Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика 2-диметиламино-1,3-бис (фенилсульфонилтио)пропана в физико-химическом и химико-токсикологическом аспектах 15
1.1. Оценка физических характеристик 2-диметиламино-1,3-бис -(фенилсульфонилтио)пропана 15
1.2. Известные схемы синтеза рассматриваемого токсиканта и области его области его применения 16
1.3. Токсичность и особенности токсического действия 20
1.4. Идентификация объекта исследования и близких по структуре и свойствам веществ 27
1.6. Известные варианты изолирования и способы очистки 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана и подобных по структуре органических ядов 36
1.7. Особенности биотрансформации, характер распределения в организмах и устойчивости 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана и веществ с похожей структурой в различных объектах 39
Экспериментальная часть 41
Глава 2. Исследуемый объект, используемые приборы, применяемые реактивы и материалы, посуда 41
Глава 3. Разработка способов идентификации 2 диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана 44
3.1.1. Разработка способа идентификации с использованием ТСХ 44
3.1.2. Разработка методики определения в колонках твёрдых неподвижных фаз (ВЭЖХ) 47
3.2. Разработка методики иидентификации комбинированным методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) 48
3.3. Разработка методик идентификации по электронным и ИК спектрам 51
3.3.1. УФ-спектрофотометрия 51
3.3.2. Колебательная спектрофотометрия 52
Выводы по главе 3 53
Глава 4. Разработка методик количественного определения рассматриваемого соединения 55
4.1. Определение на основе использования метода электронной спектрофотометрии 55
4.1.1. Определение по поглощению в среде этанола 55
4.1.2. Определение по поглощению в среде ацетонитрила 58
4.2.2. Обращённофазовый вариант хроматографирования 63
Глава 5. Моделирование схем очистки 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана и оценка их эффективности 67
5.1. Применение очистки методами сорбции и особенности хроматографического поведения 2-диметиламино-1,3-бис (фенилсульфонилтио)пропана 67
5.1.1. Макроколоночная нормальнофазовая хроматография 67
5.1.2. Тонкослойная нормальнофазовая и обращённо фазовая хроматография 72
5.2. Оценка степени очистки извлечений из различных биологических матриц в контрольных опытах 74
5.2.1. Оценка степени очистки методом жидкостной колоночной хроматографии 74
5.2.2. Оценка степени очистки извлечений методом ТСХ 77
Глава 6. Определение 2-диметиламино-1,3-бис (фенилсульфонилтио)пропана в биологическом материале 80
6.1. Изолирование рассматриваемого аналита из матриц биологической природы различными жидкими изолирующими агентами в сравнительном аспекте 80
6.2. Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в матрицах биологической природы при изолировании толуолом 83
6.2.1. Исследования по поиску оптимальных условий изолирования исследуемого аналита 83
6.2.2. Предлагаемая методика определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях внутренних органов 88
6.3. Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в матрицах биологической природы при изолировании этилацетатом 92
6.3.1. Исследования по поиску оптимальных условий изолирования 92
6.3.2. Предлагаемые методики определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях внутренних органов и крови 96
6.4. Валидация методик определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в биологических с применением метода нормальнофазовой ВЭЖХ 102
6.4.1. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани печени 102
6.4.2. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в ткани гнилостно изменённой печени 110
6.4.3. Валидационная оценка методики определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в крови 119
Глава 7. Распределение 2-диметиламино-1,3-бис (фенилсульфонилтио)пропана в организме теплокровных и устойчивость исследуемого аналита в трупном материале 129
7.1. Характер распределения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в различных органах и биожидкостях 129
7.2. Устойчивость исследуемого вещества в смесях с гнилостно разлагающимися тканями внутренних органов 132
Выводы по главе 7 134
Схематический ход исследования биологических вещественных доказательств на наличие 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана 136
Список литературы 143
- Токсичность и особенности токсического действия
- Определение по поглощению в среде ацетонитрила
- Предлагаемые методики определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях внутренних органов и крови
- Характер распределения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в различных органах и биожидкостях
Токсичность и особенности токсического действия
2-ДМА-1,3-БФСТП токсичен для теплокровных. Его средняя летальная доза при введении мышам в желудок от 484 до 516 мг/кг, крысам от 1105 до 1120 мг/кг, кроликам 2000 мг/кг. Он слабо раздражает глаза, не раздражает кожу кроликов, его кумулятивные свойства слабо выражены. Приводятся сведения, согласно которым LD50 при введении 2-ДМА-1,3-БФСТП через рот мышам составляет 0,3 г/кг, кроликам - 3,2 г/кг, крысам - 0,98 г/кг. Средняя летальная доза этого вещества при введении птицам от 0,06 до 0,1027 г/кг. Соединение малотоксично для ракообразных, высокотоксично для тутового шелкопряда [23, 53, 55, 162, 163, 175].
