Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 12
1.1. Состав флавоноидов и их количественное содержание в Hypericum perforatum L. и Н. maculatum Crantz 12
1.2. Методы количественного определения суммы флавоноидов втраве зверобоя 17
1.3. Состав флавоноидов и их количественное содержание в листьях Betula pendula Roth, и В. pubescens Ehrh 19
1.4. Методы количественного определения суммы флавоноидов в листьях березы 23
1.5. Состав флавоноидов и их количественное содержание в траве Polygonum aviculare L 25
1.6. Методы количественного определения суммы флавоноидов в траве горца птичьего 28
1.7. Состав флавоноидов и их количественное содержание в траве Origanum vulgare L 29
1.8. Методы количественного определения суммы флавоноидов в траве душицы 32
1.9. Состав флавоноидов и их количественное содержание в траве Thymus serpyllum L 34
1.10. Методы количественного определения суммы флавоноидов в траве тимьяна ползучего 35
1.11. Состав флавоноидов и их количественное содержание в цветках Calendula officinalis L 36
1.12. Методы количественного определения суммы флавоноидов в цветках календулы 38
1.13. Состав флавоноидов и их количественное содержание в цветках Helichrysum arenarium (L.) Moench 41
1.14. Методы количественного определения суммы флавоноидов в цветках бессмертника песчаного 42
1.15. Состав флавоноидов и их количественное содержание в траве Viola tricolorL 45
1.16. Методы количественной стандартизации травы фиалки 47
1.17. Состав флавоноидов и их количественное содержание в Amaranthus cruentus L 48
Выводы к главе 1 48
Экспериментальная часть 51
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 51
2.1. Объекты исследований 51
2.2. Методы исследований 52
2.2.1. Методы фитохимического анализа 52
2.2.2. Методы биохимического анализа 59
ГЛАВА 3 Оптимизация методов количественного определения флавоноидов в образцах лекарственного растительного сырья 60
3.1. Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в траве зверобоя продырявленного и пятнистого 60
3.2. Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в листьях березы повислой 67
3.3. Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в траве горца птичьего 73
3.4. Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в траве душицы 77
3.5. Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в траве тимьяна ползучего 83
3.6. Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в цветках ноготков 88
3.7. Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в цветках бессмертника песчаного 93
Выводы к главе 3 97
ГЛАВА 4. Обобщение результатов экстракции флавоноидов на основе принятой математической модели 98
4.1. Формулировка модели 98
4.2. Кинетика однократной экстракции 102
4.3. Калибровка модели на основе проведенных экспериментов 103
Выводы к главе 4 ПО
ГЛАВА 5. Разработка метода количественного опредления водорастворимых флавоноидов в траве фиалки 111
5.1. Разработка метода количественного определения водорастворимых флавоноидов в траве фиалки 111
Выводы к главе 5 117
ГЛАВА 6. Разработка методов количественного определения и способов препаративного выделения флавоноидов амаранта багряногои изучение некоторых аспектов их биологической активности 118
6.1. Разработка метода количественного определения флавоноидов в листьях амаранта багряного 118
6.2. Разработка способа препаративного выделения суммы флавоноидов из листьев амаранта багряного 121
6.3. Изучение биологической активности суммы флавоноидов из листьев амаранта багряного 124
Выводы к главе 6 130
Выводы 132
Список литературы
- Состав флавоноидов и их количественное содержание в листьях Betula pendula Roth, и В. pubescens Ehrh
- Методы фитохимического анализа
- Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в листьях березы повислой
- Калибровка модели на основе проведенных экспериментов
Введение к работе
Актуальность темы. Флавоноидсодержащие растения составляют одну из наиболее обширных и популярных групп лекарственных растений как отечественной, так и мировой медицины. Тенденцией последних лет является переход к стандартизации по содержанию флавоноидов растений, действующими веществами которых ранее признавались биологически активные соединения иной природы ((Киселева Т.Л. и др., 2008; Куркина А.В., 2012; Самылина И.А. и др., 2003; 2010). Выходящие в последние годы нормативные документы на лекарственное растительное сырье ведущих отечественных производителей постоянно увеличивают этот список (трава душицы, трава череды, цветки календулы, кукурузные рыльца, листья крапивы и др.).
