Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Номенклатура лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения 14
1.2. Нежелательные реакции иммуноглобулинотерапии, связанные с влиянием на систему гемостаза и систему комплемента 19
1.3. Активация системы комплемента как механизм реализации эффективности и безопасности иммуноглобулинотерапии 21
1.4. Антикомплементарная активность – параметр специфической безопасности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения 27
1.5. Анализ современного состояния проблемы стандартизации лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека по антикомплементарной активности 35 Выводы из обзора литературы 40
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы 41
2.2. Методы 45
Глава 3. Разработка стандартного образца для определения антикомплементарной активности 60
3.1. Стандартизация методики определения антикомплементарной активности 60
3.1.1. Изучение влияния компонентов гемолитической системы и исходного значения рН лекарственных препаратов иммуноглобулина на результат определения антикомплементарной активности 60
3.1.2. Изучение влияния комплемента морских свинок на результат определения антикомплементарной активности 63
3.1.3. Оценка возможности использования желатин-солевого раствора в
качестве альтернативы желатин-барбиталового буферного раствора 68
3.2. Валидация оптимизированной методики определения антикомплементарной активности 70
3.3. Определение требований к стандартному образцу для определения антикомплементарной активности 80
3.4. Выбор кандидата в стандартный образец для определения антикомплементарной активности
3.4.1. Изучение возможности использования лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения в качестве кандидата в стандартный образец для определения антикомплементарной активности 82
3.4.2. Изучение возможности использования лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутримышечного введения в качестве кандидата в стандартный образец для определения антикомплементарной активности 83
3.4.3. Изучение возможности использования подвергшихся нагреванию лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека в качестве кандидата в положительный контроль стандартного образца для определения антикомплементарной активности 85
3.5 Получение стандартного образца для определения антикомплементарной активности 88
Выводы по главе 3 88
Глава 4. Аттестация стандартного образца для определения антикомплементарной активности
4.1. Установление значений аттестуемой характеристики стандартного образца и ее неопределенности (погрешности) 90
4.2. Изучение стабильности стандартного образца и установление срока годности 93
Выводы по главе 4 98
Заключение
Общие выводы Список литературы
- Активация системы комплемента как механизм реализации эффективности и безопасности иммуноглобулинотерапии
- Изучение влияния компонентов гемолитической системы и исходного значения рН лекарственных препаратов иммуноглобулина на результат определения антикомплементарной активности
- Изучение возможности использования лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения в качестве кандидата в стандартный образец для определения антикомплементарной активности
- Изучение стабильности стандартного образца и установление срока годности
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Лекарственные препараты (ЛП) иммуноглобулинов человека для внутривенного введения (ИГВВ) являются неотъемлемой частью схем терапии иммунодефицитных состояний и аутоиммунных заболеваний, а также широко используются для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций (Анастасиев В.В., 1997, Шарыгин С.Л., 1997, Radosevich M. et al., 2010). К ЛП ИГВВ предъявляются высокие требования специфической безопасности при условии сохранения терапевтической эффективности. Специфическая безопасность ЛП ИГВВ является характеристикой препарата, основанной на сравнительном анализе его эффективности и риска причинения вреда здоровью, связанного с влиянием на системы гемостаза, калликреин-кининовую и систему комплемента.
Одним из аспектов побочного действия ЛП ИГВВ является спонтанная активация системы комплемента. Клинически это проявляется одышкой, дрожью и в редких случаях реакциями анафилактического и анафилактоидного типа. Указанные реакции обусловлены присутствием в ЛП агрегированных и поврежденных при фракционировании молекул иммуноглобулина, на Fc-участке которых происходит спонтанная активация комплемента, что приводит в свою очередь к активации макрофагов и высвобождению вазоактивных субстанций (Bleeker W.K., 1987, Buchacher A. et al., 2010, Анастасиев В.В., 1998). Показателем специфической безопасности ЛП ИГВВ, характеризующим указанное побочное действие, является «Антикомплементарная активность».
Согласно рекомендациям экспертов Всемирной организации
здравоохранения (ВОЗ), все серии ЛП ИГВВ подлежат обязательному испытанию на антикомплементарную активность (Материалы ВОЗ, 1992), т.к. ее уровень in vitro имеет значение для прогноза возможных нежелательных реакций ЛП in vivo.
Антикомплементарная активность (АКА), не превышающая 50 % (что соответствует не более 1 СН50/мг белка), позволяет предотвратить возможное возникновение нежелательных реакций при внутривенных инфузиях ЛП иммуноглобулинов и обеспечить их терапевтическую эффективность.
