Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 12
1.1. Анализ фармацевтического рынка гиполипидемических и гипохолестеринемических лекарственных средств 12
1.2. Масла как источники фитостеролов, обладающих гиполипидемическими свойствами 20
1.3. Бетулин и его производные как потенциальные лекарственные вещества 23
1.3.1. Биологическая активность производных бетулина 23
1.3.2. Синтетические подходы к препаративным методикам получения производных бетулина с предполагаемым гиполипидемическим действием 25
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Объекты, материалы и методы исследования 40
2.2. Выделение и идентификация бетулина 42
2.3. Синтез бетулонового альдегида (образец сравнения для ВЭЖХ) 43
2.4. Методика синтеза фосфата бетулина 44
2.5. Методика синтеза моно- и дисукцинатов бетулина 45
2.6. Методика синтеза диацетата бетулина 46
2.7. Синтез бетулоновой кислоты 46
2.8. Методика определения карбонильного числа 47
2.9. Анализ масла семян тыквы 48
2.10. Определение неорганических примесей методом ААС 49
2.11. Исследование гиполипидемической и гипохолестеринемической активностей предлагаемого препарата 49
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 52
3.1. Расчет фармакологической активности производных бетулина в программе
3.2. Фосфатные производные бетулина с улучшенной гидрофильностью 55
3.2.1. Синтез и свойства фосфатов бетулина 56
3.3. Синтез бетулоновой кислоты и эфиров бетулина 74
3.3.1. Синтез бетулоновой кислоты как потенциальной фармацевтической субстанции в присутствии ГПК 74
3.3.2. Синтез диацетата бетулина 82
3.3.3. Синтез дисукцината бетулина 88
3.4. Идентификация и количественное определение потенциальных фармацевтических субстанций 95
3.4.1. Методики идентификации и количественного определения бетулоновой кислоты и возможных примесей 95
3.4.2. Методики установления подлинности и количественного определения фармацевтической субстанции – диацетата бетулина 101
3.4.3. Методики идентификации и количественного определения дисукцината бетулина 103
ГЛАВА 4. Новые гиполипидемические средства на основе эфиров бетулина и бетулоновой кислоты в масле семян тыквы 107
4.1. Обоснование состава препарата, обладающего гиполипидемическим и гипохолестеринемическим действием 107
4.2. Исследование гипохолестеринемического и гиполипидемического действия препарата в эксперименте на крысах 112
Заключение 117
Список литературы 119
- Бетулин и его производные как потенциальные лекарственные вещества
- Методика синтеза диацетата бетулина
- Синтез бетулоновой кислоты как потенциальной фармацевтической субстанции в присутствии ГПК
- Исследование гипохолестеринемического и гиполипидемического действия препарата в эксперименте на крысах
Бетулин и его производные как потенциальные лекарственные вещества
Масло семян тыквы Cucurbita Pepo (МСТ) является одним из источников биологически активных веществ, способных взаимодействовать с бетулоновой кислотой и эфирами бетулина. Его состав обогащен комплексом каротиноидов [5, 60, 70], токоферолов, ненасыщенных кислот и фитостеролов [38, 58, 73, 84].
Термин «фитостеролы» объединяет в себе несколько групп веществ, основными из которых являются стеролы и станолы растительного происхождения. Они являются компонентами растительных масел и существуют в свободной или конъюгированной форме. В МСТ содержатся свободные или связанные с белковыми веществами (сложные комплексы) фитостеролы, общее содержание которых колеблется от 0,03 до 1,0 % (1000 мг%). [65]
Все фитостеролы представляют собой 4-дез метильные стеролы и станолы, которые содержат гидроксильные группы в 3-ем положении. Таким образом, структура фитостеролов сходна с холестеролом. Однако, в боковой цепи молекулы имеются структурные различия между холестеролом и растительными фитостеролами: у растительных стеролов имеется дополнительно метильная группа (кампестерол), этильная группа (ситостерол) или двойная связь (стигмастерол). [64] Функции, которые выполняют холестерол и фитостеролы в растительных и животных клетках, аналогичны. Встраиваясь в клеточные мембраны, они обеспечивают их структурную целостность, однако, фитостеролы попадают в животный организм только с пищей, так как не могут быть синтезированы в нем.