Основным методом стандартизации ЛРС, содержащего флавоноиды в отечественной, да и в зарубежной практике стал в последнее время метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на цветной реакции флавоноидов с хлоридом алюминия. Если в одиннадцатом издании отечественной фармакопеи из 11 видов ЛРС, стандартизовавшихся по содержанию флавоноидов этим методом проводилось определение в 3 видах сырья, то во вновь вышедших ФСП на 10 фармакопейных видов сырья во всех случаях предлагается именно этот способ определения. В Европейской фармакопее из 18 флавоноидных растений, 8 стандартизуются этим методом. Однако в подходах российской НД и Европейской фармакопеи к определению флавоноидов в ЛРС имеются различия. В отечественной практике используется индивидуальных подход к каждому виду сырья, для которого подбирается режим экстракции флавоноидов, условия проведения реакции с хлоридом алюминия, определяется максимум поглощения продуктов реакции флавоноидов с хлоридом алюминия и основной флавоноид, на который будет пересчитываться содержание суммы флавоноидов. В Европейской фармакопее для большой группы сырья используется унифицированная методика, по которой навеску сырья подвергают кислотному гидролизу в среде ацетона, полученные агликоны экстрагируют этилацетатом и измеряют оптическую плотность комплекса агликонов с хлоридом алюминия. Для расчетов используют удельный показатель поглощения гиперозида или изокверцитрина равный 500. Отечественные методики отличаются большой вариабельностью в режимах экстракции флавоноидов (зачастую достаточно длительных - от 1 часа до 2-х и более), разнообразием в использовании референтного флавоноида (в качестве ГСО или применения для расчетов его удельного показателя поглощения), выбор которого не всегда оправдан, причем зачастую это приводит к конечным результатам, которые могут отличаться от истинного в разы.
В общепринятом и фактически ставшим классическим, методе определения флавоноидов в растительном сырье, обнаруживается резервы для совершенствования, конечной целью которых, должна стать унификация подходов к определению флавоноидов в различных видах сырья. Это возможно, прежде всего, в оптимизации процедуры экстракции, переходе от длительных режимом к экспрессным и доказательном выборе референтного флавоноида, удельный показатель поглощения которого будет использоваться для расчетов.
Степень разработанности темы. Совершенствование анализа
флавоноидсодержащих растений является важным разделом современных
исследований лекарственного растительного сырья, что связано и с широким ассортиментом данной группы лекарственных растений и с их значением с терапевтической точки зрения. Этой проблемой занимаются большие научные школы, в частности ученые Самарского медицинского университета под руководством профессора В.А. Куркина (Е.В. Авдеева, О.Е. Правдивцева, В.Б. Браславский, А.В. Куркина и др.), большое количество работ по этой проблематике выполнено под руководством профессоров И.А. Самылиной, А.А. Сорокиной, Т.Л. Киселевой, В.Н. Бубенчиковой и др. Результаты этих исследований нашли отражение в проектах фармакопейных статей на флавоноидсодержащие виды сырья для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания. Вместе с тем исследований по разработке экспрессных методов определения флавоноидов в растительном сырье почти нет.
Цели и задачи исследования.
Цель работы: Совершенствование определения флавоноидов в различных видах растительного сырья методом дифференциальной спектрофотометрии.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
1. Оптимизировать режим экстракции флавоноидов в рамках аналитической
методики из следующих видов флавоноидсодержащего сырья:
-
травы зверобоя продырявленного и пятнистого;
-
травы горца птичьего;
-
травы душицы;
-
травы тимьяна ползучего (чабреца)
-
листьев березы повислой;
-
цветков календулы;
-
цветков бессмертника песчаного.
2. Определить при помощи метода ВЭЖХ природу доминирующего флавоноида
в следующих видах сырья:
-
траве зверобоя продырявленного и пятнистого;
-
траве душицы;
-
траве тимьяна ползучего (чабреца);
-
листьях березы повислой.
3. На основании экспериментальных данных предложить модель, описывающую
закономерности экстракции флавоноидов из растительного материала.
-
Определить возможность водной экстракции флавоноидов в рамках аналитической методики для стандартизации сырья по содержанию флавоноидов, переходящих в водные извлечения на примере травы фиалки трехцветной.
-
Определить возможность водной экстракции флавоноидов для препаративного выделения из растительного материала на примере листьев амаранта багряного.
-
Оценить целесообразность стандартизации листьев амаранта багряного по содержанию суммы флавоноидов, при использовании их в качестве кормовой добавки в животноводстве.