Stankovic S., Kostic М., Sivcev I. et al. [160] указывают, что ЛД50 2-ДМА-1,3-БФСТП для взрослых особей колорадского жука, определённая вблизи различных населённых пунктов Сербии, составляла 0,04 до 25,81 мкг на одно животное. По данным Peric I., Milosevski N., Kljajic P. [153] ЛД50 рассматриваемого соединения для взрослых особей колорадского жука от 0,02 до 14,51 мкг на насекомое.
О развитии резистентности у популяций колорадского жука и других вредителей сельского хозяйства к 2-ДМА-1,3-БФСТП и другим аналогам нереистоксина сообщают как отечественные, так и зарубежные авторы Chakraborty К. [92, 165, 168].
Рассматриваемое соединение потенциально опасно для медоносных пчёл. ЛД50 2-ДМА-1,3-БФСТП для пчел - 14,8 мкг/особь (24 ч). Инсектицидная активность малых доз данного вещества при относительно растянутом во времени их поступлении в организм медоносной пчелы с кормом существенно выше, чем однократное суммарное введение таких же или даже больших доз [22, 67].
Допустимая суточная доза 2-ДМА-1,3-БФСТП для человека 0,03 мг/кг, ПДК в воде водоемов 0,01 мг/дм3 (общ.), ОДК в почве 0,06 мг/кг, ОБУВ в атмосферном воздухе 0,01 мг/м3, ОБУВ в воздухе рабочей зоны 0,5 мг/м3.
Препараты 2-ДМА-1,3-БФСТП, как правило, относятся к третьему классу опасности для человека и для пчёл. Максимально допустимый уровень содержания (в мг/кг) данного соединения составляет: в зерне хлебных злаков - 0,05, в картофеле - 0,04, в баклажанах - 0,04, в хмеле - 0,04, в томатах - 0,04 [7, 29].
2-ДМА-1,3-БФСТП, как и ряд других веществ из группы соединений подобных нереистоксину, является блокатором N-ацетилхолинорецепторов [73, 101, 111, 123, 125].
В организмах насекомых он блокирует чувствительные к никотину холинорецепторы постсинаптической мембраны, отчего импульс, передаваемый с участием ацетилхолина, не воспринимается, и насекомые перестают реагировать на внешние сигналы, впадают в состояние коллапса, прострацию, теряют интерес к еде, их тела размягчаются и они не могут держаться на поверхности растений [19, 54, 143].
В работе Casida J. Е., Durkin К. А. [90] сообщается, что у насекомых и млекопитающих АХЭ-торможение и накопление ацетилхолина приводит к возбуждению и смерти.
2-ДМА-1,3-БФСТП, действуя на никотиновые рецепторы ацетилхолина, вызывает кратковременное снижение возбудимости нейронов. Такой же эффект наблюдался со стороны сна и поведенческих реакций. Измеряемые параметры, как правило, приходят в норму в течение недели [134, 184].
Эксперименты in vitro показывают, что 2-ДМА-1,3-БФСТП может изменять свойства активности нейронной сети и нейротрансмиссии в неокортексе мозга крыс [119].
В опытах на срезах головного мозга крыс установлено, что 2-ДМА-1,3-БФСТП не влияет на образование кинуреновой кислоты (антагониста широкого спектра ионотропных глутаматных рецепторов) в коре головного мозга [104].
