Совершенствование методов стандартизации и разработка антимикробных препаратов эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного Макарова Алена Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Актуальные вопросы стандартизации и использования сырья эвкалипта прутовидного,шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного (обзор литературы) 16

1.1. Характеристика эвкалипта прутовидного как источника получения лекарственных препаратов 16

1.1.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая характеристика эвкалипта прутовидного 16

1.1.2. Терпеноидные фенолальдегиды - биологически активные соединения растений рода Eucalyptus 17

1.1.3. Разработка отечественных препаратов на основе липофильного комплекса эвкалипта прутовидного 23

1.1.4. Современное состояние исследований по стандартизации сырья и препаратов эвкалипта прутовидного 28

1.1.5. Опыт применения эвкалипта прутовидного и фитопрепаратов на его основе 31

1.2. Характеристика шалфея лекарственного как источника получения лекарственных препаратов 32

1.2.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая характеристика шалфея лекарственного 32

1.2.2. Химический состав 33

1.2.3. Фармакологическая активность сырья шалфея лекарственного и препаратов на его основе 40

1.2.4. Оценка методов стандартизации листьев шалфея лекарственного и фитопрепаратов на их основе 43

1.3. Характеристика зверобоя продырявленного как источника получения лекарственных препаратов 1.3.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая характеристика зверобоя продырявленного 45

1.3.2. Производные флороглюцина как основные БАВ, отвечающие за антибактериальную активность сырья 46

1.3.3. Стандартизация травы зверобоя по содержанию производных флороглюцина 48

1.3.4. Разработка отечественных антимикробных препаратов из травы

зверобоя продырявленного 49

Выводы к главе 1 55

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 56

2.1. Объекты исследования 56

2.2. Методы исследования 57

2.2.1. Методы обнаружения и идентификации БАВ 57

2.2.2. Методы количественного определения БАВ 59

2.2.2.1. Методы количественного определения терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного 59

2.2.2.2. Метод количественного определения дитерпеновых кислот в сырье и извлечениях шалфея лекарственного 62

2.2.2.3. Метод количественного определения гидроксикоричных кислот 64

2.2.3. Метод оценки антибактериальной активности извлечений из сырья на культуре S.aureus 65

2.2.4. Метод определения чувствительности штаммов S.aureusк антибиотикам 67

ГЛАВА 3. Совершенствование методов стандартизациии разработка антибактериального препарата эвкалипта прутовидного 70

3.1. Совершенствование методов стандартизации листьев эвкалипта прутовидного 70

3.1.1. Оценка содержания фенолальдегидов в образцах листьев эвкалипта прутовидного различными методами 70

3.1.2. Разработка методики количественного анализа терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного 72

3.1.3. Разработка методик качественного анализа листьев эвкалипта прутовидного 80

3.1.4. Изучение зависимости между содержанием фенолальдегидов в извлечении из листьев эвкалипта прутовидного и антибактериальной активностью 81

3.1.5. Основные показатели и нормы качества листьев эвкалипта прутовидного 82

3.2. Разработка технологии получения антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного 83

3.2.1. Изучение динамики высвобождения фенолальдегидов из сырья 83

3.2.2. Оценка антибактериальной активности препарата из листьев эвкалипта прутовидного 87

3.2.3. Подходы к стандартизации антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного 91

3.2.4. Основные показатели и нормы качества антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного 93

Выводы к главе 3 95

ГЛАВА 4. Совершенствование методов стандартизации и технологии извлечений шалфея лекарственного 96

4.1. Оценка объективности метода количественного определения дитерпеновых кислот в листьях шалфея лекарственного 96

4.2. Изучение кинетики экстракции дитерпеновых кислот из сырья 99

4.3. Математическая модель экстракции дитерпеновых кислот при тонком измельчении 105

4.4. Совершенствование технологии извлечений из листьев шалфея лекарственного 115

4.5. Оценка содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея лекарственного 112

4.6. Основные показатели и нормы качества

листьев шалфея лекарственного 119

Выводы к главе 4 120

ГЛАВА 3. Совершенствование методов стандартизации и разработка антибактериального препаратазверобоя продырявленного 121

5.1. Совершенствование методов стандартизации травы зверобоя продырявленного 121

5.1.1. Обнаружение и идентификация производных флороглюцина в траве Н. perforatum и И. maculatum 121

5.1.2. Оценка антибактериальной активности извлечений из травы {{.perforatum и И. maculatum 123

5.1.3. Разработка методики количественного определения суммы производных гиперфорина в траве зверобоя продырявленного 123

5.1.4. Разработка методик качественного анализа травы зверобоя продырявленного 126

5.1.5. Основные показатели и нормы качества травы зверобоя продырявленного, применяемой для получения антибактериальных препаратов 127

5.2. Разработка технологии получения антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного 128

5.2.1. Технология антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного 128