У различных ЛП ИГВВ, производимых в мире, существенно различаются показатели АКА и модификации метода ее определения, кроме того, методика сопряжена с рядом критических параметров (Romer J., 1982, Buchacher A. et al., 2010), связанных с использованием биологических реагентов, таких как, комплемент морских свинок, эритроциты барана и гемолитическая сыворотка. Использование стандартного образца (СО) подтверждает достоверность получаемых результатов в различных диапазонах значений АКА.
Степень разработанности темы исследования. В производстве
большинства зарубежных ЛП ИГВВ для стандартизации методик контроля готового ЛП применяются международные СО. В настоящее время в мировой практике применяют СО иммуноглобулина человека BRP серия 1 (Y0001504), который является СО Европейской фармакопеи (ЕФ) (Sandberg E., 1996, Sandberg E. et al., 2001, 2006, 2012). ВОЗ настоятельно рекомендует использование национальных (отечественных) СО (Материалы ВОЗ, 2011). В Российской Федерации исследования по разработке национального СО для определения АКА отсутствуют.
Использование национальных СО более целесообразно с экономической точки зрения для производства и оценки качества при подтверждении соответствия требованиям нормативной документации. Кроме того, указанные СО могут применяться для аттестации СО предприятия. В связи с вышеизложенным разработка СО для определения АКА представляет значительный научный и практический интерес.
Цель исследования: разработка стандартного образца для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения.
Задачи исследования:
1. Провести научный анализ современного состояния проблемы
стандартизации лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека по антикомплементарной активности.
-
Стандартизовать методику определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения, используемую отечественными производителями, и разработать общую фармакопейную статью.
-
Определить требования к стандартному образцу для определения антикомплементарной активности.
-
Обосновать выбор кандидата и получить стандартный образец для определения антикомплементарной активности.
-
Провести аттестацию стандартного образца для определения антикомплементарной активности и разработать комплект нормативно-технической документации на него.
Научная новизна результатов исследования. Впервые в Российской
Федерации стандартизована методика определения антикомплементарной
активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для
внутривенного введения. Показана необходимость использования пулированного
комплемента морских свинок и возможность применения желатин-солевого
раствора в стандартизованной методике определения АКА. Впервые в Российской
Федерации разработан и аттестован СО для определения АКА лекарственных
препаратов ИГВВ (ОСО 42-28-430). Получен патент на изобретение «Способ
получения положительного контроля стандартного образца иммуноглобулина
человека для определения антикомплементарной активности препаратов
иммуноглобулинов человека, и стандартный образец иммуноглобулина человека
для определения антикомплементарной активности препаратов
иммуноглобулинов человека» № 2577703, приоритет от 09.02.2015, что
подтверждает новизну, изобретательский уровень и промышленную
применимость созданного технического решения.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Общая фармакопейная статья (ОФС) «Определение антикомплементарной активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения» внедрена в систему государственной стандартизации в области
контроля качества инфузионных препаратов иммуноглобулинов человека
(Государственная Фармакопея РФ XIII издания, ОФС.1.8.2.0007.15).
Фармакопейная статья «Иммуноглобулин человека нормальный для
внутривенного введения» (ФС.3.3.2.0008.15) предусматривает определение АКА по разработанной ОФС.1.8.2.0007.15.
В результате выполнения работы получена и аттестована серия СО для определения АКА (ОСО 42-28-430). Использование разработанного СО для определения АКА производителями ЛП ИГВВ и учреждениями, проводящими экспертизу и контроль качества лекарственных средств, позволит получать достоверные значения АКА, необходимые для прогноза их клинического применения. СО для определения АКА может быть применен для аттестации СО предприятия.
Материалы работы реализованы разработкой «Инструкции по применению
стандартного образца иммуноглобулина человека» и проекта Методических
рекомендаций по изготовлению и контролю стандартного образца
иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности.
Практическая значимость подтверждена актом о внедрении результата интеллектуальной деятельности № 6/ИЗ-2577703 от 20.04.2016. СО для определения АКА применяется при проведении исследований по подтверждению соответствия требованиям нормативной документации, а также в рамках проведения экспертизы качества ЛП по заданиям Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Фармакопейная методика определения антикомплементарной активности, обеспечивающая получение достоверных и сопоставимых с международными стандартами значений антикомплементарной активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения.