К основным представителям фитостеролов масла семян тыквы относятся, главным образом, ситостеролы с одной двойной связью (-, -, -изомеры), брассикастерол (С28Н46О) с двумя двойными связями и кампестерол (С28Н48О) с одной двойной связью. [74] Основным ситостеролом тыквенного масла является -ситостерол (Рисунок 1.1.) В лекарственных препартах и пищевых добавках в качесте основного источника фитостеролов используют не только овощные масла, но и талловое масло сосен, которое является побочным продуктом лесной и деревообрабатывающей промышленности. В технологии производства пищевых добавок стеролы и фитостеролы могут быть гидрированы до станолов (преимущественно ситостанолы). Ситостеролы и ситостанолы добавляют в различные пищевые продукты, такие как молоко, масло, маргарин и др. [105]
Высокое содержание ненасыщенных кислот (до 80 %) в сочетании с фитостеролами открывает широкие возможности для лечения липид-ассоциированных заболеваний [65], таких как атеросклероз (Таблица 1.3.). Благодаря подобию химических структур холестерола и -ситостерола, последний вытесняет холестерол при взаимодействии с ЛПНП в плазме крови, действуя как антиметаболит, что обуславливает его гипохолестеринемическое действие. А также, образование стабильных комплексов -ситостерола с холестеролом затрудняет их всасывание из желудочно-кишечного тракта. [64, 83, 101] Таблица 1.3.
Фибраты: фенофибрат -снижение триглицеридов;- увеличение ЛПВП;- увеличение уровня общего холестерола в плазме 50%;- уменьшение ЛПНП Снижение ЛПНП / ++(статины, фитостеролы,фибраты)
Статины: аторвастатин - снижение ЛПНП на 10%;- сокращение дозы статина в2 раза;- снижение токсическихэффектов Снижение ЛПНП / +++(статины (39%), фитостеролы(13%), холестирамин (15%))
Омега 3 - жирныекислоты:-линоленоваякислота (18:3П_3) - снижение уровня ЛПНП;- снижение концентрациитриглицеридов в сывороткекрови;- снижение количествамаркеров воспаления всыворотке крови Снижение ЛПНП / ++(статины, фитостеролы,омега 3 – жирные кислоты)
Никотиновая кислота (Ниацин) незначительное снижениеуровня ЛПНП по сравнениюс ниацином Снижение ЛПНП / +(статины, фитостеролы,ниацин)
Холестирамин синергизм действия отсутствует Снижение ЛПНП / +++(статины (39%), фитостеролы(13%), холестирамин (15%))
Эзетимиб незначительное снижениеуровня ЛПНП по сравнениюс эзетимибом Снижение ЛПНП / ++(статины, фитостеролы,холестирамин) 1.3. Бетулин и его производные как потенциальные лекарственные вещества
Производные бетулина обладают широким спектром фармакологического действия, к которым можно отнести противовоспалительное, гиполипидемическое, антиоксидантное, гепатопротекторное и другие [3, 71]. По своей структуре бетулин и его производные напоминают стероидные вещества [42], однако, сохраняя комплекс ценных фармакологических свойств, они лишены ряда побочных действий. В системе желудочно-кишечного тракта функции бетулоновой кислоты и эфиров бетулина близки к действию желчных кислот, механизм которых включает коллоидно-химические эффекты, в том числе мицеллирование, диспергирование, образование комплексов с липидами.
В литературе основное внимание уделяется противоопухолевому и противовирусному действию производных бетулина. [36, 47, 75, 94]
Доказано, что соединения лупанового ряда обладают противоопухолевой активностью, причем наиболее сильное действие оказывает бетулиновая кислота, которая признана эффективным ингибитором роста раковых клеток [47, 85].