5.2.2. Подходы к стандартизации антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного 131

5.2.3. Основные показатели и нормы качества

антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного 134 Выводы к главе 5 140

Общие выводы 141

Список сокращений 144

Список литературы

• Терпеноидные фенолальдегиды - биологически активные соединения растений рода Eucalyptus
• Методы количественного определения БАВ
• Оценка содержания фенолальдегидов в образцах листьев эвкалипта прутовидного различными методами
• Совершенствование технологии извлечений из листьев шалфея лекарственного

Введение к работе

Актуальность темы. Эфиромасличные и флавоноидсодержащие растения составляют основной массив наиболее популярных и широко используемых лекарственных растений (ЛР). Интенсивное изучение химического состава этих ЛР привело к открытию в них новых групп природных соединений, ответственных за те или иные виды биологической активности. К таким ЛР относятся широко применяемые в медицинской практике эфиромасличные растения: виды эвкалиптов (в РФ основной используемый вид -Eucalyptus viminalis Labill.) и шалфей лекарственный {Salvia officinalis L.). Открытие японскими учеными в начале 80-х годов прошлого века в Eucalyptus globulus L., соединений, названных эуглобалями, дало начало интенсивному изучению этой новой группы природных соединений из класса терпеноидных фенолальдегидов. В шалфее лекарственном были открыты биологически активные вещества (БАВ) - дитерпеновые кислоты и производные розмариновой кислоты. Описанные соединения проявляют различные виды биологической активности, в том числе и антибактериальную в отношении грамположительной микрофлоры.

В РФ официнальными являются два вида зверобоя - зверобой продырявленный {Hypericum perforatum L.) и зверобой пятнистый (четырехгранный) {Hypericum maculatum Crantz.) [Киселева Т.Л. и др., 2008; Самылина И.А. и др., 2003; 2010]. Их действующим началом в отечественной практике признаются флавоноиды, по содержанию которых осуществляется стандартизация сырья. С другой стороны, именно отечественным ученым принадлежит приоритет открытия в зверобое продырявленном гиперфорина и его производных (особого класса ацилфлороглюцинов), проявляющих высокую антибактериальную активность.

Согласно существующей в настоящее время для указанных видов сырья нормативной документации (НД) только для листьев эвкалипта прутовидного предусмотрена стандартизация по фенолальдегидам. Оценка качества листьев шалфея и травы зверобоя не предусматривает определение целевых веществ -носителей антибактериальной активности. В связи с этим изыскание новых подходов к стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного является актуальным исследованием с точки зрения усовершенствования оценки качества сырья по целевым компонентам (носителям антибактериальной активности).

В разные годы отечественными учёными были разработаны антибактериальные препараты на основе листьев эвкалипта («Эвкалимин», «Хлорофиллипт», «Галенофиллипт»), листьев шалфея («Сальвин») и травы зверобоя продырявленного («Новоиманин»). Однако стандартизация большей части из них не предполагала оценку содержания действующих веществ, отвечающих за антибактериальную активность. Стандартизация проводилась по антибактериальному титру в отношении золотистого стафилококка. К сожалению, большинство из упомянутых выше растительных антибактериальных препаратов в настоящее время на рынке отсутствуют. На фармацевтическом рынке РФ

представлены и занимают устойчивое положение только антибактериальные препараты из листьев эвкалипта прутовидного («Хлорофиллипт» и его аналоги), поэтому расширение исследований по разработке усовершенствованных антибактериальных препаратов на основе указанных видов сырья является современной и назревшей задачей.

Степень разработанности темы. Поиск в химическом составе лекарственного растительного сырья (ЛРС) соединений с антибактериальной активностью занимает важное место в современной науке, о чём свидетельствует большой объём публикаций в специализированных научных журналах. В изучении терпеноидных фенолальдегидов листьев эвкалипта (основных носителей антибактериальной активности сырья) выделяются группы японских исследователей (T.Masuda, J.P. Singh, М. Murata и др.). Изучением фенолальдегидов в СССР занималась группа исследователей ВИЛАРа под руководством А.А. Савиной. Разработке препаратов антимикробного действия на основе листьев эвкалипта посвящены работы Н.М. Крутиковой, В.Л. Надтока, И.Н. Зилфикарова. Антибактериальный препарат на основе листьев шалфея лекарственного был разработан научной группой под руководством И.А. Дербенцевой; впервые было показано, что ответственными за антимикробную активность сырья являются дитерпеновые кислоты (кислота карнозоловая). Вопросами стандартизации листьев шалфея лекарственного, а также разработке препаратов на их основе с контролируемыми показателями качества активно занимаются в ЗАО «Вифитех» под руководством И.Н. Зилфикарова. В результате исследования антимикробных веществ зверобоя продырявленного группой научных сотрудников Института микробиологии АН УССР В.Г. Дроботько, Б.Е. Айзенман, П.И. Киселем, М.О. Швейгер и СИ. Зелепухой был изучен и внедрен в медицинскую практику антимикробный препарат иманин (гиперфорин и его производные). Изучением антимикробных свойств препаратов на основе травы зверобоя продырявленного занимались СИ. Зелепуха, Н.А. Дербенцева, А.С. Рабинович и другие. Однако, несмотря на многолетний опыт исследований в области изучения описанных видов ЛРС, задачи по стандартизации сырья и получению усовершенствованных препаратов на его основе решены не в полной мере.