-
Способ получения положительного контроля стандартного образца для определения антикомплементарной активности лекарственных препаратов
иммуноглобулинов человека, основанный на термической обработке образца с последующим охлаждением и определением антикомплементарной активности.
3. Стандартный образец, представляющий собой раствор иммуноглобулина человека с аттестованными значениями антикомплементарной активности 78,2±4,6 % для положительного контроля, 41,5±3,6 % для отрицательного контроля и содержанием белка 102±1,8 мг/мл (степень достоверности 95 %).
Методология и методы исследования. Методология исследования заключалась в выборе оптимальных условий определения АКА, валидации оптимизированной методики, изучении антикомплементарных свойств ЛП иммуноглобулинов до и после термической обработки, аттестации СО.
В ходе выполнения работы были применены реакция связывания
комплемента при определении антикомплементарных свойств ЛП
иммуноглобулинов человека, колориметрический метод с биуретовым реактивом
при определении содержания белка, метод высокоэффективной жидкостной
хроматографии с УФ-спектрофотометрическим детектированием при
определении молекулярно-массового распределения молекул иммуноглобулина, а также общенаучные методы: обобщения, экспериментальный (сравнения), формальной логики, ретроспективный анализ.
Степень достоверности результатов. Для проведения экспериментальных работ использовано современное оборудование с действующими свидетельствами о поверке/аттестации/калибровке; проведена валидация аналитической методики; математическая обработка данных проводилась на персональном компьютере в Windows 7 с использованием редактора Microsoft Officе Excel 2007. Анализ полученных результатов с применением методов статистической обработки позволяет считать их достоверными.
Апробация результатов исследования. Основные результаты
диссертационной работы доложены и обсуждены на III научно-практической конференции молодых ученых «Приоритетные направления развития экспертной деятельности в области обращения лекарственных средств» (Москва, 2014); III научно-практической конференции с международным участием «Актуальные
проблемы фармацевтической технологии и биофармации» (Москва, 2014); IV научно-практической конференции молодых ученых «Научно-методические подходы оценки качества, эффективности и безопасности лекарственных средств в Российской Федерации» (Москва, 2015); XV Всероссийском научном форуме с международным участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2015); Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Достижения современной фармакологической науки» (Рязань, 2015); межкафедральном заседании кафедр фармацевтической технологии и фармакологии Института профессионального образования (ИПО), аналитической токсикологии, фармацевтической химии и фармакогнозии ИПО, фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России с участием приглашенных ученых из Испытательного центра экспертизы качества МИБП, Испытательного центра экспертизы качества ЛС, Центра экспертизы и контроля МИБП, Центра экспертизы и контроля готовых ЛС ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (26 мая 2016 г.).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе
направления исследования, получении экспериментальных данных, их
интерпретации и обобщении полученных результатов. Во всех работах, выполненных в соавторстве, автору принадлежит решающая роль в постановке задач, проведении экспериментальных исследований, анализе полученных результатов. Вклад автора в сборе, анализе и обобщении результатов является определяющим. Диссертация и автореферат написаны лично автором.
Внедрение результатов исследования. СО для определения АКА применяется при проведении исследований по подтверждению соответствия требованиям нормативной документации, а также в рамках проведения экспертизы качества ЛП по заданиям Министерства здравоохранения Российской Федерации (Акт о внедрении результата интеллектуальной деятельности № 6/ИЗ-2577703 от 20.04.2016).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, в частности, пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь темы диссертационной работы с планом научных работ
учреждения. Диссертационная работа выполнена в рамках научно-
исследовательской работы по темам «Научное обоснование методов оценки
качества, эффективности и безопасности иммунобиологических лекарственных
препаратов и их стандартизация» (№ государственной регистрации 01201275293);
«Научное обоснование методических подходов к экспертной оценке
фармакопейных показателей и методов контроля качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01201275290) и «Научное обоснование и разработка методологии экспертизы качества, эффективности и безопасности препаратов крови» (№ государственной регистрации 115111740010).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 6 рисунков и 17 таблиц. Список цитированной литературы включает 146 источников, из которых 74 представлены на иностранных языках.
Активация системы комплемента как механизм реализации эффективности и безопасности иммуноглобулинотерапии
Проведение иммуноглобулинотерапии может быть связано с рядом нежелательных реакций, таких как, активация системы комплемента с образованием анафилатоксинов, активация калликреин-кининовой, плазминовой систем и системы свертывания крови, изменение реологических свойств крови, инициация внутрисосудистого гемолиза и другие [30, 79, 92, 109]. Под термином «нежелательная реакция» подразумевается непреднамеренная неблагоприятная реакция организма, которая может быть связана с применением ЛП [69].