Бетулин, бетулиновая и бетулоновая кислоты интересны для медицины как основы для разработки новых противовирусных лекарственных средств, проявляющих ингибирующее действие, например, в отношении вируса простого герпеса типа I и вируса гриппа типа А, которые сочетают также иммуностимулирующее действие. Известно, что аллобетулин оказывает умеренно-выраженное действие в отношении вируса гриппа типа В. [50, 52, 61]
Также, много исследований проведено по доказательству гепатопротекторных свойств бетулина и его производных. Показано, что в эксперименте на культуре раковых клеток печени человека бетулин практически полностью подавляет цитотоксическое действие CdCl2 в концентрации менее 0.1 мкг/мл (2.10-7М). Гепатопротекторная активность бетулина обусловлено его воздействием на внутриклеточные мишени. [68]
Данные, опубликованные индийскими исследователями в 2000 году, представляют особый интерес. Они экспериментально доказали эффективность бетулина и лупеола в предотвращении образования камней в мочевом пузыре крыс. Механизм действия обоих исследованных тритерпеноида заключается в подавлении образования оксалатных камней и повреждения защитной антиокислительной системы, чем они минимизируют кристалл-индуцирующие перекисные изменения. [43]
Как и описанные ранее бетулин и его производные, диацетат бетулина также обладает противоопухолевой и противовирусной активностью. [37, 94] Доказано, что моно- и диацетат, дисукцинат бетулина проявляют гиполипидемические и желчегонные свойства, а также обладают гепатопротекторной активностью. [3, 45, 47, 51] Причем достоверно известно, что фармакологическая активность эфиров бетулина в несколько раз выше активности своего предшественника. Антиоксидантные свойства диацетата бетулина объясняются его влиянием на количество малонового диальдегида, на активность каталазы и супероксиддисмутазы в печени и эритроцитах, что было доказано в эксперименте на крысах. [12] Авторы полагают, что диацетат бетулина выступает в роли ловушки активных форм кислорода, стимулирует синтез или влияет на активность антиоксидантных ферментов.
Таким образом, следует отметить, что наряду с данными по противоопухолевой и противовирусной активности бетулина и его производных, исследования гиполипидемического и гепатопротекторного действия представлены в литературе очень скудно. Однако, в связи с проблемой роста липид-ассоциированных заболеваний в последние годы, изучение таких свойств фармацевтических субстанций представляет большой интерес.
Методика синтеза диацетата бетулина
Несмотря на многочисленные исследования в области синтеза эфиров бетулина до сих пор в литературе отсутствуют препаративные способы получения эфиров фосфорной кислоты. В патенте США (Красутский П.А.) описан способ получения натриевых солей фосфорной кислоты, предполагающий гидролиз дифосфодихлорида бетулина водой до эфиров фосфорной кислоты бетулина по положению 3 и 28 с последующим воздействием бикарбоната натрия для перевода в динатриевые соли. [88] К сожалению, в литературе, как и в вышеупомянутом патенте, отсутствуют какие-либо данные по синтезу и свойствам как дифосфодихлорида бетулина, так и фосфатов бетулина.
Также известен способ получения фосфатов бетулина по патенту А.П. Каплуна и др. [25], заключающийся в обработке бетулина хлорокисью фосфора и трихлоридом фосфора при 90-95С в течение 24 часов в атмосфере аргона с последующей сложной модификацией. В патенте приведена единственная характеристика дифосфата бетулина (IB): 1Н-ЯМР (CDCl3-CD3OD, 1:1, , мд): 0,68-1,99 (42Н, 6СН3, (СН2)n.м.), 3,61 (1Н=CHOP, т.), 3,90 (2Н, СН2ОР, д.д.), 4,55, 4,70 (2Н, СН2=С, 2с.).
Наиболее приемлемыми способами синтеза эфиров фосфорной кислоты тритерпеноидов и их солей являются методики получения эфиров фосфорной кислоты стероидов, например, бетаметазона, преднизолона, дексаметазона натрия фосфатов. [87] Большинство методик предполагает воздействие пирофосфорилтетрахлорида или хлорокиси фосфора в органическом растворителе в присутствии акцептора HCl (пиридина, триэтиламина и др.) при низкой температуре с последующим гидролизом водой и переводом эфиров фосфорной кислоты в соли.
Трудностью получения дифосфатов бетулина и их солей является низкая селективность реакции образования дифосфодихлоридов и обратимость реакции гидролитического замещения хлор-ионов в фосфорильной группировке на гидроксильную группу в процессе гидролиза.
В целом, реакция этерификации бетулина оксихлоридом фосфора представлена ниже (схема 3.1). 2" I
Выход 3,28-О-дифосфодихлорида бетулина зависит от условий протекания реакции: температуры, времени, соотношения между компонентами и акцептора хлористоводородной кислоты.
В качестве акцепторов HCl нами были использованы следующие амины: дибутиламин, триэтиламин, пиридин. Синтез проводился в двух температурных режимах: от 0 до +10С и при комнатной температуре.
В качестве растворителей были опробованы дихлорметан (не смешивающийся с водой) и 1,4-диоксан (смешивающийся с водой), растворимость бетулина в которых при выбранных условиях была удовлетворительной. Следует отметить, что не всегда обеспечивалась гомогенность реакционной смеси.