Научная новизна результатов исследования заключается в получение данных о характере экстракции флавоноидов из растительного сырья кипящим растворителем.
На основании экспериментальных данных построена математическая модель, объясняющая закономерности быстрой экстракции флавоноидов из растительного материала отсутствием взаимодействия целевых веществ с внутренними структурами сырья (адсорбционные эффекты) и, во-вторых, образованием в результате измельчения сырья фракции так называемых "свободных" соединений, выходящих в раствор очень быстро. Была показана целесообразность отказа от продолжительной исчерпывающей экстракции флавоноидов в пользу экспрессных вариантов неполного извлечения флавоноидов с использованием в расчетных формулах соответствующих рассчитанных поправочных коэффициентов. Для пяти из исследованных видов сырья был определен доминирующий флавоноид и предложено использовать для расчетов значения его удельного показателя поглощения, взамен используемых в официальных нормативных документах, что существенно повышает достоверность анализа. Были исследованы технологические параметры, влияющие на процесс водной экстракции флавоноидов из растительного сырья, и показано, что единственным значимым фактором, влияющим на него, является соотношения сырья и растворителя, что в свою очередь позволило предложить экспресс-метод определения водорастворимых флавоноидов. Закономерности, выявленные при разработке аналитической методики определения водорастворимых флавоноидов в траве фиалки, позволили разработать новый способ получения флавоноидов (технического рутина) из листьев амаранта багряного на основе водной экстракции.
Практическая значимость полученных результатов состоит в разработке экспресс-методов количественного определения флавоноидов в 8 видах лекарственного растительного сырья, позволивших существенно сократить время анализа. Разработанные методики определения флавоноидов были апробированы в Казанском филиале государственного бюджетного учреждения «Информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения» и на ОАО «Татхимфармпрепараты» и получили положительные оценки. Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники Казанского государственного медицинского университета. Подготовлены проекты изменений для внесения в действующие нормативные документы на соответствующие виды лекарственного растительного сырья.
Подготовлена заявка на патент на новый способ получения суммы флавоноидов (технического рутина) из листьев амаранта багряного.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.
Диссертационная работа исполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (№ Гос. регистрации 01201174259).
Положения, выносимые на защиту:
1. Экспресс-методы количественного определения флавоноидов в траве зверобоя продырявленного и пятнистого, траве горца птичьего, траве душицы, траве чабреца, цветках календулы, цветках бессмертника песчаного, листьях березы, листьях амаранта багряного.
2. Математическая модель быстрой однократной экстракции флавоноидов из
растительного сырья кипящим растворителем.
-
Экспресс-метод количественного определения водорастворимых флавоноидов в траве фиалки.
-
Способ препаративного выделения суммы флавоноидов (технического рутина) из листьев амаранта багряного на основе кратковременной водной экстракции сырья.
5. Влияние флавоноидов, выделенных из амаранта багряного на рост и
иммунологические показатели белых крыс, как фактора подтверждающего
рациональность стандартизации этого сырья как кормовой добавки в животноводстве
по содержанию данной группы соединений.
Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на пятой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2010), научно-методической конференции «Гаммермановские чтения -2011» (Санкт-Петербург, 2011), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения академика Л.Н.Андреева «Ботанические сады в современном мире: теоретические и прикладные исследования» (Москва, 2011), VI всероссийской научной конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул 2014), 88-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 200-летию Казанского государственного медицинского университета (Казань, 2014), научно-практической конференции «Бутлеровское наследие - 2015» (Казань, 2015).
Основное содержание диссертации опубликовано в 9 научных работах, в том числе 3 статьи в журналах из перечня, рекомендуемого ВАК.
Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором разработаны экспресс-методики анализа исследуемых видов лекарственного растительного сырья, предложена математическая модель быстрой однократной экстракции флавоноидов из растительного сырья кипящим растворителем, способ препаративного выделения суммы флавоноидов (технического рутина) из листьев амаранта багряного на основе кратковременной водной экстракции сырья. Исследования биологической активности суммы флавоноидов, выделенных из листьев амаранта багряного проведены в ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» Министерства сельского хозяйства РФ под руководством О.В. Шиловой.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 44 таблицы, 30 рисунков. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов и списка литературы, включающего 140 источников, из которых 38 - на иностранных языках.