Показателями специфической безопасности ЛП ИГВВ являются «Антикомплементарная активность», «Анти-А и анти-В гемагглютинины», «Анти-D антитела», «Активатор прекалликреина» [66, 104]. В последние годы, в связи с появлением новых данных о возможных тромбоэмболических осложнений иммуноглобулинотерапии, появилась настоятельная необходимость определения контаминации ЛП иммуноглобулинов человека тромбинообразующими агентами. В настоящее время основной рекомендацией международных экспертов является технологическое обоснование отсутствия в готовом ЛП прокоагулянтных факторов. Таким образом, технология изготовления ЛП иммуноглобулинов человека должна обеспечивать отсутствие этих факторов, но как показатель качества готового ЛП они не контролируются.
Частота нежелательных реакций при внутривенном введении ЛП иммуноглобулинов различна, по данным одних авторов варьирует от 1 до 15 %, составляя в среднем менее 5 % [11]. По другим данным, частота нежелательных лекарственных реакций колеблется в более широких пределах – от 11 до 43 % [1, 70]. Нежелательные реакции могут быть связаны с нарушением режима дозирования или скорости введения, большинство их которых удается избежать после уменьшения скорости введения ЛП или временного прекращения инфузий [10, 105, 113]. Пусковыми факторами нежелательных реакций на инфузии ЛП иммуноглобулинов, по мнению отечественных и зарубежных авторов, могут быть специфически агрегированные и поврежденные при фракционировании молекулы иммуноглобулина, различные комплексы антиген-антитело, формируемые в организме при введении ЛП, а также некоторые белковые примеси, вазоактивные ферменты и изогемагглютинины [23, 92, 106, 124].
Многочисленные данные свидетельствуют о том, что иммуноглобулины, полученные промышленными методами фракционирования, обладают антикомплементарными свойствами, что является одной из причин анафилактических реакций, возникающих при введении их внутривенным способом [20, 29, 84, 86]. В то же время применение ЛП для внутривенного введения в лечебной практике более целесообразно, т.к. оно значительно расширяет возможности лечения путем использования увеличенной дозировки ЛП и немедленного его действия.
Проспективные наблюдательные 10-летние исследования (в общей сложности 6357 пациентов всех возрастов получили 92958 инфузий ЛП ИГВВ), проведенные Debes и соавт. (2007) свидетельствовали о том, что частота возникновения нежелательных реакций несколько различалась в зависимости от показаний. Так, например, у пациентов с первичным иммунодефицитом нежелательные реакции возникали в 8,3 % случаев и в 0,5 % инфузий, а у пациентов с вторичным иммунодефицитом нежелательные реакции возникали у 5,0 % пациентов и в 0,62 % инфузий. Чаще всего наблюдались случаи озноба, за ними по частоте встречаемости следовали лихорадка, головная боль, тошнота и приливы. Типы нежелательных реакций различались в зависимости от показаний, так, озноб отмечался в основном у пациентов с вторичным иммунодефицитом, а головная боль – у пациентов с первичным иммунодефицитом и аутоиммунными заболеваниями, включая пациентов с идиопатической тромбоцитопенической пурпурой. Общая частота развития нежелательных реакций составляет 0,35 % [85]. 1.3. Активация системы комплемента как механизм реализации эффективности и безопасности иммуноглобулинотерапии
Система комплемента – один из важнейших факторов иммунной защиты организма и осуществляет: «запуск» и усиление воспалительных реакций; привлечение фагоцитов путем хемотаксиса; выведение иммунных комплексов; клеточную активацию; прямую деструкцию (киллинг) микроорганизмов; участие в продукции антител [44].
Система комплемента представляет собой набор более чем 20 сывороточных белков, активация которых происходит в результате каскада реакций ограниченного протеолиза. В число участников системы включают также клеточные рецепторы фрагментов компонентов и мембранные белки-регуляторы активации [19].
Содержание комплемента в сыворотке крови человека подвержено колебаниям и зависит от возраста, пола, времени года и суток. Дефицит комплемента обуславливает повышенную чувствительность к инфекционным заболеваниям, аутоиммунным болезням, злокачественным новообразованиям и т.д. [19, 96] Подобно большинству элементов иммунной системы гиперактивность системы комплемента или его активация в очаге тканевого повреждения может вызвать поражение клеток и тканей организма [44].