Цель диссертационного исследования. Целью настоящего исследования является совершенствование методов определения групп соединений, обладающих антибактериальной активностью, в листьях эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и траве зверобоя продырявленного и их выделения для получения антибактериальных препаратов.

Задачи исследования. При достижении поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести аналитический обзор данных литературы по современному состоянию исследований в области анализа листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного и методов стандартизации лекарственных препаратов, разработанных на их основе.

1. Разработать методы стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного с позиций определения основной группы БАВ, отвечающей за антибактериальную активность.

2. Оценить уровень антибактериальной активности извлечений из листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного в отношении грамположительных микроорганизмов (на примере S. aureus) для изучения возможности получения новых антибактериальных препаратов.

3. Разработать оптимальные условия экстракции БАВ, отвечающих за антибактериальную активность, из изучаемых видов ЛРС.

4. Предложить методы анализа полученных препаратов с антибактериальной активностью.

5. Изучить возможность комплексной переработки ЛРС, обладающего антибактериальным действием.

Научная новизна. Была показана возможность целевой экстракции действующих веществ эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного, зверобоя продырявленного липофильными растворителями.

Впервые для интерпретации экспериментальных данных, полученных при экстракции дитерпеновых кислот из листьев шалфея лекарственного, была сформулирована математическая модель взаимодействия целевых соединений с внутриклеточными структурами сырья. В результате апробации модели показано, что общая схема экстрагирования может быть сведена к рассмотрению «свободной» и «связанной» фракций целевых соединений.

Впервые обоснована целесообразность проведения стандартизации листьев шалфея по двум группам природных соединений - дитерпеновым и гидроксикоричным кислотам.

На основании целевой экстракции действующих веществ разработаны спектрофотометрические методики стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного.

Предложен рациональный способ получения антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного на основе целевой экстракции фенолальдегидов, активного в отношении грамположительных микроорганизмов, в том числе и антибиотикорезистентных штаммов золотистого стафилококка. Подана заявка на изобретение (№ заявки 2014139368/15, дата подачи заявки: 29.09.2014). Разработаны методы стандартизации препарата по конкретной группе БАВ, отвечающей за антибактериальную активность -фенолальдегидам.

Впервые в рамках изучения возможности комплексного использования травы зверобоя продырявленного предложена схема переработки сырья, включающая в себя две основные стадии: первая - получение антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного на основе целевой экстракции производных гиперфорина; вторая - получение из оставшегося шрота настойки, содержащей соединения фенольного ряда (флавоноиды, дубильные вещества).

Практическая значимость. Разработанные методы стандартизации листьев эвкалипта прутовидного (по терпеноидным фенолальдегидам), шалфея лекарственного (по дитерпеновым кислотам) и травы зверобоя продырявленного (по производным гиперфорина) используются в учебном процессе на кафедре фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «КГМУ» при изучении подходов к стандартизации указанных ЛР (акт внедрения ГБОУ ВПО «КГМУ» от 20.02.2015), апробированы в процессе работы Казанского филиала ФГБУ «Информационно-методического центра по экспертизе, учёту и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (акт внедрения от 20.02.2015) и предприятия ОАО «Татхимфармпрепараты» (акт внедрения от 26.02.2015).

Предложен способ получения антибактериального препарата на основе листьев эвкалипта прутовидного, показатели качества и методы их оценки. Установлен уровень антибактериальной активности препарата, превосходящий таковую у растительных препаратов - «Хлорофиллипт», «Галенофиллипт». Научно-исследовательский проект «Разработка антибактериального препарата на основе листьев эвкалипта прутовидного» был отмечен Венчурным фондом РТ в рамках проводимого конкурса «50 инновационных идей для РТ» как перспективный для решения проблемы эффективной и рациональной антибактериальной терапии инфекционных заболеваний, особенно заболеваний, индуцированных микрофлорой, резистентной к большинству часто применяемых антибактериальных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований по разработке методов стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного по основным группам БАВ, отвечающих за антибактериальную активность.

2. Математическая модель экстрагирования дитерпеновых кислот из листьев шалфея лекарственного.

3. Экспериментальные данные по разработке препаратов на основе изучаемых видов ЛРС при рассмотрении фенолальдегидов (листья эвкалипта прутовидного), дитерпеновых и гидроксикоричных кислот (листья шалфея лекарственного) и производных гиперфорина (трава зверобоя продырявленного) в качестве основных веществ, ответственных за антибактериальную активность.