Состав флавоноидов и их количественное содержание в листьях Betula pendula Roth, и В. pubescens Ehrh
В Российской Федерации у березы используется два вида сырья - почки и листья, для заготовки которых разрешено применять два вида - березу повислую (бородавчатую) {Betulapendula Roth, (синоним В. verrucosa Ehrh.)) и березу пушистую (В. pubescens Ehrh.) семейства Betulaceae.
Оба вида представляют собой листопадные деревья высотой до 20 м с белой, легко отслаивающейся корой. У березы повислой ветви повисающие, листья яйцевидно-ромбические, треугольно-яйцевидные или овально-яйцевидные. Береза пушистая отличается от березы повислой более короткими, направленными вверх и в стороны ветвями и овально 20 яйцевидными, более кожистыми листьями. Оба вида обычны для лесной и лесостепной зоны, однако береза пушистая заходит на север значительно дальше березы повислой.
Почки и листья используются для приготовления настоев (индивидуально или в составе сборов) обладающих диуретическими, желчегонными и бактерицидными свойствами. Листья березы также используются для получения сухого экстракта, который является составной частью гепатопротекторного препарата «Сибектан».
Первые сведения об обнаружении в березе флавоноидных соединений относятся к 1946 г., когда из листьев березы повислой был выделен в количестве 0,36% гиперозид. В работе [138] в листьях B.pendula были обнаружены кверцитрин, гиперозид, мирицетин-3-дигалактозид. В серии работ К. Dulelenbachollke (Dallenbacholke) с соавторами [109, ПО, 112] в листьях В. pendula и В. pubescens методом ВЭЖХ были идентифицированы кверцитрин, рутин, гиперозид, авикулярин (кверцетин-3-арабинофуранозид), кверцетин-3-арабинопиранозид, кверцетин-3-глюкуронид, мирицетин-3-галактозид.
Состав флавоноидов в листьях В. pendula и В. pubescens, произрастающих в Финляндии был изучен в работах М. Keinanen с соавторами [127, 128, 129]. С помощью метода ВЭЖХ ими были идентифицированы кверцитрин, гиперозид, авикулярин (кверцетин-3 арабинофуранозид), кверцетин-3-арабинопиранозид, кверцетин-3 глюкуронид, два различных 3-гликозида мирицетина.
В работах V. Ossipov с соавторами [117, 119] в листьях В. pendula и В. pubescens методом ВЭЖХ-МС были идентифицированы мирицетин-3 глюкуронопиранозид, мирицетин-3-галактопиранозид, мирицетин-3 ацетилрамнопиранозид, кверцетин-3-глюкуронопиранозид, кверцетин-3 галактопиранозид (гиперозид), кверцетин-3-арабинофуранозид (авикулярин), кверцетин-3-рамнопиранозид (кверцитрин), кверцетин-3 21 ацетилрамнопиранозид, кемпферол-3-глюкопиранозид, кемпферол-3-рамнопиранозид, нарингенин, а также несколько флавоноидов, структура которых точно не была установлена. На рисунке 1 приведена таблица из работы [117], по которой видно, что доминирующими флавоноидами в листьях В. pendula являются мирицетин-3-ацетилрамнопиранозид, а в листьях В. pubescens - кверцетин-3-глюкуронопиранозид
Содержание фенольных компонентов в листьях В. pubescensu В. pendula [117]. Состав флавоноидов в листьях березы, произрастающей в Самарской области, был изучен В.В. Стеняевой. Были выделены и идентифицированы гиперозид, рутин, апигенин, 7,4 -димететиловый эфир скутеллареина [71].
Состав и количественное содержание флавоноидов в экстракте из листьев березы изучено в работе [2]. Методом ВЭЖХ-МС были определены такие флавоноиды как мирицетин-3-глюкопиранозид (0,409), мирицетин-3-глюкуронопиранозид (0,273), мирицетин-3-галактопиранозид (0,307), мирицетин-3-арабинофуранозид (0,063), кверцетин-3-глюкопиранозид (изокверцитрин) (0,116), кверцетин-3-галактопиранозид (гиперозид) (1,889), кверцетин-3 -глюкуронопиранозид (1,073), кверцетин-3 -арабинопиранозид (0,440), кверцетин-3-арабинофуранозид (авикулярин) (0,186), кверцетин-3-рамнопиранозид (кверцитрин) (0,442), кемпферол-3-рамнопиранозид (0,146), 5,7-дигидрокси-3 ,4 -диметоксифлавон (0,411). В скобках приведено каждого флавоноида в мг/100 мг экстракта. Из представленных данных видно, что доминирующим флавоноидом листьев березы является гиперозид.
