Синтез 1-[3- и 4-(фенокси)бензил]производных 5-(фениламино)урацила и их аналогов как потенциальных ингибиторов вирусной репродукции Гуреева Елена Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Характеристика вируса гепатита С и современные аспекты терапии ВГС-инфекции 10

1.1. Инфекция вируса гепатита С 10

1.2. Строение вириона гепатита С 12

1.3. Организация генома ВГС 13

1.4. Жизненный цикл ВГС 16

1.5. Генотипы ВГС 18

1.6. Современная терапия ВГС-инфекции 19

1.7. Альтернативные подходы в терапии вирусных инфекций 26

Глава 2. Обсуждение полученных результатов 36

2.1. Синтез производных 5-(фениламино)урацила, содержащих 3-фенокси- и 4-феноксибензильный фрагменты в положении 1

2.2. Синтез 1-(-феноксиалкил)-5-(фениламино)урацилов 41

2.3. Синтез производных 5-(фениламино)урацила, содержащих в положении 1 качестве заместителя диарильный фрагмент 47

2.4. Синтез 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(фениламино)-6-азаурацилов 48

2.5. Синтез 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(морфолино)- и 5-(бензиламино)урацила 50

2.6. Синтез 1-[-(фенокси)алкил]производных 5-(морфолино) урацила 51

2.7. Синтез 1-[4-(фенокси)бензил]-3-бензил-5-(фениламино)- урацила

Глава 3. Экспериментальная часть 55

3.1. Общий метод синтеза 5-(фениламино)урацилов 55

3.2. Общий метод синтеза 1-[4-(фенокси)бензил]- и 1-[3 (фенокси)бензил]-5-(фениламино)урацилов 56

3.3. Общий метод синтеза 1-[-(фенокси)алкил]-5-(фениламино) урацилов з

3.4. Синтез 1-[4-[2-(фенокси)этокси]бензил]-5-(фениламино) урацила 63

3.5. Синтез 1-(4-бензоилбензил)-5-(фениламино)урацила 63

3.6. Синтез 1-(4-фенилбензил)-5-(фениламино)урацила 64

3.7. Синтез 1-[4-[гидрокси(фенил)метил]бензил]-5-(фениламино) урацила 65

3.8. Общий метод синтеза 5-(фениламино)-6-азаурацилов 65

3.9. Общий метод синтеза 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(фениламино)-6-азаурацилов

3.10. Синтез 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(бензиламино)урацила 67

3.11. Общий метод синтеза 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(морфолино)-урацилов 67

3.12. Общий метод синтеза 1-[-(фенокси)алкил]-5-бромурацилов 69

3.13. Общий метод синтеза 1-[-(фенокси)алкил]-5-(морфолино)-урацилов 70

3.14. Синтез 1-[4-(фенокси)бензил]-3-бензил-5-(фениламино) урацил 71

Глава 4. Подтверждение структуры полученных соединений с помощью ЯМР-спектроскопии 73

Глава 5. Изучение противовирусной активности синтезированных соединений 86

5.1. Активность в отношении ВГС 86

5.2. Активность в отношении аденовируса человека типа 5 94

Заключение

• Организация генома ВГС
• Синтез 1-(-феноксиалкил)-5-(фениламино)урацилов
• Общий метод синтеза 1-[-(фенокси)алкил]-5-(фениламино) урацилов
• Общий метод синтеза 1-[-(фенокси)алкил]-5-бромурацилов

Организация генома ВГС

Белки ВГС. Сore-белок (С-белок) формирует вирусный капсид. Данный белок оказывает влияние на клеточную трансформацию. Белок участвует в клеточной пролиферации и развитии ГЦК [102].

Белки E1 и E2 обеспечивают распознавание клетки-хозяина, прикрепление вириона к ней и его проникновение в цитоплазму. Небольшой полипептид Р7 регулирует способность структурных белков ВГС проникать в цитоплазму клеток [187]. Доказано, что он является фактором инфекционности вирусных частиц [97].

