Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы. Важным критерием безопасности активных фармацевтических субстанций, используемых в производстве стерильных лекарственных препаратов, является показатель «Бактериальные эндотоксины», направленный на определение источников пирогенных реакций [Good Manufacturing Practices (GMP) Guidelines for Active Pharmaceutical Ingredients (APIs), 2013, Неугодова, Н.П., 2000]. Оценку данного показателя выполняют согласно требованиям ГФ РФ действующего издания [Государственная фармакопея Российской Федерации XIII издания. Том 1, 2015] и ведущих зарубежных фармакопей мира [British Pharmacopeia, 2017, European pharmacopoeia 9, 2017, 17th edition, 2016, The United States Pharmacopoeia. - 40-th ed. - 2017] с помощью ЛАЛ (Limulus amebocyte lysate) - теста, реактив которого специфически реагирует с эндотоксином.
Нормативная документация на активные фармацевтические субстанции (АФС), используемые в производстве стерильных лекарственных препаратов, обязательно включает раздел «Бактериальные эндотоксины» с нормой предельного содержания бактериальных эндотоксинов (БЭ) и ссылкой на ОФС 1.2.4.0006.15. В данной статье приведены общие сведения о выполнении анализа лекарственных средств на наличие БЭ, но отсутствуют подробные рекомендации для проведения ЛАЛ-теста и не указаны условия пробоподготовки образцов. Это значительно усложняет процедуру определения БЭ, особенно в тех случаях, когда изучаемые АФС:
водонерастворимы,
окрашены,
обладают мешающими факторами.
В настоящее время один из наиболее сложных вопросов при определении БЭ в водонерастворимых АФС является выбор растворителя, так как он может оказывать влияние на активность эндотоксина и тем самым затруднять получение достоверных результатов. Согласно лишь единичным разрозненным данным литературы [Williams Kevin L., 2007] в качестве растворителей можно использовать этиловый спирт 96%, диметилсульфоксид, диметилформамид, однако данное предположение требует подтверждения.
Цель исследования заключается в разработке методических подходов для определения содержания бактериальных эндотоксинов в фармацевтических субстанциях.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ отечественной и зарубежной нормативной документации, регламентирующей условия определения бактериальных эндотоксинов в образцах АФС.
-
Установить растворители для водонерастворимых АФС, которые не обладают мешающими факторами в ЛАЛ-тесте.
-
Определить методические особенности и разработать универсальную схему проведения анализа АФС по показателю «Бактериальные эндотоксины».
-
Разработать методики определения бактериальных эндотоксинов в АФС, которые обладают мешающими факторами в ЛАЛ-тесте.
-
Провести валидационные исследования разработанных методик с помощью обоснованных параметров и критериев их оценки.
Научная новизна работы.
Впервые разработаны методические подходы для определения бактериальных
эндотоксинов, направленные на обоснование и оптимизацию условий
пробоподготовки и проведения анализа фармацевтических субстанций с учетом их физико-химических свойств (растворимость, вязкость, кислотность, щелочность, химическое строение и др.).
Обоснована и установлена схема пробоподготовки АФС с разной растворимостью, позволяющая исключить ложноотрицательные результаты ЛАЛ-теста.
Определены основные критерии выбора растворителя для водонерастворимых АФС, которые обосновывают отсутствие влияния на биологическую активность БЭ и реакцию ЛАЛ-реактива с контрольным стандартным образцом эндотоксина.
Усовершенствована методика определения бактериальных эндотоксинов в фармацевтической субстанции терафтала, способствующая устранению мешающего фактора и определению реального содержания эндотоксинов в меньшем разведении основного раствора субстанции.
Для анализа водонерастворимой субстанции рифампицина на наличие бактериальных эндотоксинов установлен и рекомендован этиловый спирт 96%, как инертный к эндотоксинам растворитель, и не влияющий на результаты испытаний.
Определены и обоснованы критерии выбора метода определения БЭ (гель-тромб тест или инструментальные методы), способствующие рациональному проведению испытаний.
Предложена процедура проведения валидационных исследований с
соответствующими параметрами и критериями приемлемости.
Теоретическая и практическая значимость работы:
Разработаны методики определения БЭ в 54 наименованиях АФС с экспериментальным обоснованием применения рабочего разведения для устранения мешающих факторов.
На фармацевтическом предприятии ФГУП ГНЦ «НИОПИК» были внедрены
рекомендации, направленные на устранение ложноотрицательных результатов при
определении БЭ в АФС терафтала (акт внедрения от
23.11.2005 г.).
Для 16 наименований АФС малорастворимых и практически нерастворимых в воде усовершенствованы методики пробоподготовки.
Впервые экспериментально подтверждена возможность использования этилового спирта 96% для определения БЭ в водонерастворимых АФС. Установлена кратность его разведения в воде, при которой отсутствуют мешающие факторы, влияющие на результаты опыта.
Установлено, что использование диметилформамида и диметилсульфоксида в качестве растворителей для водонерастворимых АФС нежелательно.
Материалы диссертации были использованы при подготовке ОФС 1.2.4.0006.15 «Бактериальные эндотоксины» Государственной Фармакопеи ГФ XIII издания, проекта ОФС «Бактериальные эндотоксины» Государственной Фармакопеи РФ XIV издания, ФС.2.10032.15 «Рифампицин» (акт внедрения 20.06.2017 г.), а также в разработке методических рекомендаций «» (2009 г.).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Критерии выбора растворителя для водонерастворимых фармацевтических субстанций.
-
Методики определения бактериальных эндотоксинов в фармацевтических субстанциях.
3. Результаты валидационных исследований разработанных методик.
Методология исследования заключалась в выборе оптимальных условий проведения испытаний АФС с помощью ЛАЛ-теста, апробации и валидации разработанных методик.
Степень достоверности и апробации результатов. Для проведения
экспериментальных работ использовано оборудование с действующими
свидетельствами о поверке, аттестации, калибровке.
Научные положения и выводы достаточно обоснованы, логически вытекают из полученных данных, основанных на значимом количестве экспериментальных исследований, обработанных статистически с помощью компьютерной программы «Statistica 6.0».
Достоверность первичных материалов подтверждена и не вызывает сомнений.
Апробация работы. Результаты и основные положения работы доложены и обсуждены на ХIII, ХIV, и ХV Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство», (Москва, 2006, 2007, 2008 г.), заседании секции медицинской и фармацевтической микробиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2017 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в рамках государственного задания, утвержденного Минздравом России 29.12.2014 г. на 2015 год и плановый период 2016 и 2017 гг., по НИР «Разработка и совершенствование научно-методических критериев стандартизации лекарственных средств для медицинского применения и последующей экспертной оценки их качества» (№ государственной регистрации 115111740008).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия, конкретно пункту 2 «формулирование и развитие принципов стандартизации и установление нормативов качества, обеспечивающих терапевтическую активность и безопасность лекарственных средств», пункту 3 – «разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах разработки, производства и потребления».
Личное участие автора в получении научных результатов. Автору
принадлежит основная роль в определении цели и постановке задач, выборе объектов
исследования, теоретических изысканий, проведении экспериментальных
исследований, обобщении результатов, а так же представлении материалов диссертационной работы в виде докладов, публикаций, проектов ОФС.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 4 -в изданиях, входящих в «Перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий» ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах компьютерного набора, содержит 29 таблиц, 21 рисунков, включает введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальные исследования (главы 2-5), список цитируемой литературы, содержащий 112 библиографических источников, из которых 53 работы зарубежных авторов.