Рисунок 2. Динамика накопления флавоноидов в листьях березы [71]. В результате проведенных исследований было установлено, что основной максимум содержания суммы флавоноидов наблюдается в конце первой декады июня (5,14 %), затем отмечается тенденция к некоторому снижению содержания этих соединений (3,03 %) - конец июня. В начале июля содержание суммы флавоноидов снова начинает увеличиваться и достигает максимума к концу первой декады июля (4,06 %), причем до конца месяца оно остается довольно высоким. В середине августа содержание суммы флавоноидов опускается ниже нормируемого предела и составляет 1,69 % [71].
Состав флавоноидов и динамика накопления их в листьях двух видов берез - В. pendula и В. pubescens, произрастающих в Татарстане было изучено Г.В. Дёминой с соавторами [14]. Было показано, что доминирующим флавоноидом в листьях обоих видах берез является гиперозид, рутин - не обнаружен. Динамика накопления соответствовала данным полученным в работе В.В. Стеняевой [71], максимальное накопление флавоноидов наблюдалось во второй половине мая, к середине июня содержание флавоноидов снижалось и вновь возрастало к середине июля, еще один подъем отмечался в середине сентября.
Листья березы повислой включены в Европейскую фармакопею. Количественное определение флавоноидов проводится по унифицированной методике, по которой таким же образом определяется содержание флавоноидов еще в нескольких видах сырья. Навеска сырья нагревается 30 минут в ацетоне, содержащем раствор гексаметилентетрамина и хлористоводородную кислоту для гидролиза гликозидов флавоноидов. После фильтрования раствора остаток в колбе дважды экстрагируют порциями ацетона при нагревании по 10 минут. Все ацетоновые извлечения собирают в мерной колбе на 100 мл и доводят объем раствора ацетоном до метки. 20 мл этого раствора переносят в делительную воронку, разбавляют 20 мл воды и извлекают агликоны флавоноидов этилацетатом 4 порциями (15+10+10+10 мл). Аликвоту этого раствора смешивают с раствором хлорида алюминия и уксусной кислоты в метаноле. Через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора при 425 нм. Для расчетов используют удельный показатель поглощения комплекса гиперозида с хлоридом алюминия при 425 нм равный в условиях опыта 500. Содержание суммы флавоноидов нормируется в сырье на уровне не менее 1,5% [113].
В России листья березы как лекарственное сырье стандартизуются по ВФС и ФСП [9, 83, 85]. Во всех трех нормативных документах методика количественного определения флавоноидов одинакова и предполагает двухчасовую экстракции флавоноидов кипящим 50% спиртом. К аликвоте экстракта добавляется раствор хлорида алюминия и через 40 минут измеряется оптическая плотность раствора при 412 нм. Параллельно измеряется оптическая плотность ГСО рутина с хлоридом алюминия. В методике ФСП ОАО «Красногорсклексре детва» [83] допускается использовать для расчетов удельный показатель поглощения этого комплекса равный 248. Содержание суммы флавоноидов нормируется в сырье на уровне не менее 2,0%.
Методы фитохимического анализа
Экспресс-метод количественного определения флавоноидов в траве душицы Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 60% спирта, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут с момента закипания растворителя. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды и фильтруют через бумажный фильтр в мерный цилиндр вместимостью 100 мл (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки; через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 каплю разведенной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора 95% спиртом до метки.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: где D - оптическая плотность испытуемого раствора; 345 - удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с алюминия хлоридом при 400 нм; V - объем раствора А в мерном цилиндре; m - масса сырья в граммах; 1,07 - поправочный коэффициент на неполноту экстракции флавоноидов; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Для определения метрологических характеристик разработанной методики провели 10 параллельных определений (табл. 18), ошибка метода не превышает 2,48%.
Таким образом, истинные значения содержания флавоноидов в исследованных образцах травы душицы находятся, скорее всего, на уровне 1,80%, а не 1,13% как нами было определено по методике фармакопейной статьи [89]. 3.5. Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в траве тимьяна ползучего (чабреца).