4. Методы, используемые для стандартизации антибактериальных препаратов из листьев эвкалипта прутовидного и травы зверобоя продырявленного.

5. Результаты по оценке антибактериальной активности препарата из листьев эвкалипта прутовидного в отношении штаммов S. aureus, в том числе антибиотикоустойчивых.

6. Схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на 86-ой Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл-корр. Академии наук РТ, проф. И.Г. Салихова (Казань, 23-24 апреля 2012 г.); 87-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных, посвященной 155-летию со дня рождения Л.О. Даршкевича (Казань, 21-22 марта 2013); 88-ой

б

Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных, посвященной 200-летию КГМУ (Казань, 26-27 марта 2014); Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы повышения качества подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 25 марта 2013 г.); Российской научно-практической конференции «Эффективная аптека - новые технологии и возможности для провизоров и фармацевтов, руководителей и менеджеров аптек и розничных сетей» (Казань, 19 марта 2014 г.).

Научно-исследовательский проект «Разработка антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного» стал победителем конкурса «50 инновационных идей для РТ» (Казань, 2014), финалистом «Молодёжного научно-инновационного конкурса» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Казань, 2014).

Связь задач исследования с проблемным планом НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России: «Исследования в области совершенствования контроля качества ЛРС, содержащего БАВ различной природы, с учетом перехода их в используемые лекарственные формы» (№ Государственной регистрации 01201174259) и программы «Совершенствование методов стандартизации и разработка антимикробных препаратов эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного» (№ Государственной регистрации 114120240054).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 16 печатных работ, в том числе 4 работы в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 1 работа в журнале, входящем в базу данных Scopus.

Личный вклад автора. Результаты, изложенные в диссертации, получены на базе экспериментов, проводимых лично автором. В рамках диссертации проведены исследования по разработке подходов к стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного. Разработаны проекты изменения к фармакопейным статьям (ФС) на описанные виды сырья. Комплекс исследований по оценке содержания фенолальдегидов в извлечениях из листьев эвкалипта прутовидного и микробиологические испытания, проведённые автором, позволили предложить способ получения и методы стандартизации антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного, проявляющего высокую антибактериальную активность в отношении грамположительных микроорганизмов (на примере S. aureus), в том числе и антибиотикоустойчивых штаммов по сравнению с имеющимися аналогами. Автором предложена схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного, включающая в себя получение препарата антибактериального действия и настойки.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста, результаты исследований иллюстрированы 43 таблицами и 34 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, общих выводов,

Терпеноидные фенолальдегиды - биологически активные соединения растений рода Eucalyptus

Открытие терпеноидных фенолальдегидов как носителей фармакологической активности листьев эвкалипта нашло отражение в подходах к стандартизации сырья и препаратов. В частности, вышедшие в последние годы НД на листья эвкалипта прутовидного (ФСП 42-8000-06, ФСП 42-0039337502, ФСП 42-2007-08 «Эвкалипта прутовидного листья») стандартизуют это сырьё наряду с эфирным маслом и по сумме фенолальдегидов. Согласно ФСП 42 0039337502 «Эвкалипта прутовидного листья» методика количественного определения этих соединений предусматривает извлечение их 95% этиловым спиртом при комнатной температуре и спектрофотометрирование аликвоты (без очистки) при 278 нм. Норма содержания фенолальдегидов - не менее 3%. Та же самая методика и та же норма содержания фенолальдегидов была включена в ФСП 42-2007-08 «Эвкалипта прутовидного листья» (ООО ПКФ «Фитофарм»). В ФСП 42-8000-06 «Эвкалипта прутовидного листья» (ОАО «Красногорсклексредства») методика количественного определения фенолальдегидов предусматривает трехкратную экстракцию сырья 70% этиловым спиртом при кипячении на водяной бане с последующим спектрофотометрированием аликвоты (без очистки) при длине волны 278 нм. Норма содержания фенолальдегидов - не менее 5%. Препараты из листьев эвкалипта прутовидного стандартизуются различными методами. «Галенофиллипт» согласно ФСП 42-8623-07 стандартизуется по сумме фенолальдегидов. Для препарата предусмотрена качественная идентификация фенолальдегидов (Хтах = 278 нм ± 3 нм), а также медных аналогов хлорофилла, пиненов и цинеола. При количественной стандартизации определяют содержание фенолальдегидов и меди.

Для «Хлорофиллипта» в НД на субстанцию (ФС 42-1338-86) и ЛФ (ФС 42-1348-91 «Раствор хлорофиллпта спиртовой 1%.») предусмотрено качественное определение хлорофиллов в пробирке в ультрафиолетовых лучах лампы медицинской синей марки МДС 220-75, 1% спиртовый раствор должен быть окрашен в рубиново-красный цвет. Количественная стандартизация проводится по антибактериальной активности на культуре Staphylococcus aureus (S. aureus).

