Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитические аспекты исследования многокомпонентных объектов в судебно химической экспертизе и фармацевтическом анализе (обзор литературы) 24
1.1. Характеристика многокомпонентных объектов в судебно химической экспертизе и фармацевтическом анализе 24
1.2. Аналитические возможности методов исследования многокомпонентных объектов в судебно-химической экспертизе и фармацевтическом анализе 33
1.2.1. Методы анализа в судебно-химической экспертизе 33
1.2.2. Судебно-биохимические исследования в экспертной практике 42
1.2.3. Методы анализа в контроле качества лекарственных средств. 46
1.3. Методическое и метрологическое обеспечение методов исследования многокомпонентных объектов в судебно химической экспертизе и фармацевтическом анализе 52
Выводы по главе 1 58
Экспериментальная часть 60
Глава 2. Объекты и методы исследования 60
2.1. Объекты исследования 60
2.2. Денситометрический анализ биологических жидкостей (крови) 60
2.3. Исследование образцов крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ/МС) 63
2.4. Определение судебно-биохимических показателей крови 70
2.5. Исследование биологического материала методами элементного анализа 72
2.6. Исследование объектов небиологического происхождения методами элементного анализа 74
2.7. Исследование влияния компонентов сточных вод химико-фармацевтических предприятий на изо ферментный профиль и дегидрогеназную активность 79
2.8. Исследование биомассы активного ила, фитомассы наяды мелкозубчатой, лекарственного растительного сырья методом электрофореза в полиакриламидном геле 80
2.9. Определение общей активности оксидоредуктаз биомассы активного ила, фитомассы наяды мелкозубчатой, лекарственного сырья 83
2.10. Определение общей дегидрогеназной активности биомассы ила 84
2.11. Определение флавоноидов в лекарственном растительном сырье 85
2.12. Исследование методик судебно-химической экспертизы и фармацевтического анализа 85
2.13. Статистическая обработка результатов исследования 87
Глава 3. Разработка алгоритма судебно-химического исследования и обоснование возможности количественного определения лекарственных веществ в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией 90
3.1. Разработка методики идентификации некоторых лекарственных веществ в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией .. 90
3.2. Обоснование возможности количественного определения некоторых лекарственных веществ в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией 101
3.2.1. Количественное денситометрическое определение лекарственных веществ с применением полиномиальной (квадратичной) градуировки 102
3.2.2. Определение метрологических характеристик методики количественного определения лекарственных веществ в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией 107
3.2.3. Количественное денситометрическое определение лекарственных веществ с применением линейной градуировки 110
3.3. Алгоритм судебно-химического исследования и апробация методики анализа некоторых лекарственных веществ в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией 114
Выводы по главе 3 118
Глава 4. Обоснование применения комплекса судебно-биохимических показателей трупной крови для скрининга летальных отравлений 120
4.1. Анализ судебно-биохимических и судебно-химических исследований в экспертных учреждениях Министерства здравоохранения РФ 120
4.2. Однофакторный анализ результатов судебно-биохимического исследования трупной крови 125
4.3. Дискриминантный анализ результатов судебно биохимического исследования трупной крови 131
4.4. Алгоритм применения классификационных функций судебно биохимических показателей трупной крови в экспертной практике 140
Выводы по главе 4 148
Глава 5. Организационно-аналитические аспекты экспертных исследований и разработка методов количественной оценки содержания некоторых элементов в биологическом материале и объектах небиологического происхождения 150
5.1. Исследование материально-технического и методического обеспечения элементного анализа в экспертных учреждениях Министерства здравоохранения РФ 150
5.2. Cравнительное исследование возможностей методов ИВА и ИСП-МС в судебно-химической экспертизе и аналитической диагностике острых отравлений (на примере из экспертной практики) 155
5.3. Принципы оценки количественного содержания некоторых элементов при экспертных исследованиях объектов небиологического происхождения 163
5.3.1. Количественная оценка содержания некоторых элементов при исследовании объектов небиологического происхождения методом РФС при наличии «холостых» проб 163
5.3.2. Количественная оценка содержания некоторых элементов при исследовании объектов небиологического происхождения методом РФС, АЭС при отсутствии «холостых» проб 168