В реакционной смеси с дихлорметаном после проведения реакции экстрагируется хлорокись фосфора при добавлении воды и почти полностью удаляется при дальнейшем отмывании водой неводного слоя. В ряде случаев обработку экстрактов проводили щелочными водными или спиртовыми растворами гидроксида натрия до нейтральных рН. После отмывки хлорокиси фосфора из растворов дихлорметана, растворитель удаляли на ротационном испарителе. В большинстве случаев осадки представляли собой белый порошок, в ряде случае при недостаточном удалении хлорокиси фосфора в присутствии пиридина фильтр и осадки приобретали фиолетовую окраску. При проведении реакции в смешивающемся с водой диоксане, хлорокись фосфора оставалась в водном растворе после добавления избыточного количества воды при охлаждении. Выпавший осадок непрореагировавшего бетулина и продуктов реакции отделяли фильтрованием, промывали водой или щелочными водными или спиртовыми растворами гидроксида натрия до нейтральных рН. Альтернативным способом обработки реакционной смеси в диоксане является удаление летучих продуктов (растворитель, хлорокись фосфора, хлористый водород, пиридин) на ротационном испарителе под вакуумом с последующей отмывкой продукта.
На основании литературных данных по синтезу фосфатов стеролов нами были проверены соотношения между реагентами бетулин : амин : POCl3, которые мы варьировали от 1:1:1 до 1:6:12.
Нами показано, что дибутиламин является относительно слабым акцептором HCl и реакция имеет обратимый характер, при этом процесс не зависит от температуры и времени проведения реакции. В ИК-спектре продукта реакции наряду с ожидаемым продуктом (интенсивная полоса валентных колебаний эфирной С=О связи 932 см-1, полоса валентных колебаний О-Р и О-Р Cl связи в области 550-490 см-1) наблюдались полосы, отвечающие валентным колебаниям С-О спиртовой связи (1028-1040 см-1). Сравнительный коэффициент, равный отношению интенсивности реперной полосы, отвечающей за валентные колебания циклопентанпергидрофенантренового цикла (2940 см-1), к интенсивности реперной полосы в области 500 см-1, характеризующей валентные колебания О-Р-Cl связи, должен быть близок к единице. Коэффициент J2940/J500 продуктов синтеза в дихлорметане и в диоксане в присутствии дибутиламина имел значения, существенно большие единицы. (Таблицы 3.2, 3.3) В 31Р-ЯМР – спектрах продуктов реакции фиксировались в качестве основных сигналов в области 17,5 м.д., что соответствует оксихлориду фосфора. В 1Н-ЯМР-спектрах образцов основным продуктом был исходный бетулин.
Синтез бетулоновой кислоты как потенциальной фармацевтической субстанции в присутствии ГПК
Наилучшие результаты при синтезе фосфата бетулина были получены при использовании в качестве акцептора HCl пиридина. (Таблицы 3.6, 3.7) Синтез оптимален при комнатной температуре, 6- или 12-кратном избытке хлорокиси фосфора в течение суток или более. Общие закономерности обработки реакционной смеси после синтеза были такими же, как и при проведении реакции с триэтиламином. Оптимальным является проведение реакции в диоксане и е остановка выливанием реакционной массы в большой объем ледяной воды. Реакция в диоксане протекает в течение 20-24 часов (условия опыта И-82 и И-85), увеличение времени не изменяло выход и свойства продукта (опыт Р-156 и Р-163).
В процессе выделения дихлордифосфобетулина и отмывания водой образуются фосфаты бетулина:
В 13С-ЯМР (Рисунок 3.2) спектре фосфата бетулина сигналы бетулина С28 и С3 (60 и 80 м.д. соответственно) атомов смещены на 3 м.д. в более слабое поле, что также характерно для эфиров фосфорной кислоты.