В исследованиях И.Н. Зилфикарова методы стандартизации «Хлорофиллипта» были усовершенствованы [30, 31, 32]. Предлагается качественная стандартизация препарата по терпеноидным фенолальдегидам -цветная реакция с ванилиновым реактивом, тонкослойная хроматография (ТСХ) в сравнении с Государственным стандартым образцом (ГСО) эвкалимина и запись УФ-спектра (Хтах = 278 нм ± 3 нм). Количественная стандартизация проводится по содержанию суммы фенолальдегидов, определяемых спектрофотометрированием раствора при 278 нм с применением для расчетов удельного показателя поглощения эвкалимина при используемой длине волны. Также И.Н. Зилфикаровым был подготовлен проект ФС на листья эвкалипта прутовидного. Качественная идентификация предлагается та же самая, что и в хлорофиллипте. Методика количественного определения фенолальдегидов включает в себя основные операции, заложенные в технологии получения хлорофиллипта (разработанной автором) и заключается в следующем: листья эвкалипта исчерпывающе экстрагируются 90% этиловым спиртом, аликвота спиртового извлечения упаривается до водного остатка, к которому добавляется равный объем 2% раствора C11SO4 и фенолальдегиды извлекаются многократной обработкой полученного раствора хлороформом в делительной воронке. Норма содержания фенолальдегидов предлагается не менее 3% на сухую массу листьев.

К сожалению, предложенные И.Н. Зилфикаровым усовершенстваванные методы стандартизации сырья и препаратов эвкалипта почти не нашли отражения в вышедших НД. В частности, в ФСП 42-8556-07 «Хлорофиллипт, экстракт густой» (ЗАО «Вифитех») предусмотрена только качественная идентификация фенолальдегидов по характеру УФ-спектра (Хтах = 278 нм ± 3 нм), количественная стандартизация проводится микробиологическим методом.

В НД на субстанцию эвкалимина (ФСП 42-0601642705 «Эвкалимин») и его ЛФ (ФС 42-3607-98 «Раствор эвкалимина спиртовой 0,25% и 1%» предусматривается качественная идентификация фенольных соединений по цветной реакции с FeCb и запись УФ-спектра (А х = 278 нм ± 3 нм). Количественная стандартизация проводится по сумме фенолальдегидов, определяемых фотоэлектроколориметрией по измерению оптической плотности продуктов реакции с FeCb. В НД на ГСО эвкалимина (ФС 42-3606-98 «Эвкалимин - Государственный стандартный образец») предлагается такая же качественная идентификация, а вот количественное определение проводится УФ-спектрофотометрией при 278 нм.

Также стандартизовать по содержанию фенолальдегидов стали в последние годы и такую давно применяемую ЛФ листьев эвкалипта как настойка. Ранее настойка эвкалипта либо вообще не подвергалась количественной стандартизации, и качество ее оценивалось по показателю плотности и содержанию спирта (ФС 42-741-87 «Настойка эвкалипта»), либо стандартизация проводилась по содержанию суммы дубильных веществ (НД 42-7965-97 «Настойка эвкалипта»). При стандартизации настойки эвкалипта используются разные подходы, в частности, в ФСП 000417-280211 ОАО «Флора Кавказа» предлагает количественно оценивать содержание фенолальдегидов в настойке спектрофотометрическим методом при длине волны 278 нм, только разбавляя аликвоту препарата 95% спиртом. В ФСП 000743-290911 ООО «Камелия НЛП» методика количественного определения фенолальдегидов предполагает сложную процедуру очистки от сопутствующих веществ путем сгущения настойки под вакуумом, фильтрованием выпавшего осадка и извлечением фенолальдегидов из фильтрата петролейным эфиром. После отгонки петролейного эфира остаток растворяется в 96% спирте и раствор фотометрируется при длине волны 276 нм.

Методы количественного определения БАВ

Около 1,0 г (навеска) листьев, измельченных до размера частиц не более 0,5 мм, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл спирта этилового 90% и перемешивают на магнитной мешалке при кипении с обратным холодильником в течение 1 ч. После охлаждения надосадочную часть извлечения фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, к сырью прибавляют 30 мл спирта этилового 90% и экстрагирование повторяют. Извлечение фильтруют через тот же фильтр, колбу с сырьем и фильтр промывают 20 мл спирта этилового 90%, объем в мерной колбе доводят до метки тем же растворителем и перемешивают (раствор А).

20 мл раствора А помещают в круглодонную колбу и упаривают на водяной бане под вакуумом до 4-5 мл, к охлажденному остатку прибавляют 5 мл раствора меди сульфата 2%, 10 мл хлороформа и перемешивают.