5.3.3. Количественная оценка содержания некоторых элементов при исследовании объектов небиологического происхождения методом РФС с применением программных расчетных алгоритмов 173
Выводы по главе 5 178
Глава 6. Обоснование применения ряда ферментов в качестве тест-объектов при эколого-фармацевтическом мониторинге сточных вод 180
6.1. Алгоритм эколого-фармацевтического мониторинга с применением ферментных систем биомассы активного ила и фитомассы наяды мелкозубчатой 180
6.2. Характеристика исходного состояния тест-объектов – анализ изоферментного профиля ферментных систем биомассы активного ила и фитомассы наяды мелкозубчатой 182
6.3. Характеристика аналитического сигнала тест-объектов – ферментных систем биомассы активного ила и фитомассы наяды мелкозубчатой 188
6.4. Сравнительная характеристика аналитических возможностей методов биотестирования и физико-химических методов анализа 208
Выводы по главе 6 213
Глава 7. Энзимомониторинг накопления биологически активных веществ и фаз вегетации лекарственного растительного сырья (на примере рода горцев Polygonum) 215
7.1. Анализ изоферментного профиля фермента малатдегидрогеназы травы различных видов горцев Polygonum по фазам вегетации 215
7.2. Анализ изоферментного профиля фермента малатдегидрогеназы травы различных видов горцев Polygonum в условиях промышленной заготовки 222
7.3. Взаимосвязь содержания суммы флавоноидов с общей активностью и изоферментным профилем фермента малатдегидрогеназы травы различных видов горцев Polygonum.. 228
Выводы по главе 7 242
Глава 8. Разработка алгоритма метрологической оценки методик анализа многокомпонентных объектов аналитического контроля в судебно химической экспертизе и фармацевтическом анализе 245
8.1. Определение и мониторинг пределов обнаружения в методиках идентификации анализируемых веществ многокомпонентных объектов аналитического контроля (на примере идентификации опиатов в крови методом ГХ-МС) 247
8.2. Разработка компьютерной программы для определения метрологических характеристик методик количественного анализа в судебно-химической экспертизе и фармацевтическом анализе 256
8.3. Разработка компьютерной программы для определения погрешности методик количественного анализа в судебно-химической экспертизе и фармацевтическом анализе 265
Выводы по главе 8 272
Заключение 274
Общие выводы 277
Список сокращений 283
Список литературы 285
- Характеристика многокомпонентных объектов в судебно химической экспертизе и фармацевтическом анализе
- Разработка методики идентификации некоторых лекарственных веществ в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией
- Количественная оценка содержания некоторых элементов при исследовании объектов небиологического происхождения методом РФС, АЭС при отсутствии «холостых» проб
- Разработка компьютерной программы для определения погрешности методик количественного анализа в судебно-химической экспертизе и фармацевтическом анализе
Характеристика многокомпонентных объектов в судебно химической экспертизе и фармацевтическом анализе
Большая часть объектов аналитического контроля в судебно-химической экспертизе, фармацевтическом анализе относится к многокомпонентным, они представляют собой сложную систему целевых анализируемых веществ (аналитов) и балластных веществ, составляющих так называемую «матрицу» [360, 381].
К таким объектам можно отнести:
- биологический материал (органы и биологические жидкости трупа);
- сложные лекарственные формы с фармацевтическими субстанциями синтетического происхождения;
- лекарственное растительное сырье, лекарственные препараты на его основе;
- сточные воды химико-фармацевтических предприятий;
- различные объектами небиологического происхождения, являющиеся вещественными доказательствами в экспертной практике.
Данные объекты в большинстве работ рассматриваются в аналитическом аспекте по двум направлениям: уровню содержания анализируемого вещества в объекте и степени насыщенности «матрицы» балластными (сопутствующими) веществами [18, 259].
По уровню концентраций аналита выделяют объекты:
- с ультрамикро- и микроуровнем содержания анализируемых веществ – биологически жидкости, органы, сточные воды химико-фармацевтических предприятий (для некоторых компонентов), некоторые объекты небиологического происхождения (например, ткани с продуктами выстрела); - со средним уровнем содержания анализируемых веществ – большинство лекарственных препаратов с фармацевтическими субстанциями синтетического и природного происхождения, сточные воды химико фармацевтических предприятий;
- с достаточно высоким уровнем содержания анализируемых веществ – ЛРС, лекарственные препараты.
