4,6-ТНТ, синтезированный таким образом, может содержать небольшое количество примесей изомеров-2,3,4-тринитротолуола и 2,4,5-тринитротолуола. Примеси удаляют путем нагревания продукта с 5 % водным раствором сульфита натрия, в результате чего изомеры превращаются в соли 3-моносульфопроизводных, которые в отличие от 2,4,6-ТНТ хорошо растворимы в воде.
Гексоген - один из самых мощных высоко-бризантных взрывчатых веществ. Он обладает более высокими плотностью и скоростью детонации, чем 2,4,6-ТНТ. Широкое использование гексогена и взрывчатых смесей на его основе для снаряжения боеприпасов обусловлено его стойкостью, сравнительной простотой технологии производства и практически неограниченной сырьевой базой.
Гексоген в смеси с другими взрывчатыми и горючими веществами (например, 2,4,6-ТНТ и порошкообразным алюминием) встречается в различных видах боеприпасов - артиллерийских снарядах, авиационных бомбах, морских минах и торпедах, боевых частях ракет. В смесях с флегматизаторами и красителями гексоген используется для снаряжении боеприпасов артиллерии малых калибров, кумулятивных зарядов военного и промышленного назначения, ручных гранат, средств детонирования и др. Составы на основе гексогена, пластифицирующих агентов и других технологических добавок (полиизобутилен, трансформаторное масло и т.п.) используются в виде пластичных и эластичных взрывчатых веществ. Гексоген в качестве энергетической добавки входит в состав ракетного твердого топлива.
В гражданских целях составы на основе гексогена, 2,4,6-ТНТ, мелкодисперсного алюминия и аммиачной селитры широко используются в горнорудной промышленности при разрушении прочных горных пород и для прострела нефтяных скважин под общим названием скальных аммонитов. В чистом виде (нефлегматизированном) гексоген используется крайне редко. Содержится в выбросах производства взрывчатых веществ [16], в продуктах утилизации ракетного твердого топлива [107].
Тринитротолуол (2,4,6-ТНТ) - наиболее важное бризантное взрывчатое вещество для снаряжения боеприпасов (используется как в чистом виде, так и в смеси с гексогеном, октогеном, тетранитропентаэритритом) и для взрывных работ (в смеси с нитратом аммония, алюминием). Содержится в выбросах производства взрывчатых веществ. 2,4,6-ТНТ взрывается при детонации. Описана возможность превращения 2,4,6-ТНТ в конденсационные мономеры (нитросоединения, диамины и т.д.) и использования этих мономеров в синтезе ароматических полимеров, в частности, для получения олигоэфиров и полиамидов (или полиимидов) соответственно [87]. 2,4,6-ТНТ может использоваться в качестве цветореагента при определении первичных аминов в виде азокрасителей [44].
Идентификация хроматографическими методами
В процессе исследования изучена хроматографическая активность гексогена и 2,4,6-ТНТ в тонком слое силикагеля- сорбента на основе поликремневой кислоты. На поверхности силикагеля имеются несколько типов активных групп, из которых наибольшее значение в адсорбционной хроматографии нитропроизводных гетероциклического и ароматического ряда играют силанольные группировки.
При проведении определений по 5 мкг каждого из анализируемых веществ наносили на линию старта хроматографической пластины размером 6,6x10 см в виде 0,02% ацетоновых растворов. Процесс хроматографирования осуществляли восходящим методом в стеклянных камерах с внутренним объемом около 600 см . Хроматограммы детектировали, облучая их УФ-светом. При этом исследуемые вещества проявлялись в виде тёмных розоватых пятен на более светлом общем фоне пластины. В видимом свете пятна гексогена и 2,4,6-ТНТ на хроматограммах не имели окраски. С течением времени пятна 2,4,6-ТНТ в видимом свете приобретали желтоватую, а затем-красноватую окраску.
При обработке пластины парами аммиака пятна 2,4,6-ТНТ приобретали красное окрашивание.
Хроматографическое поведение рассматриваемых веществ, а также близких к ним по структуре соединений из группы ароматических и гетероциклическоих нитропроизводных обусловлена несколькими типами взаимодействий, из которых наиболее значимой, очевидно, является способность к образованию водородных связей между отдельными фрагментами структур адсорбата, компонентов подвижных фаз и адсорбента. Вначале было изучено хроматографическое поведение анализируемых веществ в однокомпонентных подвижных фазах. В качестве подобных фаз выбирались растворители с различным значением диэлектрической проницаемости: гексан, толуол, тетрахлорметан, дихлорэтан, диоксан-1,4, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, этанол, пропанол-2, ацетонитрил.