Основной функцией белков NS2 и NS3 является протеолитический процессинг неструктурных белков ВГС. При этом эти белки образуют две функциональных протеазы (NS25NS3 и NS3). NS25NS3 является цинк зависимой металлопротеазой [10]. Образующийся в результате автокатализа белок NS2, по-видимому, не несет самостоятельной биологической функции (или эта функция еще не определена). NS3 представляет собой полифункциональный белок, обладающий двумя каталитическими активностями. Его N-концевой домен представляет собой протеазу, осуществляющую процессинг С-концевых неструктурных белков ВГС [10, 69]. Белок NS3 обладает РНК-хеликазной и РНК-стимулируемой нуклеозидтрифосфатазной активностями. NS4A – маленький белок размером 54 аминокислотных остатков, является кофактором NS3 протеиназы [10].

NS4B представляет собой гидрофобный белок с молекулярной массой 27 кДа [145]. К настоящему времени показано, что он является одним из факторов, необходимых для гиперфосфорилирования NS5A [134, 165], вызывает ингибирование вирусной трансляции [104]. Кроме того, данный неструктурный белок является отрицательным регулятором комплекса NS5B5-NS3 и, тем самым, оказывает влияние на репликацию ВГС [158].

Белок NS5A представляет собой цинк-содержащий [216] фосфопротеин. Он принимает участие в репликации ВГС, являясь компонентом репликационного комплекса [86]. В экспериментах in vitro NS5A связывался с вирусной РНК-полимеразой (NS5B), что приводило к ингибированию последней [100]. NS5A, по-видимому, играет ключевую роль в опосредовании эффектов интерферона . Один из механизмов вирусной устойчивости к интерферону заключается в ингибировании интерферон-индуцируемой протеинкиназы, являющейся медиатором вызванного интерфероном антивирусного действия [105, 190].

Белок NS5B (м.в. 65 кДа) является РНК-зависимой РНК полимеразой. NS5B является основным компонентом репликативного комплекса ВГС, полный состав которого пока не определен [10].

ВГС заражает клетки печени на уровне 108-1011 копий ВГС РНК на грамм ткани. Недавние исследования указывают, что ВГС может инфицировать Т-клетки, В-лимфоциты, дендритные клетки и клетки центральной нервной системы [162] подобно другим одноцепочечным РНК-содержащих вирусам. Полимеразе ВГС не хватает способности исправления ошибок во время репликации. NS5B повторяет РНК ВГС с долей ошибок 10-2 - 10-3 нуклеотидных замен на сайт в год [146]. Благодаря высокой скорости репликации и отсутствию корректурной способности NS5B, геном ВГС имеет генетическую изменчивость, что делает его сложным для разработки лекарственных средств против гепатита.

Начальный этап жизненного цикла начинается с узнавания вирусом клеток-мишеней с последующим прикреплением вириона к специфическим клеточным рецепторам (рисунок 4). Затем происходит эндоцитоз вириона и декапсидация вирусного нуклеокапсида, которая протекает при кислом значении рН внутри эндосомы. Адсорбция и вход вируса в клетку является результатом сложного взаимодействия между оболочечными гликопротеинами E1 / E2 и клеточными рецепторами [187]. Этот процесс освобождает одноцепочечную (+)-РНК в цитоплазму, где она выступает в роли матричной РНК для трансляции полипротеина-предшественника ВГС. Протеазы клетки-хозяина нарезают его структурные белки ВГС: core-белок и оболочечные гликопротеины (E1, E2). Сore-белок формирует нуклеокапсид, несущий E1 и E2, которые являются рецепторами для прикрепления вируса к клетке и его входа в цитоплазму. Комбинация вирусных и клеточных протеаз обрабатывает 6 неструктурных белков (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B), чьи ферментативные функции являются обязательными для жизненного цикла ВГС. NS2 и NS3 представляют собой вирусные протеазы, необходимые для процессинга полипротеина ВГС [13].

NS5B является РНК-зависимой РНК-полимеразой, ответственной за синтез негативной цепи РНК комплементарной положительной цепи РНК-генома. С дополнительной цепи (-)-РНК производятся множественные молекулы (+)-РНК и используются в качестве матричных РНК для производства полипротеина, как новые шаблоны для отрицательного синтеза цепи, и как геномной РНК в новые вирусные частицы [13].