По степени насыщенности «матрицы» балластными веществами возможно обозначить следующие виды объектов:
- объекты с «легкими» матрицами – моча, сточные воды химико фармацевтических предприятий, ряд объектов небиологического происхождения (лекарственные препараты, технические жидкости);
- объекты с «тяжелыми» матрицами – органы, кровь (особенно биологический материал с гнилостными изменениями), ЛРС, комбинации различных видов ЛРС и некоторые комплексные препараты на его основе [403].
В практике судебно-химической экспертизы и химико-токсикологического анализа ключевыми объектами анализа являются биологические жидкости (кровь, моча) и органы.
Кровь является лучшим биологическим объектом для обнаружения, количественного определения и интерпретации концентраций токсикологически важных веществ. Содержание токсикантов и их метаболитов в крови у живых лиц и в трупной крови неодинаково. Качество пробы зависит от правильности отбора, подготовки и хранения ее до анализа. Если анализируемое вещество связывается с белком, это необходимо учитывать. Из эндогенных соединений крови, помимо жирных кислот, в крови присутствуют стероидные соединения (холестерин, тестостерон и т.д.), которые находятся в связанном состоянии с белками плазмы. При интерпретации количественных результатов учитывают посмертное перераспределение токсикантов из тканей в кровь [105]. В крови токсичные вещества могут концентрироваться в плазме или эритроцитах. Образцы плазмы не имеют информативной ценности, если аналит связан с эритроцитами (например, соединения свинца) [211]. По этой причине распространенным вариантом является анализ цельной крови в судебно-химической экспертизе [359].
Моча считается наиболее простым биологическим объектом для анализа вследствие низкого содержания белковых компонентов. Биологическая матрица мочи вследствие почечной фильтрации свободна от белков плазмы, липидов и других соединений с высокой молекулярной массой, что упрощает процедуру пробоподготовки. Важным показателем мочи как биологического объекта является значение рН, изменение которого контролируется в процессе работы. При хранении рН мочи может увеличиваться из-за действия бактериальной флоры, выделяющей аммиак. Из эндогенных соединений в моче всегда содержатся низкомолекулярные продукты метаболизма аминокислот и углеводов (амины, мочевина, карбоновые кислоты и т.д.), небольшое количество пептидов, стероидов и пигмента уробилина, окрашивающего мочу в желтый цвет и мешающего спектрофотометрическим определениям. Аккумуляция токсикантов и их метаболитов в моче в достаточно высоких концентрациях облегчает процедуру идентификации. Обнаружение токсиканта в моче не дает однозначной информации о возможной дозе и времени введения его в организм [360].
Ткани и органы являются лучшими объектами для получения результатов, сопоставимых c результатами анализа крови. В настоящее время получено большое число количественных данных об обнаружении токсикантов в тканях, прежде всего в тканях печени и почек и в меньшей степени мозга и легких, а также сравнительных результатов анализов крови из сердца и ткани печени при определении метаболизма токсикологически важных веществ. Функции печени обуславливают присутствие самых разнообразных соединений в пробе – аминокислоты, амины, углеводы, жирные кислоты. Пигментный обмен приводит к образованию билинов (билирубин, биливердин, сериобилин, уробилин и т.д.) – окрашенных веществ, мешающих спектрофотометрическому определению пробы. Из-за присутствия разнообразных эндогенных соединений печень является самым трудным объектом для анализа. Самая длительная и многоэтапная процедура пробоподготовки дает в конечном счете в извлечении достаточно высокое содержание балластных веществ. С другой стороны, ткани печени – один из самых информативных объектов судебно-химической экспертизы. Например, если концентрации веществ основного характера в печени достаточно высокие и отношение их концентраций в печени и крови выше 10, – это свидетельствует об отравлении. При отравлении тяжелыми металлами почки – наиболее часто используемый объект, так как металлы депонируются в нем. Селезенка как орган, наиболее богатый кровью, используется для исследования на оксид углерода (II). Ткани легких используются в случаях, когда имеет место ингаляция «летучих» ядов. Мозг достаточно защищен от внешнего влияния и посмертного разложения. Этот вид биологического объекта отличается прежде всего высоким содержанием липидов, фосфолипидов, стеринов и продуктов метаболизма белковых веществ (низкомолекулярных пептидов). В тканях мозга депонируются высоколипофильные токсиканты, в частности галогенуглеводороды [345].