2-ДМА-1,3-БФСТП и картап при исследовании инсектицидной активности пестицидов часто используются в качестве инсектицидов сравнения [79, 95, 182]. Приводятся данные о новых приёмах (in vitro) биомониторинга потенциальных нейротоксические эффектов агрохимикатов и природных токсинов, в частности, 2-ДМА-1,3-БФСТП, в пищевых цепях [80].
2-ДМА-1,3-БФСТП уменьшает возбудимость нейронов у моллюсков и в центральной нервной системе млекопитающих [83, 93].
Установлено, что близкий по структуре к 2-ДМА-1,3-БФСТП тиоциклам не вызывает в опытах in vitro структурных аберраций хромосом в лимфоцитах человека, но оказывает влияние на пролиферацию лимфоцитов человека [91].
2-ДМА-1,3-БФСТП влияет на микроорганизмы [171], отмечено его бактерицидное действие [144].
В опытах на крысах показано, что 2-ДМА-1,3-БФСТП оказывает определённое влияние на нервную систему млекопитающих, но это влияние, как правило, носит мягкий и временный характер [184].
Считается, что 2-ДМА-1,3-БФСТП не обладает фитотоксичностью [8, 23], хотя есть данные о влиянии инсектицидов на процессы метаболизма в листьях трансгенного риса и его дикого аналога [74].
Описано изучение токсического действия 2-ДМА-1,3-БФСТП, с использованием тест-водоросли Scenedesmus subspicatus [88].
LD50 для крыс близких по структуре к 2-ДМА-1,3-БФСТП картапа и тиоциклама при их пероральном введении составляет соответственно 325-345 и 310 мг/кг [103].
Известно, что картап в виде смачивающегося порошка способен в эксперименте вызывать тяжёлые отравления и смерть у кроликов [166].
Метаболит 2-ДМА-1,3-БФСТП нереистоксин достаточно токсичен для теплокровных организмов.
LD50 нереистоксина в мг/кг составляет для мышей при пероральном введении 118, при внутривенном 30, при подкожном 1000 [33]. По другим данным LD50 данного вещества для позвоночных 1,8 мг/кг [24]. Метаболит 2-ДМА-1,3-БФСТП нереистоксин, также, как и близкое по структуре биологически активное соединение картап обладают нейротоксичностью и относятся к прямым блокаторам ионных каналов никотиновых рецепторов насекомых 2-ДМА-1,3-БФСТП [129].
Нереистоксин поражает нервную систему насекомых. Экспериментальное введение нереистоксина в воду может приводить к гибели рыб. Концентрации нереистоксина в области 10 7 моль/л способны к угнетению генерируемых ацетилхолином ионных токов, а его концентрации в области 10 4 моль/л благоприятствует деполяризации мембран нервных клеток, сопровождающейся угнетением пиковых значений токов Na+ и К+. Возможно, что данный метаболит 2-ДМА-1,3-БФСТП обеспечивают блокаду ионного канала или иного потенциалуправляемого составляющего холинорецепторного комплекса [34, 122].
Нереистоксин, как и ряд его предшественников, одним из которых является 2-ДМА-1,3-БФСТП, относят к ингибиторам синтеза нуклеиновых кислот [147].
Показано, что нереистоксин способен оказывать двоякое влияние на холинорецепторы; в низких концентрациях действуя как частичный агонист, а при высоких концентрациях являясь антагонистом [189].
Имеются другие данные об изучении токсического действия 2-ДМА-1,3-БФСТП и иных прекурсоров нереистоксина [118, 158, 162, 163, 183].
При пероральном введении козлятам нубийских коз близкого по структуре к 2-ДМА-1,3-БФСТП гидрооксалата тиоциклама наблюдали обильное пенистое слюнотечение, боли в животе, дрожь мышц головы, поднятый хвост, пошатывание, неадекватные движения, судороги, принятие лежачего положения. Смерть наступала в период от 15 мин до 13 дней с момента введения вещества. Патологоанатомические признаки включали сатолитозис и незначительный глиоз в больших полушариях головного мозга и мозжечка, легких, эмфизему легких и отек, дряблость сердца, разбросанные очаги воспалительных клеток, проникающие в ткани печени и желудочно кишечного тракта, незначительную почечную канальцевую дилатацию и некроз. В сыворотке крови снижалось содержание глюкозы [75].