Наличие нескольких путей активации (классический, альтернативный и лектиновый (маннозный) путь активации) придает системе комплемента «гибкость», способность активироваться в различных ситуациях [44].
Изучение влияния компонентов гемолитической системы и исходного значения рН лекарственных препаратов иммуноглобулина на результат определения антикомплементарной активности
Вычисляют по формуле (4) активность комплемента в гемолитических единицах (CН50/мл) для испытуемого образца иммуноглобулина, контрольных образцов (положительный и отрицательный контроли) и контроля комплемента.
Антикомплементарную активность испытуемого образца иммуноглобулина (в %) и контрольных образцов (положительный и отрицательный контроли) вычисляют относительно активности в контроле комплемента, принятой за 100%, по формуле (6): АКА , (6) где: b - активность комплемента (СН5о/мл) в контроле комплемента, рассчитанная по формуле (4); а - активность комплемента (СН5о/мл) в испытуемом образце иммуноглобулина и в контрольных образцах (положительный и отрицательный контроли), рассчитанная по формуле (4).
Антикомплементарную активность испытуемого образца иммуноглобулина в СН50/мг белка рассчитывают по формуле (7): СН АКА(СН50/мг белка) , (7) где: 20 СН5о - количество комплемента, взятого для испытания; b - активность комплемента (СН5о/мл) в контроле комплемента, рассчитанная по формуле (4); a – активность комплемента (СН50/мл) в испытуемом образце иммуноглобулина и в контрольных образцах (положительный и отрицательный контроли), рассчитанная по формуле (4); 10 – количество белка иммуноглобулина (мг), взятого для испытания. Результаты испытания препарата иммуноглобулина считают достоверными, если: 1. Антикомплементарная активность отрицательного и положительного контролей находится в пределах, лимитируемых в инструкции по применению к стандартному образцу; 2. Активность комплемента в контроле комплемента находится в пределах от 80 до 120 СН50/мл. В противном случае проводят повторный анализ. Примечания 1. Приготовление буферных растворов (желатин-солевого или желатин-барбиталового). 1.1. Приготовление желатин-солевого раствора. В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 1 г желатина, прибавляют примерно 200 мл воды очищенной и оставляют набухать. Смесь нагревают при температуре 45±3 С до полного растворения. Полученный прозрачный раствор охлаждают до комнатной температуры. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 8,50 г натрия хлорида, 0,10 г кальция хлорида безводного, 0,04 г магния хлорида 6-водного, растворяют в небольшом количестве воды очищенной и прибавляют приготовленный раствор желатина. Общий объем раствора доводят водой очищенной до метки и перемешивают. Доводят рН раствора до 7,2-7,3 с помощью 0,1М раствора натрия гидроксида. Раствор используют свежеприготовленным. 1.2. Приготовление желатин-барбиталового буферного раствора. 1.2.1. Приготовление исходного раствора кальция и магния хлорида. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют в небольшом количестве воды очищенной 4,412 г кальция хлорида дигидрата и 20,332 г магния хлорида 6-ти водного, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 5±3 С в течение 1 мес. 1.2.2. Приготовление исходного барбиталового буферного раствора (рН 7,3). В мерной колбе вместимостью 2000 мл растворяют, постоянно перемешивая, 83,000 г натрия хлорида и 10,192 г барбитала натрия в 1700 мл воды очищенной. Показатель рН доводят до 7,3 1М с помощью раствора хлористоводородной кислоты. Добавляют 5 мл исходного раствора кальция и магния хлорида, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 5±3 С в течение 1 мес.
Приготовление раствора желатина. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 1,25 г желатина, прибавляют 500 мл воды очищенной и тщательно перемешивают. Полученную смесь нагревают при температуре 45±3 С до полного растворения желатина. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Используют только свежеприготовленный раствор.