В судебно-химической экспертизе используются и многие другие объекты, среди которых альтернативные объекты (волосы, ногти, потожировые выделения кожи), пятна крови на одежде, жировые образования от разложившегося трупного материала, зола после кремации, а также объекты небиологического происхождения (шприцы, остатки лекарственных препаратов, технических жидкостей, порошки и т.д.). Обнаружение в объектах небиологического происхождения токсикологически важного вещества в ряде экспертных случаев позволяет правильно формулировать заключение о структуре вещества, вызвавшего смерть, а также решать комплекс вопросов медико-криминалистической экспертизы [344].
Среди анализируемых веществ сточных вод химико-фармацевтических предприятий необходимо выделить две группы:
- группа веществ с нормированием содержания в сточных водах – для большинства веществ определено максимально допустимое значение концентрации, имеются методики анализа, включенные в перечень аттестованных методик (методов) измерений Росстандарта, на основе хроматографических, электрохимических и спектральных методов;
- группа веществ, для которых отсутствует юридически установленная процедура нормирования содержания в сточных водах – для веществ этой группы не определены максимально допустимые значения концентрации и отсутствуют аттестованные методики анализа. При этом по токсикологическому значению представители указанной группы не уступают веществам их первой группы, что обуславливает важность их определения в сточных водах. Основными представителями этой группы являются пестициды, лекарственные вещества различных групп и продукты их превращения [45,46, 346].
Разработка методики идентификации некоторых лекарственных веществ в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией
Включение в процедуру ТСХ-анализа денситометрии дает аналитику возможности визуализации и документирования результатов, количественного определения при наличии стандартных образцов анализируемых веществ для этапа градуировки.
Применение компьютерных программ для обработки хроматографических пластинок – компьютерной денситометрии, мы считаем полноценной альтернативой применению денситометрического аналитического оборудования отечественного и зарубежного производства [56, 58, 139].
ТСХ с компьютерной денситометрией в плане материально-технического оснащения требует относительно небольших экономических затрат. Для практической реализации метода в условиях экспертного учреждения необходимы фотоаппараты или сканеры изображений (для перевода хроматографической пластинки в электронную форму) и соответствующее программное обеспечение для обработки полученных изображений и проведения аналитических операций: определение величины Rf и площади, интенсивности окраски хроматографических зон анализируемых веществ.
Разработка методики идентификации исследуемых токсикологически важных веществ группы «лекарственных ядов» представляла собой адаптацию существующих методик, используемых при исследованиях методом ТСХ в судебно-химической экспертизе. Внесение дополнений и изменений в виде возможностей компьютерной денситометрии делают существующие методики более эффективными и пригодными для нового применения.
В качестве модельных веществ – представителей наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ нами были использованы соединения, различающиеся по кислотно-основным свойствам: слабые кислоты – барбитал, фенобарбитал, барбамил; слабые основания – кодеин, верапамил, эфедрин, доксиламин, амитриптилин; амфотерные – морфин, баклофен (рис. 1).
При разработке методики идентификации исследуемых веществ в биологических жидкостях нами были использованы следующие принципы:
- доступность метода ТСХ в рутинной практике судебно-химической экспертизы на этапе предварительного анализа;
- более высокая производительность метода ТСХ по сравнению с инструментальными хроматографическими методами: ГЖХ, ВЭЖХ;
- отсутствие ложноположительных результатов анализа, связанных с эффектом переноса анализируемого вещества из одной пробы в другую в хроматографической системе («память аналитического метода»);
- относительная простота техники пробоподготовки биологических жидкостей методом жидкость-жидкостной экстракции;
- невысокая разрешающая способность и селективность метода ТСХ;
- достаточная компетентность персонала судебно-химического отделения любого экспертного учреждения для выполнения поставленной аналитической задачи;
- исключение необъективности при визуальной фиксации результатов анализа методом ТСХ;
- возможность документирования и хранения в виде компьютерных электронных архивов результатов анализа.