Установлено, что наименьшая хроматографическая подвижность исследуемых веществ, а также группы близких к ним по структуре соединений наблюдается при использовании в качестве элюента гексана -неполярного вещества с наименьшим значением диэлектрической проницаемости.
При хроматографировании в таких растворителях как гексан анализируемые соединения за счёт наличия в них нитрогрупп имеют возможность взаимодействовать с гидроксилированной поверхностью сорбента. Растворитель в этом случае, не имея в своей структуре гидроксильных групп или других активных участков, мало мешает этому взаимодействию. Сам он не способен к образованию водородных связей с силанольными группировками силикагеля. В этом случае хроматографическая подвижность веществ незначительна. При использовании гексана в качестве подвижной фазы пятна исследуемых веществ на хроматограммах обнаруживались практически на линии старта.
При переходе к подвижным фазам с большей диэлектрической проницаемостью (тетрахлорметан, толуол, дихлорэтан) в целом наблюдалось увеличение хроматографической подвижности анализируемых веществ. Растворители с высокими значениями диэлектрической проницаемости, в частности, ацетон, этанол, пропанол-2, ацетонитрил, конкурируют с молекулами адсорбата за образование водородных связей с силанольными группами силикагеля. Вместе с тем они обладают достаточным сродством к анализируемым веществам, о чём свидетельствует относительно более высокая растворимость последних в этих растворителях. При этом взаимодействие гексогена и 2,4,6-ТНТ с поверхностью сорбента значительно ослаблено, и анализируемые вещества продвигаются вместе с подвижной фазой достаточно быстро. На хроматограммах пятна исследуемых соединений обнаруживаются в этом случае ближе к линии финиша.
Результаты хроматографирования исследуемых веществ на пластинах «Силуфол» UV- 254 с применением однокомпонентных подвижных фаз представлены в таблице 4. На основе хроматографического определения анализируемых соединений в индивидуальных растворителях составлялись многокомпонентные системы растворителей, включающих два или три компонента. Двухкомпонентные системы составлялись по принципу присутствия в них одного малополярного и одного сильнополярного растворителя. Таким образом, пытались достичь расположения пятен анализируемых веществ ближе к середине хроматографической пластины. Другой задачей являлась достижение наилучшего разделения гексогена, 2,4,6-ТНТ и ряда близких по структуре соединений. При этом проводили поиск оптимальных соотношений между полярным и малополярным компонентами подвижных фаз и, при необходимости, вводили третий дифференцирующий компонент в рассматриваемые системы.
Значения Rf и Rs (отношение к значению Rf 1,3-динитробензола), полученные при использовании оптимальных многокомпонентных подвижных фаз, представлены в таблице 4. Как свидетельствуют данные результаты, наиболее применимыми для разделения рассматриваемых соединений являются системы растворителей гексан-ацетон (6:4), гексан-этилацетат (6:4), гексан-пропанол-2 (8:2). Результаты хроматографирования группы исследуемых нитропроизводных в тонких слоях гидроксилированных сорбентов показывают, что при использовании всех предлагаемых систем растворителей гексоген обладает значительно меньшей хроматографической активностью, чем 2,4,6-ТНТ. Наименьшая хроматографическая подвижность из всей группы анализируемых соединений наблюдалась у 2,4,6- ТНТ, образующего с гидроксилированной поверхностью силикагеля наиболее прочные связи за счёт присутствия в его структуре гидроксильного радикала и трёх нитрогрупп.
Болыпуя хроматографическую подвижность 2,4-динитротолуола по сравнению с 1,3-динитробензолом, не имеющим алкильного радикала, можно объяснить ослаблением взаимодействия с поверхностью сорбента нитрогруппы, находящейся в «орто»-положении к метильной группе и большим сродством алкильного производного к неполярным компонентам подвижных фаз. С увеличением числа нитрогрупп в молекуле алкилнитро бензолов (при переходе от структуры 2,4-динитротолуола к структуре 2,4,6-ТНТ) хроматографическая подвижность уменьшается вследствие образования более прочных связей с поверхностью адсорбента за счёт появления третьей нитрогруппы.