Поскольку утвержденных нормативных документов на траву тимьяна ползучего в которых бы предусматривалась стандартизация сырья по содержанию флавоноидов в настоящее время нет, для оптимизации нами была выбрана методика из проекта фармакопейной статьи на траву тимьяна ползучего для включения в ГФ XII издания [63].
Поскольку данная методика предполагает однократную экстракцию флавоноидов травы чабреца в течение 60 минут, нами была проверена полнота извлечения флавоноидов при таком режиме экстракции. Для этого выполнялась методики определения флавоноидов по фармакопейной статье в течение 1 часа и вариант, когда проводилась трехкратная экстракция (40 мл + 30 мл + 30 мл) по 30 минут каждая спиртом той же концентрации. Полученные результаты представлены в таблице 20.
Таким образом, можно констатировать, что однократная экстракция сырья для травы чабреца не обеспечивает исчерпывающего извлечения флавоноидов, оставляя в сырье более 18 % от их общего содержания. При дальнейших расчетах за истинное содержание флавоноидов в сырье чабреца принимались результаты, полученные при дробной трехкратной экстракции.
На следующем этапе исследований была изучена динамика выхода флавоноидов из сырья в зависимости от времени экстракции. Попутно проверялась, является ли оптимальной концентрация спирта, используемая в фармакопейной методике. Во всех случаях использовалось соотношение сырья и растворителя 1:100. Зависимость выхода флавоноидов от концентрации спирта и времени экстракции проверялась в экспериментах минимум в 4-х повторностях.
Поскольку в фармакопейной методике для экстракции используется 70% этиловый спирт, проверялась эта концентрация и крайние концентрации, которые используются для экстрагирования флавоноидов - 40% и 95%. Кроме этого, с учетом близости флавоноидного состава травы чабреца и травы душицы, дополнительно проверялась 60% концентрация спирта, которая оказалась оптимальной для травы душицы. Полученные результаты представлены в таблице 21.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что 70% концентрация этилового спирта является в изученном диапазоне оптимальной.
Для проверки максимума поглощения продуктов реакции флавоноидов травы чабреца с хлоридом алюминия нами были записаны электронные спектры самого извлечения, продуктов реакции флавоноидов с хлоридом алюминия на фоне 95% спирта и на фоне самого извлечения (дифференциальный спектр), представленные на рисунке 16.
Рисунок 16. УФ-спектр спиртового извлечения из травы чабреца. По оси ординат - оптическая плотность; По оси абсцисс - длина волны, нм; 1 (синий) - раствор извлечения на фоне 95% этилового спирта; 2 (розовый) -раствор извлечения в присутствии АІСІз на фоне 95% этилового спирта; 3 (красный) - дифференциальная кривая поглощения (раствор извлечения в присутствии АІСІз на фоне извлечения).
Длинноволновый максимум дифференциального спектра находился на отметке 392 нм, что укладывается в допустимые интервалы отклонений (±5 нм), поэтому все измерения проводились при длине волны указанной в фармакопейной методике - 395 нм.
Как видно из полученных результатов достичь степени экстракции флавоноидов не менее 90% удается достичь лишь при 30 минутной экстракции 70% спиртом. При двукратной экстракции травы чабреца 70% спиртом по 10 минут, удалось извлечь из сырья также 95% всех флавоноидов. Это дало возможность предложить вариант экспресс-методики определения флавоноидов в этом сырье, с использованием поправочного коэффициента на неполноту экстракции.
Разработанная нами методика предполагает экспресс режим двукратной экстракции по 10 минут и для расчета истинного содержания флавоноидов в траве чабреца вводится поправочный коэффициент на неполноту экстракции флавоноидов, равный 1,06.
Оптимизация метода количественного определения флавоноидов в листьях березы повислой
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 70% спирта, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут с момента закипания растворителя. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды и фильтруют в мерный цилиндр вместимостью 100 мл через бумажный фильтр (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 2 мл раствора А, прибавляют 6 мл 2% спиртового раствора А1СЬ и доводят раствор спиртом этиловым 95% до метки (испытуемый раствор). Через 40 минут измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре на максимуме поглощения при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2 мл раствора А и 0,1 мл кислоты уксусной концентрированной, и доведенный спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: D Х ХІООХ 25X1,07 X = 248XmX(100-VK)X2 где D - оптическая плотность испытуемого раствора; 248 - удельный показатель поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом при 408 нм; V - объем раствора А в мерном цилиндре; m - масса сырья в граммах; 1,07 93 поправочный коэффициент на неполноту экстракции флавоноидов; W -потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Для определения метрологических характеристик разработанной методики провели 10 параллельных определений (табл. 27), ошибка метода не превышает 3,7 %.