В таблице 9 приведены параметры методики идентификации исследуемых наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ в модельных образцах крови. Были использованы подвижные фазы и варианты детектирования анализируемых веществ, широко применяемые в практике судебно-химической экспертизы и химико-токсикологического анализа при исследованиях на «лекарственные яды».
Для определения предела обнаружения исследуемых веществ были проанализированы модельные образцы крови в следующих диапазонах концентраций: для морфина, кодеина, верапамила, эфедрина, доксиламина, амитриптилина - 100,0-5000,0 нг/мл; для баклофена - 50,0-2000,0 нг/мл.
Пробоподготовку образцов крови осуществляли методом жидкость-жидкостной экстракции при значениях рН, обеспечивающих перевод анализируемого вещества в молекулярную неионизированную форму. Для пробоподготовки использовали образцы крови объемом 10 мл, а объем пробы, наносимой на хроматографическую пластину, составлял 50 мкл.
При определении величины предела обнаружения использовали визуальную регистрацию обработанного изображения хроматограммы. Для обработки изображения применяли программные средства «ТСХ-менеджер 4.0» – просмотр хроматограммы в негативе и увеличения контрастности. Наименьшие величины предела обнаружения обеспечивало детектирование в УФ-свете, проявление реактивом Драгендорфа и раствором нингидрина в ацетоне 0,05% (для баклофена).
Пределы обнаружения методом ТСХ с денситометрической регистрацией составили: для морфина, кодеина, амитриптилина 600,0 нг/мл (5,0 мкг в пробе), для верапамила, эфедрина, доксиламина – 150,0 нг/мл (1,0 мкг в пробе), для баклофена – 75,0 нг/мл (0,5 мкг в пробе).
Обработка файла изображения хроматограммы путем растровых манипуляций: изменения резкости, интенсивности изображения, перевода изображения в негатив, изменение параметров яркости и контрастности, позволяет значительно увеличить эффективность детектирования и уменьшить величину предела обнаружения анализируемых веществ до значений, сопоставимых с пределами обнаружения инструментальных хроматографических методов.
На рисунке 2 представлен пример использования некоторых процедур обработки изображения для снижения величины предела обнаружения при исследовании методом ТСХ с компьютерной денситометрией модельных проб крови, содержащих эфедрин в концентрациях от 100,0-250,0 нг/мл.
На приведенной хроматограмме в пробе с концентрацией эфедрина 100,0 нг/мл его хроматографическая зона не выявляется. Для пробы с концентрацией эфедрина 150, нг/мл отмечается слабовыраженная хроматографическая зона, которая мало отличается от фона хроматограммы. После загрузки файла формата jpeg в программу «ТСХ-менеджер 4.0» возможна обработка изображения.
Количественная оценка содержания некоторых элементов при исследовании объектов небиологического происхождения методом РФС, АЭС при отсутствии «холостых» проб
Методический подход оценки первичного аналитического сигнала в условиях отсутствия «холостых» образцов, был использован нами при исследовании образцов марихуаны для установления единства источника происхождения по используемому сырью.
Первым этапом решения данной аналитической задачи является оценка элементного состава проб исследуемых образцов, условно обозначенных нами «образец №1м», «образец №2м» и «образец №3м».
В ходе регистрации обзорного спектра рентгеновской флуоресценции был определен элементный состав образцов марихуаны. Сравнение образцов проводили по элементам: кальций, калий, железо и стронций; сравнение по элементам никель, марганец, титан не проводили ввиду незначительной интенсивности в спектрах линий. Для всех элементов проводили измерения в пяти аналитических повторностях для обеспечения возможности статистической обработки.
Результаты измерения интенсивности рентгеновской флуоресценции К-линий кальция, калия, железа и стронция представлены в таблице 38.
Для проверки значимости различия средних значений содержания элементов в исследуемых образцах использовали процедуру анализа стандартных отклонений аналитических сигналов (однофакторный дисперсионный анализ).
Статистическую гипотезу о равенстве содержаний элементов: кальция, калия, железа и стронция в образцах №1-3 можно отвергнуть (табл. 39).
Для детализации различий по содержанию каждого элемента использовали апостериорные сравнения средних с применением критерия наименьшей значимости Фишера (табл. 40).