Полученную смесь количественно с помощью 10 мл хлороформа переносят в делительную воронку, затем после полного разделения слоев сливают хлороформный слой в сухую колбу. Водную фазу экстрагируют хлороформом еще 2 раза порциями по 10 мл. Объединенное хлороформное извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу со шлифом вместимостью 100 мл, колбу и фильтр промывают 10 мл хлороформа. Объем в мерной колбе доводят до метки хлороформом и перемешивают (раствор Б). УФ спектр поглощения раствора Б, измеренный относительно хлороформа в интервале длин волн от 240 до 320 нм, должен иметь максимум при 278 нм. Содержание суммы эуглобалей в листьях эвкалипта (х) рассчитывают либо по ГСО эвкалимина, либо по удельному показателю поглощения, рассчитанному в условиях методики анализа и равному 417:

Метод количественного определения дитерпеновых кислот в сырье и извлечениях шалфея лекарственного В рамках изучения предлагаемых на сегодняшний день методов стандартизации листьев шалфея лекарственного количественное определение дитерпеновых кислот в сырье и извлечениях на их основе проводили по методике, предложенной проф. И.Н. Зилфикаровым [29]:

Аналитическую пробу растительного сырья около 2 г (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 30 мл ацетона, соединяют с обратным холодильником и экстрагируют при температуре кипения растворителя в течение 30 минут. Полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр, фильтр присоединяют к навеске сырья, которую экстрагируют повторно 30 мл ацетона. Профильтрованное ацетоновое извлечение упаривают досуха, остаток обрабатывают 10 мл 5% раствора аммиака. Водно-аммиачный раствор фильтруют через бумажный фильтр. Операцию повторяют ещё раз с целью избежать потери определяемых веществ. К фильтрату прибавляют при перемешивании 20 мл разведённой соляной кислоты. Выпавший осадок количественно собирают на фильтр Шотта с диаметром пор 16 мкм, промывают 10 мл воды. Затем осадок количественно с помощью спирта 95% переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объём раствора до метки. Полученный раствор разбавляют спиртом 95% в 10 раз и измеряют оптическую плотность при длине волны 285 нм.

Для оценки содержания дитерпеновых кислот в спиртовых и водных извлечениях из листьев шалфея методика была видоизменена на стадии пробоподготовки аналитического раствора. Для спиртового извлечения аликвота отгонялась досуха под вакуумом, далее поступали также как в методике со стадии обработки водно-аммиачным раствором. Для водных настоев аликвотную часть объёмом, равным половине от общего объёма водного извлечения, подкисляли уксусной кислотой до рН = 3,5, помещали в делительную воронку вместимостью 250 мл и экстрагировали хлороформом 4 раза порциями по 10 мл, затем водную фазу отбрасывали. Объединённое хлороформное извлечение упаривают до сухого остатка под вакуумом. Далее поступали как в методике со стадии обработки водно-аммиачным раствором.

Метод количественного определения гидроксикоричных кислот Для оценки содержания гидрокискоричных кислот в листьях шалфея лекарственного использовали метод, предложенный в ЕФ VII издания (с. 1228) на «Розмарина лекарственного листья» [88]:

0,2 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 200 мл. Затем прибавляют 80 мл 50 % этилового спирта и проводят экстракцию на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут. Полученное извлечение охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки 50 % этиловым спиртом. Затем 1 мл извлечения переносят в мерную колбу на 10 мл, добавляют последовательно следующие реактивы: 2 мл 0,5 М раствора хлористоводородной кислоты, 2 мл раствора, полученного растворением 10 г натрия нитрита и 10 г натрия молибдата в 100 мл воды, 2 мл 8,5 % раствора гидроксида натрия и доводят объем раствора до метки водой очищенной.

Параллельно готовят раствор сравнения: 1 мл извлечения переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной. Оптическую плотность сравнивают при длине волны 505 нм. Содержание гидроксикоричных кислот (х), в пересчете на кислоту розмариновую, вычисляют по формуле:

Оценка содержания фенолальдегидов в образцах листьев эвкалипта прутовидного различными методами

Результаты показали, что настой, полученный экстракцией 1% раствором натрия гидрокарбоната имеет сходную антибактериальную активность в отношении S. aureus со спиртовым извлечением из листьев шалфея (1:10).

Как отмечалось, для оценки содержания дитерпеновых кислот в спиртовых и водных извлечениях мы использовали методику, предложенную И.Н. Зилфикаровым с соавторами (см. раздел 2.2.2.2). Однако, как отмечалось выше, данная методика определяет, скорее всего, суммарное содержание дитерпеновых и гидроксикоричных кислот. Поскольку нами было показано, что дитерпеновые кислоты можно избирательно извлечь из сырья петролейным эфиром, мы провели изучение антибактериальной активности спиртовых извлечений, полученных из сырья, до и после экстракции его этим растворителем (Таблица 25). Технология извлечений представлена ниже.