На рисунке 3.4 представлен фрагмент спектра 31Р ЯМР образца Р-156 в DMSO-d6 в присутствии Ph3P ( -6 м.д.), добавленного непосредственно перед регистрацией спектра при 30С. Остаток фосфорной кислоты при С3b бетулина проявлялся в спектре без развязки на протонах в виде дублета с = -0,4 м.д., при этом 3JH-P 8 Hz типична для СН-О-Р. Остаток фосфорной кислоты при С28 бетулина представлен в виде триплета при = +0,48 м.д., величина 3JH-P 4.6 Hz характерна для СН2-О-Р фрагмента в фосфатидовой кислоте (алкил-ацил-глицеромонофосфат), в котором фрагмент –СН2-О-Р(О)(ОН)2 проявляется сигналом с =+0,55 м.д., величина 3JH-P 6.9 Hz. [54] Синглет в области = -0,27 м.д. соответствует неорганическому фосфату. В процессе выделения продукта при отмывании осадка водой возможно образование пирофосфатов бетулина с фрагментами, представленными следующими структурами: н2о
Ранее было показана принципиальная возможность регулирования селективности окисления бетулина, имеющего три основных реакционных центра – первичная и вторичная спиртовые группы, терминальная кратная связь пентациклического фрагмента, в присутствии кислоты Льюиса Al3+ системой K2Cr2O7 – H2SO4. [79] Авторами также было установлено, что в качестве растворителя наиболее перспективна система «ацетон – вода» в массовом соотношении 6:1, позволяющая получить минимальную концентрацию примесей, а в качестве кислот Льюиса можно использовать соли алюминия, оксид алюминия и гетерополикислоты (ГПК). [11, 27, 41]
Нами проведены сопоставительные эксперименты по синтезу бетулоновой кислоты в присутствии и отсутствии солей алюминия, а также в присутствии ГПК для выявления условий получения максимально очищенного продукта.
Установлено, что одной из причин низкого выхода целевого продукта и наличия большого количества примесей является введение бетулина в виде сольватов с растворителями, а также присутствие остаточных растворителей (изопропанола, этанола, толуола). Нами предложено проводить жесткий контроль качества исходного бетулина по этому параметру и проводить его тщательную сушку при температуре 100 ± 10С в течение 8-10 часов.
Окисление K2Cr2O7 – H2SO4 в водно-ацетоновой среде в отсутствие Al3+ при комнатной температуре (n=5) обеспечивало конверсию бетулина 52±5 %, при этом выделяли бетулоновый (18±5 %) и бетулиновый (3±3 %) альдегиды, а также продукты окисления по кратной связи в положении С-20 – С-29 (28±3 %), что согласуется с данными работы. [79] Из ряда ГПК нами были выбраны фосфорно-вольфрамовая H3PW12O40 и фосфорно-молибденовая H7[P(Mo2O7)6] кислоты, поскольку известна их каталитическая активность в процессах гидратации и окисления. Так, например, окисление пероксидом водорода спиртов различного строения, катализируемого H3PW12O40, обеспечивает высокую селективность реакции. [103] Мы полагаем, что высокая селективность реакции обусловлена также способностью гетерополикислоты образовывать сложные комплексы как с растворителями, так и спиртами, улучшая гомогенность системы в целом.
Показано, что основным продуктом реакции в присутствии ГПК – H3PW12O40, H7[P(Mo2O7)6] в интервале концентраций 5.10–9 – 5.10–6 моль/л, проводящейся в течение 3 ч при комнатной температуре является, бетулоновая кислота (чистота по ВЭЖХ 95 %). (Схема 3.4.) 28CH2OH (K2Cr2O7 - H2SO4) - ГПК
Интенсивная полоса валентных колебаний С = О группы 1705 см-1 и совпадение полос валентных и других колебаний в области 1050 – 500 см-1 со стандартом характеризует выделенный продукт как бетулоновую кислоту. 13С ЯМР - спектр продукта окисления бетулина K2Cr207 ( QW бетулин =3:1) в присутствии H3PWi204o - бетулоновой кислоты Особенностью окисления бетулина K2Cr207 - H2S04 в присутствии ГПК является моментальная гомогенизация молочно-белой суспензии бетулина в ацетоне и полное растворение бетулина до образования прозрачных растворов с усилением окраски раствора, которые не зависят от порядка добавления окислителя. В УФ-спектре гомогенного раствора бетулина в ацетоне в присутствии ГПК появлялась новая интенсивная полоса в области 300 - 330 нм, характеризующая комплексообразование, в отличие от бетулина и его производных, поглощающих в области 190 - 220 нм (этанол). (Рисунок 3.7) Характер растворения и УФ-спектр практически не зависят от природы ГПК.