Синтез 1-(-феноксиалкил)-5-(фениламино)урацилов

Исходные 5-(фениаламино)урацилы 2-9 были получены в соответствии с ранее описанным методом [93] (схема 1). Исходный 5-бромурацил (1) обрабатывали трехкратным молярным избытком анилина при кипячении в растворе этиленгликоля, что вело к соответствующим 5-(фенил-амино)урацилам 2-9. 3- и 4-(Фенокси)толуолы 17-24 были получены в условиях реакции Ульмана. Область применения классической реакции Ульмана, основанная на взаимодействии фенолята с арилгалогенидами, сильно ограничена, прежде всего, неблагоприятными условиями. К ним относятся высокая температура (до 200-250 С), большой избыток одного из реагентов и стехиометрические количества соли меди, которая используется в качестве катализатора [49, 90, 136, 144, 147]. Однако в последние годы были разработаны методы, позволившие с успехом проводить реакцию Ульмана в более мягких условиях. Главным достижением стало использование лигандов, которые способны образовывать с катионом меди прочный комплекс и увлекать его в жидкую фазу. Таким образом, катализ превращается из гетерогенного (как в случае классической реакции Ульмана) в гомогенный. Так, было описано использование катализатора Cul (10 мольных %) и 1,10-фенантролин, что позволило снизить температуру реакции до 110 С [225]. Однако в данных условиях реакция успешно протекала только с арилиодидами. Были также описаны другие способы получения диариловых эфиров, в которых использовали в качестве катализатора Cul и лиганды 1-бутилимидазол [52], тетраметилгептандиол [149, 219], пиколиновую кислоту [152], ацетилацетонат железа (III) [148] или тетрабутиламмоний бромид [68]. Однако описанные результаты имели плохую воспроизводимость. Большой интерес вызвали методы конденсации, основанные на использовании в качестве лиганда 8-гидроксихинолин [32, 67, 223]. Доступность реагентов, хорошая воспроизводимость и комфортные условия реакции предопределили выбор данного подхода для синтеза 3- и 4-(фенокси)толуолов 17-24.

В соответствии с описанными методами [32, 67, 223] исходный фенол 10-16 в растворе толуола обрабатывали эквимолярным количеством трет-бутилата калия, образующийся при этом фенолят калия нагревании при 140С с м-бром- или п-бромтолуолом в присутствии каталитического количества иодида меди (I) и 8-оксихинолина, который выполнял роль лиганда, что давало соответствующие фенокситолуолы 17-24, выход которых после перегонки в вакууме составил 70-75% (схема 2).

Схема 2. R2 = Н, ОСН3, t-Bu, Br, CI, F, N02 Следующим этапом явилось получение 3-(фенокси)- и 4-(фенокси)-бензилбромидов 25-32. Бромирование боковой цепи алкиларенов протекает по радикальному цепному механизму. Преимущественно используют неполярные растворители. Существует несколько методов введения атома брома в боковую цепь. В литературе описан метод бромирования метильной группы толуолов с помощью системы CuBr2/t-BuOOH в уксусной кислоте или уксусном ангидриде [59]. Mestres и Palenzuela предложили использование NaBr/H2O2 в растворе четыреххлористого углерода или хлороформа. При этом выходы продуктов бромирования составили 60-90% [157]. Также были описаны методы бромирования с помощью N-бромсукцинимида (NBS) [70, 96, 108, 191, 204]. Эти реакции протекают в мягких условиях и катализируются дибензоилпероксидом, 2,2 -азобисизобутиронитрилом или светом. Кроме того, широко используются в качестве бромирующих агентов бромиды четвертичных аммониевых солей: пиридиния трибромид [179, 180, 193, 198,], 3-метилимидазолия трибромид [62], 1,3-ди-н-бутилимидазолия трибромид [57], бензимидазолия бромхромат [167], хинолина бромхромат [166], гексаметилентетрамина трибромид [53], 4-(диметиламино)пиридиния трибромид [45], этиленбис-(N-метилимидазолия) дитрибромид [83]. Указанные методы эффективны, однако имеют свои недостатки. В первую очередь следует указать на то, что целевые бензилбромиды загрязнены продуктами окисления толуолов, продуктами более глубокого бромирования в боковые цепи и/или бромирования в ароматическое ядро, а так же самим бромирующим агентом и продуктами его превращений. Также к существенным недостаткам следует отнести неудовлетворительную скорость реакции и температурный режим. В литературе описан метод, в значительной степени лишенный указанных недостатков – бромирование боковых алкильных цепей молекулярным бромом в растворе четыреххлористого углерода при иницииации реакции облучением светом [109, 199]. Полученные 3- и 4-(фенокси)толуолы 17-24 в растворе кипящего четыреххлористого углерода обрабатывали бромом в соответствии с известным методом [109], что вело к образованию соответствующих З-(фенокси)- и 4-(фенокси)бензилбромидов 25-32, которые без дополнительной очистки использовали в конденсации с силилированными производными 5-(фениламино)урацилов 33-40 (схема 3).