Технология получения спиртового извлечения, полученного растворением сухого остатка после отгонки петролейного эфира Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) экстрагируют в аппарате Сокслета в течение 3 ч 200 мл петролейного эфира 40/70. После охлаждения раствор фильтруют через бумажный фильтр в цилиндр. Затем извлечение упаривают под вакуумом до сухого остатка и растворяют в 10 мл 95% этилового спирта (дитерпеновые кислоты)

Технология получения спиртового извлечения из листьев шалфея лекарственного, обработанных петролейным эфиром Около 10 г шрота (точная навеска), полученного после обработки петролейным эфиром 40/70 после количественного определения дитерпеновых кислот в сырье, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 250 мл, смачивают 1% раствором кислоты хлористоводородной (15-20 мл). Затем прибавляют 100 мл спирта этилового 95% и проводят экстракцию на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. После охлаждения надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр в цилиндр.

К шроту прибавляют 50 мл 95% спирта этилового и повторяют экстрагирование при таком же режиме. Полученное извлечение фильтруют в цилиндр. Колбу с отработанным сырьём и фильтр промывают небольшим количеством экстрагента. Объединённые спиртовые извлечения упаривают под вакуумом до 100 мл.

Таблица 25. Антибактериальная активность извлечений из листьев шалфея лекарственного на культурах S. aureus

Спиртовый раствор (1:10), полученный БАВ, отвечающие заантибактериальнуюактивность Максимальное разбавлениеизвлечения, инактивирующееразмножение S. aureus из листьев шалфея необработанных петролейным эфиром Сумма дитерпеновых и гидрокси-коричных кислот 1:256 1:64

Продолжение таблицы Спиртовый раствор (1:10), полученный БАВ, отвечающие заантибактериальнуюактивность Максимальное разбавлениеизвлечения, инактивирующееразмножение S. aureus из листьев шалфея обработанных петролейным эфиром Гидроксикоричные кислоты 1:64 1:64 растворением сухого отстатка после отгонки петролейного эфира Дитерпеновые кислоты 1:32 1:16

Результаты показали, что антибактериальная активность спиртового раствора, полученного из петролейного экстракта шалфея (содержавшего только дитерпеновые кислоты без примеси других фенольных соединений) в сравнении с суммарным спиртовым экстрактом была в 8 раза ниже. Эти результаты свидетельствуют о наличии антибактериальной активности не только у дитерпеновых кислот, но и у других фенольных соединений (прежде всего гидроксикоричных кислот), которые остаются в сырье после экстракции его петролейным эфиром. Так как две группы целевых веществ являются ответственными за антибактериальную активность листьев шалфея, стандартизацию сырья необходимо проводить по двум группам указанных БАВ.

Оценка содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея лекарственного

Как уже отмечалось в разделе 1.2.4 приоритетным направлением в развитии подходов к стандартизации эфиромасличных растений является установление норм содержания веществ, которые отвечают за фармакологический эффект растения.

В разделе 4.1 было установлено, что помимо дитерпеновых кислот в листьях шалфея лекарственного ответственными за антибактериальный эффект сырья являются соединения полифенольного ряда (гидроксикоричные кислоты).

Для оценки содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея рационально использовать унифицированный метод определения гидроксикоричных кислот Европейской Фармакопеи, описанный в разделе 2.2.2.3.

Записанный спектр извлечения, полученного по методике, имеет чётко выраженный пик при 330 нм, который является характеристичным для гидроксикоричных кислот (Рисунок 32).

Для проверки воспроизводимости методики мы провели серию опытов как с нативным (необработанным) сырьём, так и с жомом после его обработки петролейным эфиром 40/70. Полученные результаты представлены в Таблице 27. Таблица 27. Содержание гидроксикоричных кислот в листьях шалфея лекарственного, % Листья шалфея Содержание гидроксикоричных кислот, % необработанные петролейным эфиром 4,38±0,29 обработанные петролейным эфиром листья 4,39±0,19 117 Результаты показали, что содержание гидроксикоричных кислот как в нативном сырье, так и в жоме равноценно. В этой связи более целесообразным является определение гидроксикоричных кислот в необработанном петролейным эфиром (нативном) сырье. Дополнительно изучали динамику перехода гидроксикоричных кислот в растворитель. Определение их в растворе проводили через 5, 10, 20, 30, 40, 60 и 120 мин после фиксирования момента закипания экстрагента (Рисунок 33). Показано, что более 90% действующих веществ выходит в раствор уже по истечению 20 - 30 мин, что позволяет говорить об исчерпывающей экстракции гидроксикоричных кислот за заданное в методике время.

Совершенствование технологии извлечений из листьев шалфея лекарственного

Полученный с помощью селективной экстракции производных гиперфорина антибактериальный препарат из травы зверобоя продырявленного должен проходить этапы стандартизации как в качественном, так и в количественном отношении по производным гиперфорина, как основным соединениям, отвечающим за его фармакологический (антибактериальный) эффект.