Определение по поглощению в среде ацетонитрила
Характеристика линейности предлагаемой методики.
Градуировочная модель
Вначале выполняли действия по подготовке серии растворов в элюенте (так называемая градуировочная серия) с различным содержанием 2-ДМА-1,3-БФСТП.
Для этого в каждом аналитическом цикле в ряд стеклянных мерных колб (внутренний объём 25 мл) помещали 0,25; 0,5; 1,0, 2,0; 3,5, 5,0, 7,0, 8,0, 10,0 мл раствора 2-ДМА-1,3-БФСТП в системе органических жидкостей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) 0,05%-ной концентрации и прибавляли в каждую колбу систему гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) до отметки 25 мл. Таким образом, содержание 2-ДМА-1,3-БФСТП в приготовленном ряду градуировочных разведений составляло соответственно 5, 10, 20, 40, 70, 100, 140, 160 и 200 мкг в мл. Каждый раствор 2-ДМА-1,3-БФСТП в элюенте, входящий в градуировочную серию, подвергали хроматографированию, вводя часть его (8 мкл) в хроматограф. При этом в составе вводимой пробы в хроматограф попадало соответственно 0,04, 0,08, 0,16, 0,32, 0,56, 0,80, 1,12, 1,28 и 1,6 мкг 2-ДМА-1,3-БФСТП. Хроматографировали в колонке (64x2 мм) с сорбентом «Силасорб 600» (элюент - гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1), его скорость - 100 мкл/мин). Регистрировали сигнал УФ-детектора в области 256 нм в масштабе 0,8 ед.о.п. при времени измерения 0,6 сек.
Наблюдаемый на хроматограмме пик (tR=6,35 мин) соответствовал 2-ДМА-1,3-БФСТП.
Для достижения задачи построения градуировочной модели брали результаты 5 параллельных измерений каждого заданного уровня концентрации из 5 разных аналитических циклов. По результатам выполненных измерений получали ряд хроматографических пиков в каждом аналитическом цикле, соответствующих градуировочным образцам. Рассчитывали величины площадей каждого из них.
Осуществляли расчёт величин тангенса угла наклона, построенного градуировочного графика (линии регрессии) (к), его свободного члена (Ь) и коэффициента регрессии (г) в каждом цикле и вычисляли средние значения. Рассчитанные таким образом значения к и b составили соответственно 2,58489 (стандартное отклонение 0,02946) и 0,02872 (стандартное отклонение 0,05243), значение г=0,99985. Отсюда уравнение градуировочного графика выглядит следующим образом: S=2,58489-C+0,02872, (переменной S обозначена площадь пика; переменной С - содержание аналита (мкг) в элюируемой пробе).
Градуировочный график изображён на рис. 7.
Характеристика правильности и одновременно сходимости Осуществляли по 6 определений для выбранных низкой (0,16 мкг), средней (0,80 мкг) и высокой (1,6 мкг) концентраций аналита в элюируемой
Далее действовали по методике, использованной для разработки градуировочной модели.
Данные, характеризующие правильность и сходимость методики, сведены в табл. 9.
Как видно, для выбранных низкой, средней и высокой концентраций открываемость (в %) составляет соответственно 100,15±1,362, 100,11±1,1984 и 99,96±1,1115, а относительное стандартное отклонение (Sr, %) соответственно 1,2962, 1,1409, 1,0598, что определяет приемлемость методики по критериям правильности и сходимости.
Характеристика промежуточной воспроизводимости
Получали результаты для трёх аналитических циклов с суточным интервалом времени между ними.
Осуществляли по 6 определений для выбранной средней (0,80 мкг в элюируемой пробе) концентрации аналита.
Далее действовали по методике, использованной для разработки градуировочной модели.