Если вероятность критерия наименьшей значимости в таблице 40 на пересечении строки и столбца с соответствующими номерами образцов марихуаны больше чем 0,05, то принимается гипотеза о равенстве указанных средних значений, в противном случае – гипотеза отвергается. В рассмотренном случае все три исследуемых образца марихуаны значимо различаются по содержанию кальция, калия, железа и стронция. Однако переход на более высокий уровень статистической значимости – 0,01, позволяет сделать заключение о сходстве образцов №2 и №3 по содержанию железа.
В качестве сравнительного варианта анализа вышеуказанные пробы марихуаны после минерализации исследовали методом АЭС.
Установлено, что все образцы имеют одинаковый элементный состав: кальций, магний, железо, натрий, алюминий, медь, барий, титан, ванадий, марганец, а также неметалл – кремний. Различия в перечне определяемых металлов связано с различием пределов обнаружения методов РФС и АЭС, а также потерями металлов в ходе минерализации объекта исследования.
Сравнение образцов проводили по содержанию элементов, имеющих наиболее интенсивные аналитические линии в спектрах эмиссии, – меди, марганца и ванадия (табл. 41).
Все исследуемые образцы марихуаны значимо различаются по содержанию меди и не различаются по содержанию марганца и ваннадия (табл. 42).
Детализация различий по содержанию элементов показала различие образцов №1м и №2м, №2м и №3м по содержанию меди, а также образцов №1м и №2м – по содержанию марганца. При переходе на уровень статистической значимости 0,01, только образцы №2м и №3м различаются по содержанию меди (табл. 43).
Таким образом, на основании исследования экспертных образцов марихуаны методами РФС и АЭС для оценки содержания ряда химических элементов нами предложен принцип сравнения первичных аналитических сигналов в пробах образцов, близких по структуре и составу.
Следует отметить, что измерение первичного аналитического сигнала в зависимости от принципа метода анализа можно проводить как без минерализации объекта – метод РФС, так и с минерализацией – метод АЭС.
Доказательность результатов сравнения первичных аналитических сигналов обеспечивалась применением статистического метода – однофакторного дисперсионного анализа, легко реализуемого химиком-экспертом в приложениях MS Excel или Statistica.
Предложенный принцип оценки содержания химических элементов в объектах небиологического происхождения целесообразно использовать для решения задач сравнительного анализа образцов и доказательства их идентичности в судебно-химической экспертизе и медико-криминалистических исследованиях.
Разработка компьютерной программы для определения погрешности методик количественного анализа в судебно-химической экспертизе и фармацевтическом анализе
В качестве основного фактора, влияющего на моделирование выборки результатов анализа и последующем определении параметров правильности и воспроизводимости методики при использовании компьютерной программы «ChemMetr 1.0», описанной в пп. 8.2. главы 8, были выбраны характеристики разброса результатов количественного определения – стандартные отклонения единичного результата S или среднего значения Sсред.
Данные величины определялась экспериментальным путем при разработке, валидации или верификации методики количественного определения, поэтому информация о достоверности и корректности их определения нам недоступна.
Любая методика количественного определения представляет собой совокупность взаимосвязанных измерений различных величин, которые в итоге формируют суммарную погрешность определения количества анализируемого вещества в пробе.
Недостоверность или отсутствие информации о параметрах погрешности методики количественного определения, определило применение нами следующих прогностических алгоритмов основанных на теоретических оценках:
- оценке погрешности измерения отдельных этапов аналитической методики;
- оценке погрешности на основании величины концентрации анализируемого вещества в пробе исследуемого объекта (по уравнению Горвица).
При этом раздельно не рассматривались вклады в итоговую (общую) погрешность методик количественного определения систематических и случайных ошибок.
Нами разработана компьютерная программа «ChemMetr Evaluation 1.0» для IBM PC-совместимых персональных компьютеров (прил. 11).
Программа предназначена для автоматического расчета величины относительной погрешности определения для методик количественного определения в фармацевтическом анализе и судебно-химической экспертизе. Может применяться для оценки погрешности определения на различных этапах «жизненного цикла» методики анализа, а также для априорной метрологической экспертизы методов количественного определения в практической деятельности химиков-аналитиков и химиков-экспертов при исследовании лекарственных препаратов, ЛРС и других многокомпонентных объектов аналитического контроля.