Известно, что силильный вариант реакции Гилберта-Джонсона широко применяется для синтеза различных нуклеозидных и ациклонуклеозидных аналогов путем конденсации высокореакционноспособных интермедиатов с 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидинами в мягких условиях (комнатная температура). Такими реагентами являются -галоидэфиры [185, 210, 221] и галогенозы [196, 207, 209]. В противоположность этому, использование менее реакционноспособных алкилирующих агентов требует применения более жестких условий. В частности, конденсация 2,4-бис(триметил-силилокси)пиримидинов с аллилбромидом [115, 217], пропаргилбромидом [138], 1,4-дихлорбутином [173], бензилбромидом [132, 153] или 1,3-бис-(бромметил)бензола [ПО] с успехом протекала в кипящем 1,2-дихлорэтане. При этом образовывались исключительно г -алкилированные производные урацила, что является существенным преимуществом данной реакции и позволяет избежать хроматографической очистки целевых продуктов. Это явилось основанием для выбора метода введения (фенокси)бензильного фрагмента в 5-(фениламино)урацил.

Конденсация силилированных производных 5-(фениламино)урацилов (33-40) с 3-(фенокси)- и 4-(фенокси)бензилбромидами 25-32 в растворе кипящего безводного 1,2-дихлорэтана в течение 25-30 ч вело к целевым продуктам 41-58, выход которых составил 60-82% (схема 4) [3, 4, 6, 20, 22].

Общий метод синтеза 1-[-(фенокси)алкил]-5-(фениламино) урацилов

ЯМР-спектроскопия (спектроскопия ядерного магнитного резонанса) является методом исследования химических объектов, использующий явление ядерного магнитного резонанса. Практически для исследуемых веществ применимыми являются спектроскопия протонного магнитного резонанса (1Н ЯМР-спектроскопия), а также спектроскопия ЯМР на ядрах углерода-13 (13C ЯМР-спектроскопия). Резонансная частота, энергия абсорбции и интенсивность испущенного сигнала пропорциональны силе магнитного поля. В зависимости от местного электронного окружения, разные протоны в молекуле резонируют на разных частотах. Это смещение преобразуется в независимую от магнитного поля безразмерную величину, известную как химический сдвиг. Химический сдвиг определяется как относительное смещение сигнала при сравнении с эталонными образцами. Так как химический сдвиг зависит от химического строения вещества, он применяется для получения структурной информации о молекулах в образце. Полезную информацию для определения структуры в ЯМР-спектре даёт так называемое спин-спиновое взаимодействие между активными ЯМР-ядрами. Это взаимодействие возникает в результате переходов между различными спиновыми состояниями ядер в молекулах, что приводит к расщеплению сигналов ЯМР [7, 9]

Многообразие структурной информации спектров ЯМР практически исключает совпадение спектров разных соединений. В связи с этим метод спектроскопии ЯМР применяется для идентификации веществ и доказательства строения соединений. Спектры 1Н и 13C ЯМР предоставляют обширную информацию о химической структуре анализируемого вещества. Положение сигналов резонанса в спектре, их тонкая структура и площади позволяют определить число атомов водорода и углерода в отдельных группах, ближайшее химическое окружение, сочленение отдельных структурных фрагментов молекулы, наличие примесей [8, 12].