Данные, характеризующие промежуточную воспроизводимость методики, сведены в табл. 10.
Как видно, для выбранной средней концентрации относительное стандартное отклонение (Sr, %) для трёх аналитических циклов 1,2056, 1,1725, 1,1911, что определяет приемлемость методики по критерию промежуточной воспроизводимости.
В дальнейшем при количественных определениях 2-ДМА-1,3- БФСТП его точную навеску (-2,5-10 2 г) растворяли в 5 мл диоксана, 1 мл пропанола 62 и 15 мл гексана в стеклянной мерной колбе (внутренний объём 25 мл), доводили смесью гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) до метки, разбавляли раствор (2,5 мл до 25 мл) смесью гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) в такой же мерной колбе.
Последующие действия соответствовали схеме, приводимой выше для построения и расчёта уравнения линии регрессии (градуировочного графика). Количество 2-ДМА-1,3-БФСТП в элюируемой пробе определяли по уравнению градуировочного графика и пересчитывали на исходную массу аналита.
Разработанная методика относительно проста и селективна по отношению к анализируемому соединению.
Предлагаемые методики определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в тканях внутренних органов и крови
Изолирование
А. Изолирование из плотной биоматрицы (печень без следов гнилостных изменений)
Анализируемая диспергированная биоткань или контрольный образец биоматрицы (масса 25 г) обрабатывались этилацетатом, количество которого (по массе) (50 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 3/4 часа, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут). По окончании данного этапа этилацетатное извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили настаивание в вышеописанном режиме. Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в конической стеклянной колбе внутренним объёмом 200 мл в одно общее и в дальнейшем очищали от остатков воды, механических частиц и некоторых молекулярных форм эндогенных компонентов биоматрицы путём пропускания сквозь безводный кристаллический сульфат натрия, сформированный в виде столба высотой 10-15 мм в стеклянном круглом фильтре ФКП диаметром 40 мм. Слой очищающего компонента (сульфата натрия) подвергали последующей промывке порцией изолирующего аналит агента (этилацетата) массой 20 г.
Первый (жидкая часть извлечения) и второй (промывная жидкость) этилацетатные фильтраты смешивали в чашке для выпаривания в одно общее и полностью удаляли растворитель при 18-22С в токе воздуха.
Б. Изолирование из плотной биоматрицы (печень, подвергшаяся гнилостным изменениям)
Анализируемую биоткань или контрольный образец биоматрицы (масса 25 г) обрабатывали этилацетатом, количество которого (по массе) (50 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы и в дальнейшем поступали согласно последовательности действий, определённой для изолирования из печени без следов гнилостных изменений.
В. Изолирование из жидкой биоматрицы (кровь человека)
Определённое количество анализируемой биоткани или контрольного образца биоматрицы (масса 25 г) обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) (50 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 3/4 часа, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут). По окончании данного этапа этилацетатное извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы. Жидкое извлечение отделяли от твердых фрагментов биоматрицы, применяя фильтрование через смоченный этилацетатом бумажный фильтр, и повторно проводили настаивание в вышеописанном режиме. Фильтр и остаток из плотных частиц на фильтре подвергали последующей промывке порцией изолирующего аналит агента (этилацетата) массой 20 г [30].
Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, а также промывную жидкость смешивали в конической стеклянной колбе внутренним объёмом 200 мл в одно общее и в дальнейшем поступали согласно последовательности действий, определённой для изолирования из печени без следов гнилостных изменений.
Схема очистки извлеченного аналита в макроколонке сорбента
Остаток, образовавшийся после удаления органического растворителя из общего извлечения, обрабатывали при энергичном перемешивании 4 мл трихлорметана (хлороформа), предполагая полное растворение аналита.
Часть образовавшегося таким образом хлороформного раствора (объёмом 2 мл) тщательно перемешивали с 1 г гидроксилированного сорбента (силикагеля типа L с средним размером частиц от 40 до 100 мкм) в чашке для выпаривания вместимостью от 50 до 100 мл и добивались как можно полного испарения (до исчезновения запаха) растворителя из данной смеси, помещая чашку в ток воздуха с температурой 18-22С.