Для оптимизации мы использовали методику количественного определения флавоноидов из проекта ФС на цветки бессмертника для включения в ГФ РФ XII издания [63]. Поскольку при определении флавоноидов в цветках бессмертника песчаного методика проекта фармакопейной статьи предусматривает однократную экстракцию, нами была проверена полнота извлечения флавоноидов при таком режиме экстракции. Для этого выполнялась методики определения флавоноидов по фармакопейной статье и вариант, когда проводилась трехкратная экстракция (40 мл + 30 мл + 30 мл) по 30 минут каждая спиртом той же концентрации. Полученные результаты представлены в таблице 28.
Таблица 28 Содержание флавоноидов в цветках бессмертника песчаного, % Содержание флавоноидов в цветках бессмертника песчаного, % определенное при однократной экстракции в течение 1 часа определенное при трехкратной экстракции по 30 минут каждая 1,11 ±0,03 1,36 ±0,08 Таким образом, можно констатировать, что однократная экстракция сырья не обеспечивает исчерпывающего извлечения флавоноидов, оставляя в сырье 18 % от их общего содержания. При дальнейших расчетах за истинное содержание флавоноидов в цветках бессмертника песчаного принимались результаты, полученные при дробной трехкратной экстракции.
На следующем этапе для оптимизации экспериментальной работы нами была изучена динамика извлечения флавоноидов в зависимости от времени экстракции. Результаты приведены в табл. 29.
Рисунок 19. Электронный спектр спиртового извлечения из цветков бессмертника песчаного. По оси ординат - оптическая плотность; По оси абсцисс - длина волны, нм; 1 - раствор извлечения на фоне 95% этилового спирта; 2 - раствор извлечения в присутствии А1СЬ на фоне 95% этилового спирта; 3 - дифференциальная кривая поглощения (раствор извлечения в присутствии А1С13 на фоне извлечения).
Длинноволновый максимум дифференциального спектра находился на отметке 415 нм, что укладывается в допустимые интервалы отклонений (±5 нм), поэтому все измерения проводились при длине волны 418 нм, использованной в проекте фармакопейной статьи.
Обобщая полученные результаты можно сказать, что при 10 минутной экстракции цветков бессмертника песчаного 70% спиртом в соотношение к сырью 1:100 можно извлечь 93% всех флавоноидов, что позволяет нам предложить вариант экспресс-методики с введением в расчетную формулу коэффициента на неполноту экстракции.
Аналитическую пробу цветков измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями с размером 2 мм. Около 1,0 г (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 70% спирта этилового. Колбу присоединяют к обратному водяному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут с момента закипания растворителя. Колбу с содержимым искусственно охлаждают до комнатной температуры, и извлечение фильтруют в мерный цилиндр вместимостью 100 мл через бумажный фильтр (раствор А).
Калибровка модели на основе проведенных экспериментов
Из полученных результатов, можно сделать вывод, что оптимальным временем в режиме однократной экстракции водой, является экстракция кипящей водой в течение 10 минут.
Этот режим был положен нами в основу препаративного способа получения флавоноидов из листьев A.cruentus, на основе водной экстракции. В отличие от способа, описанного в патенте [55], нами была опущена стадия очистки водного извлечения этилацетатом, поскольку при изначальной водной экстракции, экстракт будет свободен от ряда липофильных соединений, переходящих в спиртовое извлечение.
Для целей препаративного выделения было взято 100 г сырья, которые были суммарно проэкстрагированы 10 л воды в течение 10 минут при кипении растворителя. Полученный экстракт отфильтровывался и по частям обрабатывался в делительной воронке тремя порциями н-бутанола, общий объем которого равнялся объему обрабатываемого водного экстракта. Полученные бутанольные извлечения объединялись и концентрировались под вакуумом до сухого остатка. Сухой остаток растворялся при нагревании в минимальном объеме воды (100-200 мл) и отфильтровывался на воронке Бюхнера под вакуумом в горячем виде. После охлаждения до комнатной температуры к водному раствору добавляли 1 каплю толуола с целью предотвращения микробной контаминации и оставляли для кристаллизации флавоноидов.