Использование колоночного варианта хроматографирования
Изучена хроматографическая подвижность объектов исследования в макроколонках с силикагелем. Подвижные фазы выбирали таким образом, чтобы обеспечивалось отделение анализируемых соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала и чтобы процесс элюирования не был продолжительным. При выборе элюентов исходили также из результатов хроматографирования объектов исследования в тонком слое силикагеля (раздел 2.2 главы 2 настоящей диссертации).
В случае проведения процесса в режиме изократического элюирования в качестве подвижной фазы была применена система растворителей гексан-ацетон (7:3), при осуществлении процесса в режиме градиентного элюирования - подвижные фазы гексан-ацетон (8,5:1,5) и гексан-ацетон (6:4). В работе использовалась стеклянная колонка, являющаяся стандартной бюреткой для титрования, градуированной на 25 мл размером 490x11 мм. Колонку заполняли 10 г силикагеля L 40/100 JI производства фирмы «Chemapol» (Чехословакия). Перед хроматографированием по 5 мг гексогена и 2,4,6-ТНТ растворяли в 1-2 мл ацетона. Образующийся раствор перемешивали с 1,5 г силикагеля L 40/100ц и, после испарения растворителя, вносили данную смесь в стеклянную хроматографическую колонку, заполненную 8,5 г силикагеля L 40/1 ООц. Содержимое колонки уплотняли путём равномерного постукивания по внешней поверхности её стенок, после чего осществляли процесс хроматографирования. 1. Хроматографирование в условиях изократического элюирования В качестве элюента использовали подвижную фазу гексан-ацетон (7:3) или подвижную фазу гексан-ацетон (8,5:1,5), поддерживая высоту столба элюента над поверхностью сорбента на уровне 26-28 см. Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая в градуированные пробирки. Анализируемые вещества во фракциях обнаруживали путем нанесения небольших объемов каждой фракции на пластины «Силуфол» UV-254 и хроматографирования при использовании подвижной фазы гексан-этилацетат (6:4) в присутствии веществ-свидетелей с последующим проявлением хроматограмм в УФ- свете. Гексоген и 2,4,6-ТНТ проявлялись в виде пятен с Rf соответственно 0,17 и 0,68. Результаты хроматографирования рассматриваемых соединений в колонках с силикагелем в условиях изократического элюирования представлены в таблице 16. 2. Хроматографирование в условиях градиентного элюирования Вначале в качестве элюента использовали подвижную фазу гексан ацетон (8,5:1,5). В процессе хроматографирования высоту столба элюента над поверхностью сорбента на уровне 26-28 см. Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая в градуированные пробирки. В указанном режиме обирали 10 фракций элюата. Затем остатки подвижной фазы гексан- ацетон (8,5:1,5), находящейся над поверхностью сорбента, удаляли из колонки, а в колонку начинали подавать подвижную фазу гексан-ацетон (6:4), поддерживая высоту столба элюента над поверхностью сорбента на уровне 26-28 см. Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая в градуированные пробирки. Анализируемые вещества во фракциях обнаруживали путем нанесения небольших объемов каждой фракции на пластины «Силуфол» UV-254 и хроматографирования при использовании подвижной фазы гексан-этилацетат (6:4) в присутствии веществ-свидетелей с последующим проявлением хроматограмм в УФ- свете. Гексоген и 2,4,6-ТНТ проявлялись в виде пятен с Rf соответственно 0,17 и 0,68.
Результаты хроматографирования рассматриваемых соединений в колонках с силикагелем в условиях изократического элюирования представлены в таблице 16. Фракции, содержащие то или иное анализируемое вещество, объединяли, испаряли до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в 10 мл ацетонитрила, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объём содержимого колбы до метки водой. 4-15 мкл полученного раствора отбирали для хроматографирования методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляли на приборе «Alliance» фирмы «Waters» в колонке размерами 150x4 мм, заполненной сорбентом «Nova Pack С-18». В качестве подвижной фазы использовали систему растворителей ацетонитрил-вода (4:6). Параметры хроматографирования анализируемых соединений приведены в разделе 2.2 главы 2. Количественное содержание того или иного исследуемого вещества определяли, исходя из площади хроматографического пика, с использованием уравнения калибровочного графика (раздел 3.2) и пересчитывали на навеску, вводимую в колонку. Результаты определения и метрологические характеристики представлены в таблице 17. Как свидетельствуют полученные данные, количества анализируемых веществ, определенные в элюатах, составляют немногим менее 100% от количеств этих веществ, вводимых в макроколонку. Таким образом, можно заключить, что потери исследуемых веществ при хроматографировании в колонках с силикагелем в предлагаемых условиях весьма несущественны.