В выполненную из стекла хроматографическую колонку высотой 490 и диаметром 11 мм с 9 г силикагеля L (размер частиц от 40 до 100 мкм) добавляли 1 г этого же сорбента, в котором находился аналит, добавленный в виде 2 мл хлороформного раствора.
В дальнейшем, проводя элюирование, через слой сорбента в подготовленной, как указано выше, колонке пропускали малополярный элюент гексан до момента выхода 20 мл элюата. Следующий этап элюирования состоял в том, что, удалив из колонки малополярный гексан, находящийся над слоем неподвижной фазы, в неё добавляли среднеполярный многокомпонентный элюент (смесь органических жидкостей, включающую гексан, диоксан и пропанол-2, взятые в объёмных отношениях 8:3:0,6) и элюировали этой системой. Вытекающий элюат в процессе его сбора собирали в отдельные градуированные пробирки небольшими (по 2 мл) фракциями. Фракции №№ 11-14 объединяли в выпарительной чашке и удаляли элюент в токе воздуха при 18-22С. Остаток обрабатывали 5 мл диоксана (исходный диоксановый раствор).
В выпарительную чашку № 1 помещали 0,2 мл «исходного диоксанового раствора» (при малых концентрациях аналита этот объём можно увеличить до 1,5 мл). В чашки № 2 и № 3 помещали соответственно 1,0 мл и 2 мл того же «исходного» раствора. Растворитель удаляли из чашек в токе воздуха при 18-22С.
Идентификация по хроматографической активности в тонком слое сорбента
Остаток в чашке № 1 3-4 раза обрабатывали 0,2-0,4 мл хлороформа, каждый раз нанося раствор на стартовую линию пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ. Рядом наносили от 5 до 10 мкл 0,04%-ого этанольного раствора стандарта рассматриваемого аналита. Осуществляли хроматографический процесс с применением элюирующей системы гексан-диоксан-пропанол-2-ацетон (8:3:0,8:0,8).
Хроматограммы исследовали в ультрафиолетовом свете (излучение в области 254 нм), рассматриваемое соединение проявлялось как темно-лиловое (возможно с коричневатым оттенком) пятно на светящемся фоне пластины. 2-ДМА-1,3-БФСТП определяли по значению критерия абсолютной хроматографической подвижности (Ri) (раздел 3.1). Идентификация по характеру поглощения УФ-излучения и оценка количественного содержания
Проведя идентификацию по характеру хроматографического поведения в тонком слое сорбента, пятно аналита элюировали из сорбента 95% этанолом 1/4 часа и изучали поглощение элюата в диапазоне 200-360 нм. Аналит идентифицировали на основе типичной формы УФ-спектральной кривой, а также по расположению точек экстремумов (раздел 3.3). Регистрировали оптическую плотность при 255 нм и, применяя уравнение линии регрессии (градуировочного графика) (описано в разделе 3.1), находили количество элюированного 2-ДМА-1,3-БФСТП в единицах массы и в % к внесённой в биоматрицу навески аналита.
Результаты выполненных определений аналита в плотных биоматрицах (в данном случае - ткань печени и ткань гнилостно изменённой печени) и жидкой биоматрице (в данном случае - кровь человека) на основе применения УФ-спектрофотометрии составляют табл. 20-22.
Совокупность данных этих таблиц позволяет отметить достаточно высокие аналитические характеристики предлагаемых методик.
Характер распределения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в различных органах и биожидкостях
Для определения органов или биожидкостей - возможных объектов исследования в рамках проведения судебно-химических экспертиз случаев отравления субстанцией или препаратами 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана (2-ДМА-1,3-БФСТП) - проанализирован характер распределения данного аналита у теплокровных.
Объектом поведённого исследования являлась субстанция 2-ДМА-1,3-БФСТП, содержащая более чем 97% действующего начала (стандартный образец предприятия 342-034-2003).
В качестве модели теплокровных организмов, подвергшихся отравляющему воздействию анализируемого вещества - объекта исследования, рассмотрены крысы.