В течение 3-5 дней из раствора выпадал аморфный осадок светло-желтого цвета, который отделяли, промывали холодной водой и высушивали. Общий выход составил 1,2 г.
Качественное исследование полученной фракции методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil» в системе этилацетат-уксусная кислота-вода (5:1:1) показало, что это смесь трех флавоноидов, предположительно рутина, гиперозида и кверцетина, поскольку зоны веществ с желто-зеленой флуоресценцией после опрыскивания хроматограммы 2% спиртовым раствором хлорида алюминия, совпадали по значениям Rf с такими же зонами на участках указанных образцов свидетелей. Для оценки количественного соотношения флавоноидов в полученной смеси мы провели исследование его состава методом ВЭЖХ. Достоверность идентификации пиков на хроматограммах подтверждали использованием в методике анализа соответствующих внутренних стандартных веществ - рутина, гиперозида и кверцетина. Подтверждено, что доминирующим флавоноидом в полученной смеси флавоноидов является рутин, составляя около 87% от их общего содержания, гиперозид составляет примерно 13% от общего содержания флавоноидов, кверцетин присутствует в следовых количествах.
Таким образом, можно констатировать, что предложенным нами способом на основе водной экстракции листьев амаранта багряного была получена сумма флавоноидов - фактически технический рутин, с небольшим содержанием гиперозида и кверцетина.
Амарант багряный (как и другие виды амаранта) является потенциальным лекарственным растением, с одной стороны как источник биологически активных флавоноидов (рутина), с другой стороны жирное масло, получаемое из семян содержит высокие концентрации сквалена, ациклического тритерпена, обладающего среди прочего противоопухолевой активностью. В настоящее время различные виды амарантов применяются, прежде всего, как кормовые и пищевые растения. В Татарстане предприятием ООО «Электрол-Б» производится кормовая добавки из травы амаранта багряного «Экстрафит» применяющаяся в животноводстве. «Экстрафит» получается на основе водных экстрактов из травы амаранта багряного. Нами совместно с ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» были проведены биологические испытания «Экстрафита», суммы флавоноидов, выделенных нами из листьев амаранта багряного, также химически чистого сквалена для выяснения природы биологически активных веществ «Экстрафита» в целях последующей разработки нормативных документах на этот препарат, предусматривающих его стандартизацию по действующим веществам.
Изучалось влияние «Экстрафита», флавоноидов, сквалена, а также высушенного водного остатка из листьев амаранта багряного после выпадения из него суммы флавоноидов на интенсивность роста и иммунобиологические показатели крови белых крыс.
Исследования были проведены в отделе токсикологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» под руководством Шиловой О.В. Для этого взяли 48 белых крыс 70-90-дневного возраста живой массой 70-80 г, которые по принципу аналогов были разделены на 6 групп по 8 голов в каждой. Условия содержания и кормления животных контрольной и опытных групп были одинаковые. Крысам контрольной группы скармливали полнорационный комбикорм. Животным первой опытной группы задавали полнорационный комбикорм (ПК) с добавлением подсолнечного масла. Крысам второй опытной группы комбикорм обогащали препаратом «Экстрафит» в дозе 2 %. Животные третьей опытной группы получали комбикорм, обогащенный флавоноидами, выделенными из листьев амаранта багряногоиз расчета 2 мг/кг живой массы.
Крысам четвертой опытной группы вводили в рацион препарат на основе остаточной фракции после осаждения флавоноидов в дозе 2 мг/кг веса животного. Пятой - масляный раствор сквалена в той же дозе.
В ходе эксперимента изучали клиническое состояние белых крыс, потребление корма, изменения живой массы, проводили иммунологические исследования крови. Иммунный статус подопытных крыс оценивали по количественным и функциональным показателям.
Одним из наиболее значимых показателей, характеризующих рост и развитие животных, является живая масса. Она предопределяется наследственными особенностями и зависит, в первую очередь, от условий кормления и содержания.
Анализ полученных данных (табл. 41 и рис. 30) показывает, что включение в состав рациона кормления крыс подсолнечного масла, кормовой добавки «Экстрафит» и биологически активных веществ амаранта, способ Таблица 41 Живая масса подопытных белых крыс, г (М±т)