С этой целью основное внимание было уделено разработке анализа препарата по разделам «Подлинность» и «Количественное определение».

Для раздела «Подлинность» использовали экспериментальные данные, полученные при анализе травы зверобоя продырявленного на содержание производных гиперфорина (см. раздел 5.1.1). Записанный УФ-спектр препарата, полученный путём экстракции петролейным эфиром 40/70, имел четко выраженный максимум поглощения при длине волны 278 ± 3 нм, совпадающий с УФ-спектром гесанового извлечения, приготовленного для количественного анализа сырья зверобоя продырявленного.

Для установления подлинности антибактериального препарата посчитали целесообразным проводить качественную идентификацию производных гиперфорина методом ТСХ-анализа. Для установления оптимальных условий хроматографирования использовали экспериментальные данные по обнаружению производных гиперфорина в траве звнробоя продырявленного (см. раздел 5.1.1). Было установлено, что наилучшего разделения удаётся достичь при использовании хроматографической системы гексан :этилацетат(1:1). Гиперфорин в препарате обнаруживали в виде пятен с Rf около 0,45 по интенсивной сине-фиолетовой флюоресценции в УФ-свете при 360 нм. Возможно присутствие других зон на хроматограмме.

В основу метода количественной стандартизации был положен УФ-спектрофометрический метод определения производных гиперфорина в траве зверобоя продырявленного, описанный в разделе 5.1.3. Полученные экспериментальные данные при анализе сырья травы зверобоя продырявленного позволили предложить методику количественного определения производных гиперфорина в разработанном антибактериальном препарате.

Методика количественного определения производных гиперфорина в антибактериальном препарате из травы зверобоя продырявленного 1 мл препарата переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом. Измерение оптической плотности раствора проводят при длине волны 278 нм, используя в качестве раствора сравнения 95% этиловый спирт. Содержание суммы производных гиперфорина в пересчете на гиперфорин в процентах (X) вычисляют по формуле где D - оптическая плотность испытуемого раствора; 536 - молекулярный вес гиперфорина; 8200 - показатель поглощения 6-10 4М раствора гиперфорина при 278 нм; В таблице 38 представлены результаты разработанной методики количественного определения производных гиперфорина в препарате. Определение проводилось 10 раз, результаты обрабатывались методом вариационной статистики с применением коэффициента Стьюдента. Таблица 37.Результаты количественного определения суммы производных гиперфорина в антибактериальном препарате изтравы зверобоя продырявленного. Метрологические характеристики . f X S2 S Р t (0,95; 9) Ах є,% 9 0,2 0,000056 0,0075 0,95 2,26 0,01 ±1,16

Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости методики, ошибка метода не превышает 1,16%. Установлена норма содержания суммы производных гиперфорина в препаратеиз травы зверобоя продырявленного, которая составляет не менее 0,2%.

Основные показатели и нормы качества антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного Результаты экспериментальных исследований по разработке технологического процесса экстракционного препарата из травы зверобоя продырявленного и оценки показателей его качества должны быть отражены в НД на препарат. Основные показатели и нормы качества препарата из травы зверобоя продырявленого представлены в Таблице 38.

Проблема комплексной переработки растительного сырья актуальна, так как часто в шроте после получения препаратов остаются ценные БАВ. Учитывая богатый химический состав травы зверобоя, мы исследовали возможность комлексного использования сырья в рамках получения антибактериального препарата на его основе. Исходя из того, что экстракция петролейным эфиром 40/70 производных гиперфорина из травы зверобоя продырявленного довольно избирательна и другие группы БАВ зверобоя, такие как флавоноиды и дубильные вещества, не растворяются в нем, мы предположили, что шрот можно использовать для получения настойки зверобоя, в которой эти соединения являются активным началом. Отсутствие флавоноидов и дубильных веществ в петролейном экстракте было подтверждено методом ТСХ при проявлении хроматограмм растворами алюминия хлорида (флавоноиды) и железоаммонийных квасцов (дубильные вещества). Характерных пятен на хроматограммах обнаружено не было.

Настойку зверобоя (1:5) готовили на 40% этиловом спирте по известной технологии (ФС 42-1889-95 «Зверобоя настойка) методом перколяции из травы зверобоя продырявленного с содержанием флавоноидов 3,58 ±0,11%. Перколяцию осуществляли до получения заданного объёма настойки. Для очистки от сопутствующих веществ настойку отстаивали при температуре +5-8С в течение 2 суток.

Было приготовлено по четыре образца настойки из необработанной травы зверобоя и из высушенного в течение суток шрота травы зверобоя, оставшегося после получения антибактериального препарата.

Каждый полученный образец настойки представлял собой жидкость красно-бурого цвета, соответствующую по внешнему виду описанию в ФС. Оценку качества полученных настоек проводили прежде всего по показателям «Количественное определение» и «Сухой остаток» (Таблица 39). Сумму