Приготовление желатин-барбиталового буферного раствора. Прибавляют 4 части раствора желатина к 1 части исходного барбиталового буферного раствора, тщательно перемешивают и доводят рН до 7,2-7,3 с помощью 1М раствора натрия гидроксида или 1М раствором хлористоводородной кислоты. Раствор используют свежеприготовленным. 2. Подготовка контрольных образцов. Подготовку отрицательного и положительного контролей осуществляют в соответствии с прилагаемой инструкцией по применению к СО иммуноглобулина человека. 3. Приготовление стабилизированной крови барана. Берут один объем крови барана и один объем цитратного раствора, перемешивают. Хранят при температуре 5±3 С. Стабилизированную кровь барана можно использовать в течение 28 суток, но не ранее чем через 7 суток после взятия. 4. Приготовление цитратного раствора. Растворяют в 750 мл воды очищенной 20,5 г глюкозы, 8,0 г натрия лимоннокислого трехзамещенного и 4,2 г натрия хлорида, устанавливают рН раствора 6,1 раствором лимонной кислоты (100 г/л), доводят объем раствора до 1000 мл водой очищенной. Стерилизуют текучим паром в течение 30 мин при температуре 100 С. Хранят при температуре 5±3 С в течение 1 мес. 5. Приготовление гемолитической системы (суспензии сенсибилизированных эритроцитов барана). Гемолитическая сыворотка – иммунная сыворотка против эритроцитов барана, которую получают путем иммунизации кроликов. (Такие гемолитические сыворотки предлагаются рядом коммерческих источников). Для получения гемолитической системы гемолитическую сыворотку, разведенную до 2 МГЕ/мл, добавляют к 5 % суспензии эритроцитов барана в соотношении 1:1. Инкубируют в термостате при температуре 37,0±0,5 С в течение 15 мин, после чего хранят при температуре 5±3 С и используют в течение 6 ч. 6. Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее 10 морских свинок. Сыворотку отделяют от сгустка крови центрифугированием при температуре 4 С. Хранят в небольших количествах при температуре ниже минус 70 С. 7. Приготовление раствора комплемента, содержащего 100 СН50/мл. В зависимости от исходной активности комплемента 1 мл раствора комплемента разбавляют буферным раствором до содержания 100 СН50/мл. В настоящем исследовании также использовались общенаучные методы: обобщения, экспериментальный (сравнения), формальной логики, ретроспективный анализ.
Изучение возможности использования лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения в качестве кандидата в стандартный образец для определения антикомплементарной активности
Применение барбитала и его натриевой соли в составе буферного раствора ограничено необходимостью соответствующего лицензирования. Ранее Методическими рекомендациями [28] было предусмотрено использование желатин-солевого раствора (ЖСР) следующего состава: 8,50 г натрия хлорида; 0,10 г кальция хлорида безводного; 0,04 г магния хлорида 6-водного; 1,00 г желатина; воды очищенной до 1000 мл. Доводят рН раствора до 7,2-7,3 с помощью 0,1М раствора натрия гидроксида. Раствор используют свежеприготовленным.
В настоящем исследовании обосновали возможность применения в методике ЖСР. Критерием служило соответствие значений АКА отрицательного и положительного контролей СО иммуноглобулина человека BRP аттестованным (n=9) (Рисунок 4).
Антикомплементарная активность положительного (АКА «+») и отрицательного (АКА «–») контролей стандартного образца иммуноглобулина человека BRP при использовании желатин-солевого раствора (ЖСР) и желатин-барбиталового буферного раствора (ЖББР) Таким образом, проведенные исследования позволили обосновать оптимальные условия определения АКА ЛП ИГВВ, предусматривающие использование эритроцитов из крови бараньей дефибринированной с цитратом натрия, гемолитической сыворотки в соответствующем разведении, пулированного комплемента морских свинок (in house) и желатин-солевого раствора, как альтернатива желатин-барбиталового буферного раствора.
Оптимизированная методика послужила основой для разработки ОФС «Определение антикомплементарной активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения», вошедшей в состав Государственной фармакопеи РФ XIII издания (Приложение А) [49]. Отличия разработанной фармакопейной методики от ранее используемой большинством отечественных производителей ЛП ИГВВ [52] состоят в следующем [37]: – изменен состав желатин-барбиталового буферного раствора; – предусмотрена возможность использование ЖСР, как альтернатива ЖББР; – использование в качестве комплемента приготовленного пула сыворотки крови не менее 10 морских свинок; – уменьшен объем реакционной смеси при титровании гемолизина, комплемента и определении АКА в исследуемом образце иммуноглобулина; – предусмотрено использование СО иммуноглобулина человека; – впервые введена формула расчета для выражения АКА в процентах; – скорректирована формула расчета АКА, выраженной в единицах комплемента, связавшегося с 1 мг белка иммуноглобулина (СН50/мг белка).