Спектры ЯМР могут быть использованы для количественного определения относительного или абсолютного содержания вещества в анализируемом объекте и количественного определения примесей. Последнее указывает на чистоту образца [19]. Структура всех синтезированных соединений была подтвеждена 1H ЯМР-спектрами. В качестве примера приведены спектры некоторых соединений, являющихся представителями каждого ряда, описанного в данной работе. В спектрах 1Н ЯМР соединений сигналы протонов проявляются в ожидаемых областях. Их химические сдвиги, мультиплетность и интегральная интенсивность протонов остатка урацила, ароматических фрагментов соответствуют расчетным значениям. В качестве примера были выбраны 1-[4-(фенокси)бензил]-5 (фениламино)урацил (45) и его производные, проявившие высокую противовирусную активность. Расположение ароматических протонов в структуре соединения 45 представлено на рисунке 12.

Расположение протонов в ароматических фрагментах в соединении 45 Сигналы протонов метиленовой группы проявляются в виде двупротонного синглета с величиной химического сдвига 4,90 м.д. Протон, расположенный в положении 6 остатка урацила проявляется в виде однопротонного синглета с величиной химического сдвига 7,74 м.д. Ароматический протон, расположенный в пара-положении фениламинного фрагмента (4 ) проявляется в виде однопротонного триплета с величиной химического сдвига 6,69 м.д. и константой спин-спинового взаимодействия 7,3 Гц. Протоны, расположенные в орто-положениях фениламинного фрагмента в положениях 2 и 6 проявляются в виде двухпротонного дублета дублетов с величиной химического сдвига 6,79 м.д. и константами спин-спинового взаимодействия 8,7 и 1,0 Гц. Остальные ароматические протоны дают сложные мультплеты в областях 6,98-7,18 и 7,35-7,43 м.д. Протон у атома азота в положении 3 остатка урацила дает однопротонный синглет с величиной химического сдвига 11,61 м.д. (рисунок 13).

В случае 1-[4-(фенокси)бензил]-5-[(3,5-диметилфенил)амино]урацила (50) (рисунок 14) на 1Н ЯМР-спектре (рисунок 15) появляются сигналы метильных групп, протоны которых проявляются в виде шестипротонного синглета с величиной химического сдвига 2,12 м.д. Сигналы протонов метиленовой группы проявляются в виде двупротонного синглета с величиной химического сдвига 4,89 м.д. Протон, расположенный в положении 6 остатка урацила проявляется в виде однопротонного синглета с величиной химического сдвига 7,68 м.д. Ароматический протон, расположенный в пара-положении фениламинного фрагмента (4 ) проявляется в виде однопротонного синглета с величиной химического сдвига 6,32 м.д., а сигналы протонов в орто-положении (2 и 6 ) зарегистрированы в виде двухпротонного синглета с величиной химического сдвига 6,36 м.д. Water

ЯМР-спектр 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(фениламино)урацила (45) Протон в пара-положении феноксильного фрагмента проявляется в виде однопротонного дублета триплетов с величиной химического сдвига 7,15 м.д. и константами спин-спинового взаимодействия 7,5 и 0,8 Гц. Также на спектре зафиксирован однопротонный синглет протона аминогруппы в положении 5 остатка урацила, химических сдвиг который равен 6,84 м.д. Остальные ароматические протоны дают сложные четырехпротонные мультплеты в областях 6,99-7,02 и 7,36-7,41. Протон у атома азота в положении 3 остатка урацила дает однопротонный синглет с величиной химического сдвига 11,59 м.д. (рисунок 15).

Общий метод синтеза 1-[-(фенокси)алкил]-5-бромурацилов

Из литературных данных известно, что неструктурный белок NS5A представляет собой кофактор созревания вирионов ВГС [79, 227]. Взаимодействие NS5A с core-белком HCVcc-JFH1 на поверхности липосом является важнейшей ступенью созревания. В связи с этим следующим этапом исследования явилось изучение влияния соединений-лидеров на перемещение core-белка к поверхности липосом. Локализацию NS5A HCVcc-JFH1 оценивали иммунофлюоресцентной конфокальной микроскопией. Клетки Huh7.5 культивировали с HCVcc-JFH1 в течение 72 часов перед нанесением иммунофлюоресцентной маркировки на белок NS5A. Как и ожидалось, белок NS5A локализован в структурах, распределенных в цитоплазме в непосредственной близости от липосом. В противоположность этому, в инфицированных клетках, обработанных соединением 97, белок