Определение с использованием в качестве изолирующего агента ацетона
Предварительно готовили искусственные смеси гексогена с тканью печени из расчета 25 мг вещества в 25 г биологического материала. Приготовленные смеси, а также контрольные образцы ткани печени сохраняли в течение 2 часов при температуре 18-22С.
По истечении указанного времени отбирали на анализ по 5 г каждой искусственной смеси или контрольного образца печёночной ткани. Каждую искусственную смесь параллельно с контрольным образцом настаивали с определённой массой изолирующего агента (5, 10, 12,5, 15 или 20 г) четырёхкратно. Продолжительность каждого настаивания составляла 1 час. Каждое извлечение помещали в отдельную пробирку. Извлечения при необходимости упаривали в 4 раза. Определенное количество каждого из полученных извлечений наносили на линию старта хроматографической пластины типа «Силуфол» UV-254. Одновременно на линию старта наносили 5-10 мкг вещества-свидетеля в виде 0,02% ацетонового раствора. В качестве элюента использовали систему растворителей гексан-этилацетат (5:5). Процесс хроматографирования осуществляли по схеме, описанной в разделе 2.2 настоящей диссертации. Исследуемое вещество идентифицировали на основе совпадения его значения Rf со значением Rf вещества-свидетеля (0,34±0,02). Гексоген элюировали из хроматограммы 5 мл этанола. В случае необходимости элюат мог быть разбавлен. Оптическую плотность полученного элюата измеряли на спектрофотометре СФ-46 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине волны 232 нм. Измерения проводили на фоне элюата, полученного в контрольном опыте.
Как свидетельствуют полученные данные, для достаточно полного извлечения рассматриваемого вещества из трупной печени необходимо по крайней мере двукратное настаивание биологического материала с изолирующим агентом при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза по массе. Приготовление и сохранение искусственных смесей гексогена с биоматериалом и контрольных образцов биологической ткани осуществляли по схеме, описанной в разделе 5. 1. В процессе исследования отдельные порции искусственных смесей или контрольных образцов (по 5 г каждая) двукратно настаивали с порциями ацетона по 10 г каждая в течение определенного времени (15, 30, 45, 60 или 75 минут). Отдельные извлечения, полученные при одинаковой продолжительности настаивания, объединяли и упаривали при необходимости в 4 раза. В каждом случае часть объединённого извлечения наносили на линию старта пластины типа «Силуфол» UV-254 и далее поступали так, как указано в пункте А настоящего раздела. Результаты определений (п=5) представлены на рисунке 5.
Как свидетельствуют полученные данные, оптимальное время контакта биоматериала с ацетоном составляет 45 минут. Изучена зависимость степени извлечения гекесогена ацетоном от концентрации анализируемого соединения в биологическом объекте. В каждом случае 5,00 г мелкоизмельченной трупной печени человека, содержащей определенное количество гексогена (от 0,50 до 15,00 мг), заливали 10 г ацетона и выдерживали в течение 45 минут при периодическом перемешивании. Извлечения сливали, а процесс настаивания повторяли по описанной выше схеме. Отдельные извлечения объединяли и при необходимости упаривали в 4 раза. Часть объединенного извлечения наносили на хроматографическую пластину «Силуфол» UV-254, и далее поступали в соответствие со схемой, описанной в пункте А настоящего раздела.
Результаты определений (п=5) представлены в таблице 23. Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 23, увеличение содержания гексогена в модельных смесях в достаточно широком интервале концентраций (0,50 - 15,00 мг) при постоянной массе навески ткани печени (5 г) сопровождается лишь незначительным изменением значений степени извлечения, не превышающим 2 %. 25 г искусственной смеси или такое же количество контрольного образца биоматериала заливали 50 мл ацетона, выдерживали 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение сливали с твёрдых частиц биоматериала, а операцию настаивания повторяли в вышеописанных условиях. Отдельные извлечения объединяли, пропускали через слой безводного сульфата натрия (через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1,5 — 2,0 см), слой сульфата натрия промывали 20 мл ацетона. Оба фильтрата объединяли в выпарительной чашке и испаряли растворитель. Остаток растворяли в 10 мл ацетона («исходный ацетоновый раствор»).