Валидацию методики определения АКА проводили согласно требованиям отечественных и зарубежных руководств по валидации аналитических методик [48, 58, 67, 135]. По типу аналитической процедуры данная методика является количественным испытанием на примеси, поэтому при валидации оценивали правильность, прецизионность (повторяемость, внутрилабораторная прецизионность), специфичность, предел количественного определения, линейность и диапазон применения. Валидацию проводили с использованием СО иммуноглобулина человека BRP серия 1. Правильность
При оценке правильности критерием приемлемости служили значения АКА отрицательного и положительного контролей СО иммуноглобулина человека BRP, соответствующие аттестованным: 10-40% для отрицательного контроля; 60-100% для положительного контроля. Значения АКА СО иммуноглобулина человека BRP, полученные в настоящем исследовании, находились в аттестованных интервалах и составляли от 17,1 до 23,5 % (среднее значение составило 20,0 %) для отрицательного контроля и от 79,1 до 88,5 % (среднее значение составило 85,4 %) для положительного контроля. Таким образом, валидируемая методика характеризуется приемлемой правильностью.
Прецизионность Для характеристики прецизионности оценивали повторяемость и внутрилабораторную прецизионность (по фактору время и операторы) [57]. Проводили многократные измерения аттестованной характеристики (АКА) отрицательного и положительного контроля СО иммуноглобулина человека BRP: 7 групп (L=7) измерений в условиях повторяемости (п=2).
Рассчитывали среднее арифметическое значение (х) и выборочную дисперсию (S2/) результатов единичных измерений по формулам 8 и 10 соответственно.
Гипотезу о равенстве генеральных дисперсий проверяли, используя критерий Кохрена (G) [56]. Расчетное значение критерия Кохрена (Gрасч.) вычисляли по формуле 11. Полученную величину сравнивали с критическим значением для критерия Кохрена - Gтабл. (Gтабл.=0,727), которое выбирали в зависимости от трех основных параметров: - заданной доверительной вероятности Р0,95; - числа степеней свободы наибольшей дисперсии и=2-1=1; - количество дисперсий, по которым рассчитывают сумму, стоящую в знаменателе/=Ь=7 (в таблице И РМГ 61-2010) [56]. Соотношение (Gрасч. Gтабл.) для отрицательного и положительного контролей выполнено, следовательно, дисперсии можно считать однородными и по ним рассчитывали стандартное отклонение. Стандартное отклонение показателя повторяемости (r) считали равным выборочному стандартному отклонению повторяемости (Sr). Выборочное стандартное отклонение повторяемости рассчитывали по формуле 12, получили для отрицательного контроля Sr=0,212; для положительного контроля Sr=0,158. Коэффициент вариации повторяемости (CV), характеризующий повторяемость результатов измерений АКА отрицательного и положительного контролей СО иммуноглобулина человека BRP рассчитывали по формуле 13 и получили для отрицательного контроля CV=1,07 %; для положительного контроля CV=0,18 %. Аналогичным образом провели статистическую обработку полученных результатов для аналитика II.
Таким образом, валидационное исследование повторяемости позволило сделать вывод о том, что для отрицательного контроля СО иммуноглобулина человека BRP коэффициент вариации составил 1,07 % и 1,03 % для аналитика I и II соответственно, для положительного контроля – 0,18 % и 0,31 % для аналитика I и II соответственно (Таблица 7), что удовлетворяет критерию приемлемости – не должен превышать 2 % [54].
Изучение стабильности стандартного образца и установление срока годности
Аттестация СО – исследование, имеющее целью определение значений метрологических характеристик в соответствии с программой или методикой аттестации, с последующим включением полученных результатов в Паспорт на СО.
Основными параметрами СО являются аттестуемая характеристика, однородность, стабильность и срок годности.
В настоящее время наличие СО является одним из необходимых условий эффективной деятельности метрологических служб, включая оценку компетентности лабораторий, межлабораторных сравнительных испытаний и др. [15]. СО широко используют в метрологической практике как носители аттестованных значений состава и свойств исследуемых веществ [5, 16, 57, 65]. Для аттестации СО для определения АКА необходимо было провести исследования по следующим направлениям: – провести исследования с целью установления аттестуемой характеристики в соответствии с методикой и программой аттестации СО [55]; – изучить стабильность и определить срок годности СО; – разработать нормативно-техническую документацию, а именно паспорт, инструкцию по применению и макеты первичной упаковки СО. В соответствии с ГОСТ 8.315-97 [6, 13] установление значений аттестуемой характеристики СО для определения АКА проводили в одной лаборатории с использованием СО иммуноглобулина человека BRP серия 1 и методики измерений, метрологические характеристики которой были определены в рамках внутрилабораторной валидации. Аттестацию проводили в соответствии с программой и методикой аттестации. СО иммуноглобулина человека BRP серия 1 имеет аттестованные значения АКА отрицательного контроля в диапазоне от 10 до 40 %, положительного контроля в диапазоне от 60 до 100 %.