NS5A был локализован на краю липосом. На рисунок 25 показано, что в инфицированных клетках, обработанных соединениями-лидерами, количество липосом существенно ниже [66, 128]. Следовательно, соединения-лидеры способны нарушать транспорт компонентов вириона. Рисунок 25. Соединение 97 перемещает NS5A HCVcc-JFH1 к краю липосом Таким образом, нами обнаружена серия соединений, обладающая уникальным механизмом действия в отношении вируса гепатита С. Соединения-лидеры способны ингибировать в микромолярных концентрациях распространение вируса от клетки к клетке, блокировать транспорт компонентов вириона и самосборку вирусных частиц (рисунок 26). Рисунок 26. Механизм действия соединения-лидера 97

Это первый пример блокаторов подобного типа, которые могут найти широкое применение в комплексной терапии инфекции гепатита С.

Аденовирус человека (АДВ) является безоболочечным, ДНК содержащим вирусом и относится к семейству Adenoviridae рода Mastadenovirus [87]. Идентифицировано семь видов (A - G) и пятьдесят два серотипа [143]. Виды А, В, С, D и Е распространены на глобальном уровне и были причастны к вспышкам инфекций [194].

Аденовирусы (АДВ) вызывают инфекции верхних и нижних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, конъюнктивит [29, 129]. Гораздо реже АДВ-инфекция проявляется в виде геморрагического цистита, гепатита, геморрагического колита, панкреатита, нефрита, или энцефалита. Аденовирусная инфекция чаще встречается у детей младше 4 лет, в связи с отсутствием гуморального иммунитета [129], а также у пациентов с ослабленным иммунитетом (например, реципиенты органов, ВИЧ инфицированные, врожденные иммунодефицитные синдромы) [29]. Смертность от тяжелой АДВ-пневмонии или диссеминированного заболевания может превышать 50% [129].

В настоящее время ни один противовирусный препарат не был одобрен для лечения АДВ-инфекции [80]. Ганцикловир in vitro показал противовирусную активность в отношении АДВ, но не применяется для лечения АДВ-инфекций [129]. Рибавирин, обладает широким спектром противовирусной активности в отношении ДНК и РНК-содержащих вирусов [91]. Однако в клинических исследованиях он оказался неэффективнным [81], Цидофовир (ингибитор ДНК-полимеразы) проявляет наибольшую анти-АДВ активность in vitro и является наиболее предпочтительным терапевтическим агентом. Тем не менее, этот препарат доступен только внутривенно, что ограничивает его применение [129, 151].

В настоящее время, АДВ-инфекции получили широкое распространение в результате того, что увеличилось количество людей с низким иммунным статусом. В связи с этим, поиск новых лекарственных средств, обладающих анти-АДВ активностью является актуальной задачей.

Исследования противовирусных свойств в отношении аденовируса человека 5 типа проводились совместно с д.б.н. Прасоловым В.С. (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г. Москва) на культуре клеток мелкоточечного рака легкого, которые были инфицированы аденовирусом человека 5 типа. Скринингу подверглись 4 соединения (45, 82, 83 и 87). Результаты исследований представлены в таблице 10. Три из четырех соединений показали выраженную вирусингибиторную активность на микромолярном уровне и низкую цитотоксичность. Набольший интерес представляет соединение 87 – 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(морфолино)урацил, которое блокировало репликацию аденовируса в концентрации EC50 0,5 M. При этом за счет низкой цитотоксичности соединение имеет высокий индекс селективности, который превышает 200. Соединения 82 и 83, являющиеся производными 6-аза-5-(фениламино)урацила, проявили заметно более низкую противовирусную активность: они блокировали репликацию АДВ в концентрациях EC50 15 и 20 М соответственно [16, 28]. На основе полученных результатов можно сделать вывод о том, что наличие морфолина в положении 5 пиримидинового цикла приводит к увеличению ингибирующей активности в отношении АДВ. И наоборот введение в состав молекулы атома азота в положение 6 остатка урацила и фениламинного фрагмента в положение 5 ведет к понижению противовирусных свойств.