Программа позволяет на основании величин погрешностей (абсолютных и относительных) отдельных этапов методики количественного определения рассчитывать относительную погрешность методики в целом; включать в расчет величины относительной погрешности методики, погрешности этапов пробоотбора и пробоподготовки; выделять этапы количественного определения, которые вносят наибольший вклад в величину погрешности; формировать отчет по характеристикам погрешности (рис. 33).
Пример 2. Нами была рассмотрена методика количественного определения суммы дубильных веществ в определенном виде ЛРС методом спектрофотометрии в УФ-диапазоне (с использованием удельного показателя поглощения катехина) из числа методик анализа, указанных в пп. 8.2 настоящей главы. Среднее значение содержания дубильных веществ составляет 12,68%, стандартное отклонение среднего значения Scped и относительная ошибка определения среднего значения есред - 0,27 и 1,06% соответственно.
В таблице 84 представлены основные этапы методики анализа с оценкой погрешности измерения.
Из приведенных данных видно, что погрешность данной методики, заявленная разработчиком, имеет значение ниже погрешности, рассчитанной с учетом погрешности всех этапов анализа (с помощью программы «ChemMetr Evaluation 1.0»). При этом предел сходимости результатов, который в большей степени является характеристикой разброса результатов, обусловленного случайными ошибками, также больше погрешности заявленной. Таким образом, получается, что разработчик в ходе экспериментальной оценки методики получил погрешность ниже минимального уровня разброса результатов анализа. Это свидетельствует о некорректности процедуры оценки погрешности определения для данной методики анализа.
Пример 3. В качестве примера методики судебно-химического исследования нами была рассмотрена методика количественного определения верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией (с применением абсолютной квадратичной градуировки), описанная нами в главе 3.
В таблице 85 представлены основные этапы методики анализа с оценкой погрешности измерения.
Из приведенных данных видно, что погрешность данной методики, заявленная нами как разработчиками, имеет среднее значение для рабочего диапазона методики 41,8%. Погрешности, рассчитанные с помощью программы «ChemMetr Evaluation 1.0» и уравнения Горвица составляют 14,1% и 21,9% соответственно. Разброс значений содержания верапамила в пробах крови, оцениваемый только как функция его концентрации по уравнению Горвица, не превышал 7,5%.
Таким образом, все варианты теоретического прогноза погрешности методики денситометрического определения верапамила в крови не превышали значений погрешности, полученных нами экспериментальным путем.
При этом в ходе определения погрешности методики экспериментальным путем максимальный уровень погрешности, обусловленный систематическими ошибками – 14,1%, мы превысили в 3 раза за счет вклада случайного разброса результатов только в условиях сходимости.
По разработанному алгоритму нами было исследованы заявленные относительные погрешности 184 методик количественного определения для судебно-химической экспертизы и фармацевтического анализа из пп.8.2 настоящей главы (прил. 12).
В результате для 61% исследованных методик мы наблюдали статистически значимое различие между относительными ошибками единичных результатов и средних значений, полученными при разработке, валидации и верификации методик и относительными ошибками, полученными расчетным путем с применением компьютерной программы «ChemMetr Evaluation 1.0». Различие заключалось в занижении величины относительной ошибки определения.
Получение подобных результатов сравнения свидетельствует о некорректности определения метрологических характеристик разрабатываемых методик анализа. Следствием этого, является невозможность получения результатов анализа с контролируемыми показателями погрешности в рутинной аналитической практике с использованием подобных методик.
Для большинства исследованных методик количественного определения различных групп биологически активных веществ в ЛРС и лекарственных препаратах на их основе методом спектрофотометрии показано, что минимальный уровень относительной погрешности среднего значения составляет:
- при использовании удельного показателя поглощения – 5-7%;
- при сравнении со стандартным образцом («одноточечная градуировка») – 1,5-2%.
Таким образом, разработанную нами компьютерную программу «ChemMetr Evaluation 1.0» целесообразно использовать в судебно-химической экспертизе и фармацевтическом анализе по двум направления:
- при оценке погрешности на этапе разработки методик количественного определения веществ в многокомпонентных объектах («прогностическая» функция);
- ретроспективного определения величины относительной погрешности разработанных методик количественного анализа.