В процессе исследования 25 крысам, объединённым в пять исследуемых групп по пять животных в каждой, вводили при помощи зонда (внутренний диаметр 2 мм) в желудок две LD50 2-ДМА-1,3-БФСТП (2240 мг субстанции на один кг живой массы особи). После гибели крыс производили вскрытие трупов. Одинаковые биологические матрицы (органы, их содержимое и биожидкости), взятые от трупов животных, относящихся к определённой группе, объединяли и осуществляли действия по обнаружению в них 2-ДМА-1,3-БФСТП.
Наряду с этим анализировали биологические жидкости, органы и их содержимое, отобранные из трупов особей группы контроля, состоящей из пяти подопытных животных [39, 40, 58].
Порядок изолирования аналита из различных биоматриц. Определённое количество анализируемых биожидкости или биоткани обрабатывали порцией этилацетата, количество которого (по массе) в два раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Такая смесь оставлялась на 45 минут, подвергаясь перемешиванию с определённой периодичностью (1 раз в 10-12 минут). По окончании данного этапа этилацетатное извлечение отделяли от плотных частиц биологической матрицы декантацией и повторно проводили настаивание в вышеописанном режиме. Извлечения, полученные после первого и второго этапов настаивания, смешивали в выпарительной чашке и удаляли растворитель в токе воздуха при 18-22С.
Очистка аналита. Остаток, образовавшийся после удаления растворителя, обрабатывали 2 мл смеси гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6), раствор переносили в хроматографическую колонку (490x11 мм) с 10 г гидроксилированного сорбента (силикагеля типа L с средним размером частиц от 40 до 100 мкм). Элюировали системой гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6). Вытекающий элюат в процессе его сбора собирали в отдельные градуированные пробирки небольшими (по 2 мл) фракциями. Фракции №№ 9-11 объединяли в выпарительной чашке и удаляли элюент в токе воздуха с температурой 18-22С. Образовавшийся после удаления элюента остаток подвергали обработке 5 мл этилацетата, получая так исходный этилацетатный раствор.
Идентификация по характеру хроматографичес кого поведения в тонком слое сорбента. На стартовую линию стандартной пластины «Силуфол» с УФ-индикатором наносили 0,4 мл исходного ацетонитрильного раствора. Рядом наносили 5-10 мкл 0,04% этанольного раствора стандарта рассматриваемого аналита.
Осуществляли хроматографический процесс с применением элюирующей системы гексан-диоксан-пропанол-2 (8:4:0,8). В УФ-свете вещество на хроматограммах проявлялось как темно-лиловое на светящемся фоне. 2-ДМА-1,3-БФСТП определяли по значению критерия абсолютной хроматографической подвижности (Rf).
Идентификация по характеру поглощения ультрафиолетового излучения и оценка количест венного содержания. Проведя идентификацию по характеру хроматографического поведения 2-ДМА-1,3-БФСТП в тонком слое сорбента, анализируемое соединение элюировали из сорбента ацетонитрилом в течение % часа и изучали поглощение элюата в диапазоне 200-360 нм. Аналит идентифицировали по форме спектральной линии и положению максимумов. По оптической плотности при 258 нм находили количество аналита, применяя уравнение градуировочного графика.
В серии опытов на группе контрольных крыс (п=5) получали извлечения из крови и тканей внутренних органов трупов. Их анализировали по вышеописанной схеме. После очистки извлечений, полученных из контрольных животных, в колонке, наполненной силикагелем, и хроматографирования методом ТСХ получали ацетонитрильные элюаты из хроматограмм и изучали поглощение элюатов в области кварцевого ультрафиолета.
Данные определения 2-ДМА-1,3-БФСТП в крови и органах исследуемых животных представлены в табл. 32.
Проведённые исследования показывают, что при пероральном введении отравляющего агента наибольшие его количества обнаруживаются в желудке, тонком кишечнике и сердце исследуемых животных. В несколько меньшем количестве 2-ДМА-1,3-БФСТП присутствует в селезенке, почках и печени.