Положительный и отрицательный контроли подтверждают достоверность полученных результатов в различных диапазонах значений АКА.
Аттестуемой характеристикой СО для определения АКА являются значения АКА (в процентах), которые должны составлять для отрицательного контроля менее 50 %; для положительного контроля более 50 %. Антикомплементарную активность определяют в реакции связывания комплемента.
При аттестации СО для определения АКА оценивали кандидата в СО по результатам, полученным в одной лаборатории, с использованием СО иммуноглобулина человека BRP серия 1. Исследования провели три аналитика, получили 27 независимых результатов в условиях промежуточной прецизионности (Таблица 14).
Средние значения АКА для отрицательного контроля СО составили 41,5 %; для положительного контроля - 78,2 %. Стандартное отклонение (Sx) значений отрицательного контроля составило 1,8 %, положительного контроля - 2,3 %.
Оценка неопределенности Относительное стандартное отклонение результатов испытаний АКА, характеризующее стандартную неопределенность от способа установления аттестованного значения составило 4,34 % для отрицательного контроля и 2,94 % для положительного контроля. Расширенную неопределенность аттестованного значения (Х) АКА отрицательного и положительного контролей со степенью достоверности 95 % вычисляли по формуле (19): AX=±2SX, (19) Расширенная неопределенность аттестованного значения АКА отрицательного контроля составила 3,6 %, положительного контроля - 4,6 % (степень достоверности 95 %).
Дата проведения исследования Антикомплементарная активность стандартного образца иммуноглобулина человека BRP, процент Антикомплементарная активность стандартного образца, процент
Дополнительно проведены исследования по определению содержания белка, получены значения равные 102±1,8 мг/мл (степень достоверности 95 %).
В целях обеспечения однородности СО произвели закупку сертифицированной серии ЛП «Иммуноглобулин человека нормальный», раствор для внутримышечного введения, т. е., произведенного в результате одного технологического цикла его производителем, поэтому дополнительных исследований однородности не проводили. Стабильность СО является одной из их важнейших характеристик. В соответствии с рекомендациями ВОЗ для оценки стабильности используют ускоренный тест на термостабильность, позволяющий по результатам сравнительно короткого испытания при повышенных температурах прогнозировать активность и срок годности образца при температуре его хранения. При исследовании стабильности методом ускоренного старения определяют зависимость изменения активности СО от времени при трех различных повышенных температурах [57]. При этом первую из повышенных температур выбирают экспериментально таким образом, чтобы в течение периода измерения наблюдалось статистически значимое падение активности. Однако, способ получения СО для определения АКА предполагает термическую обработку образцов иммуноглобулина человека (при 56 С в течение 5 мин), т.е. при повышении температуры наблюдается повышение значений АКА, следовательно, метод ускоренного старения при изучении стабильности исследуемого СО не применим.
Выбран метод исследования стабильности – естественное старение. С целью изучения стабильности и установления срока годности СО для определения АКА было сформировано 450 комплектов одной серии СО, представленные 450 ампулами (по 1,5 мл) отрицательного контроля и 450 ампулами (по 1,5 мл) положительного контроля.
Для изучения стабильности образцы полученного СО для определения АКА хранили при температуре 5±3 С и определяли контролируемые параметры (антикомплементарная активность, содержание белка, описание) в момент закладки на хранение, далее ежемесячно в течение первых 3 мес., далее с интервалом в 3 мес. до 21 мес.
Представленные в Таблице 15 данные позволяют сделать вывод о том, что СО для определения АКА стабилен в течение 18 мес. при хранении при температуре 5±3 С. Для установления окончательного срока годности наблюдения продолжаются.
Для подтверждения возможности использования вскрытых ампул СО для определения АКА в течение не более 14 суток были проведены исследования по изучению стабильности аттестуемой характеристики, содержанию белка и описанию, которые позволили сделать вывод о том, что СО стабилен после вскрытия ампул в течение указанного периода при температуре 5±3 С (Таблица 16).
В качестве дополнительного подтверждения стабильности свойств СО в процессе хранения проведено изучение молекулярно-массового распределения молекул иммуноглобулина методом ВЭЖХ. По результатам изучения молекулярно-массового распределения молекул иммуноглобулина содержание полимеров и агрегатов в отрицательном контроле варьировало от 0,04 до 0,64 %, в положительном контроле – от 0,36 до 1,21 %, что не оказывало влияния на АКА (Таблица 17).