Исследование гипохолестеринемического и гиполипидемического действия препарата в эксперименте на крысах
Нами установлено, что основными примесями в продукте, полученном по вышеописанной методике, являются: бетулоновый альдегид, бетулин, остаточный растворитель. Идентификация примесей Для идентификации примеси бетулонового альдегида нами был синтезирован образец сравнения окислением бетулина системой K2Cr2O7 – H2SO4, импрегнированной на силикагеле в соответствии с методикой. [74]
Идентификацию неорганических примесей проводили методом атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС), а органических примесей методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). В этих условиях примеси элементов Cr, W, Mo не были обнаружены. Близость химической структуры тритерпеновых соединений делает их разделение методом ТСХ очень сложным. В таблице 3.15 приведены результаты по значениям Rf, полученные в различных условиях проведения ТСХ-анализа.
Нами проверены несколько методик ТСХ-анализа производных бетулина. В соответствии с известной методикой [78] используются пластины на основе силикагеля марки Merck GF254, а в качестве элюента гексан : этилацетат = 80:20 и дихлорметан : метанол = 98:2. Проявление осуществляют раствором сульфата церия 75 г и молибдата аммония 4г в 500 мл 10% серной кислоты. Эта методика позволяет проанализировать смесь бетулина, бетулинового и бетулонового альдегидов, бетулиновой и бетулоновой кислот. [78] Таблица 3.15.
Для анализа нами использовалось проявление ТСХ-пластин парами йода. В таблице 3.13 приведены сопоставительные результаты по ТСХ анализу в условиях методики [78] с использованием различных проявителей. Показано, что независимо от проявителя величины Rf для данной системы элюентов были близки. Следовательно, условия анализа по методике [78] могут быть использованы для идентификации примесей как в ходе мониторинга реакций окисления, так и продукта.
Альтернативной методикой ТСХ-анализа является методика авторов [80], в соответствии с которой используют алюминиевые пластинки 10 см х 20 см, покрытые слоем силикагеля (0,2 мм) 60F254. Образцы растворяют в метаноле и наносят пробу вручную полосами по 10 мм, отступая от нижнего края 10 мм. В качестве подвижной фазы используют н-гексан : этилацетат = 2:1. Проявляют с помощью 0,2% Ce(SO4)2 в 0,1 М H2SO4 (10 мин, 120С). [80] Нами в экспериментах по описанной методике использован проявитель – пары йода, при этом полученные значения Rf для изучаемых тритерпеноидов были близки: 0,47 для бетулина; 0,50 для бетулиновой кислоты; 0,75 для лупеола. В качестве эталона сравнения рекомендовано использовать -ситостерола, для которого значение Rf равно 0,56. Таким образом, методика [80] более предпочтительна для анализа бетулина, выделяемого из бересты березы, и его примеси - лупеола.
Для разделения исходного бетулина и бетулоновой кислоты удобна ТСХ-методика авторов [37], с более полярным элюентом. В соответствии с этой методикой, подготовку пробы осуществляют следующим образом: 50 мг исследуемого вещества растворяют в 10 мл метанола, из них 20 мкл наносят на ТСХ пластинку с силикагелем GF254 «Merck» (Durmsttadt, Germany). В качестве элюента используют бензол - этилацетат - муравьиная кислота (36:12:5), проявляя пластины 4-метоксибензальдегидом в серной кислоте. [37] Нами был модифицирован состав элюента: гексан - этилацетат - муравьиная кислота (20:5:1), а в качестве проявителя были использованы пары йода. Показано, что в этих условиях достигалось лучшее разделение: Rf бетулина = 0,30, Rf бетулоновой кислоты = 0,50.
Наличие бетулонового альдегида как основной примеси в бетулоновой кислоте устанавливали по карбонильному числу, рассчитанному по реакции взаимодействия гидроксиламина солянокислого с карбонильными группами. (схема 3.8.)
Предполагаемая схема реакции гидроксиламина солянокислого с бетулоновым альдегидом (а) и бетулоновой кислотой (б) Использовали ацидиметрическое обратное титрование при параллельном проведении контрольного опыта. [1, 4]
Карбонильное число теор. = 70 для соединений с одной карбонильной группой (бетулоновая кислота); карбонильное число теор = 140 для соединений с двумя карбонильными группами (бетулоновый альдегид).
Таким образом, рассчитанное карбонильное число должно быть не более 73,5 (примесь бетулонового альдегида не более 5%). Идентификация бетулоновой кислоты Циклопентанпергидрофенантреновый цикл в бетулоновой кислоте можно установить по появлению малинового окрашивания в реакции с ванилином. (Схема 3.9)