Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 13
1.1. Свойства монооксида азота и его фармакологические действия в живых системах 13
1.1.1. Физико-химические свойства монооксида азота 14
1.1.2. Механизмы образования NO in vivo. Роль NO-синтаз 15
1.1.3. Пути метаболизма NO в организме 18
1.1.4. Монооксид азота как потенциальное лекарственное средство 22
1.2. NO-донирующие биологически активные соединения. Нитрозильные
комплексы как доноры монооксида азота в организме 24
1.2.1. Медицинские технологии с использованием NO 24
1.2.2. Нитрозильные комплексы, генерирующие NO, и их возможное применение в медицине 28
1.2.3. Механизм генерации NO из нитросодержащих препаратов 31
1.3. NO-НПВС как NO-донирующие биологически активные вещества 33
1.4. Роль нитроксидных радикалов – производных ТЕМПО в биологических процессах. Лекарственные формы с нитроксильными радикалами как потенциальные антиоксидантные препараты 39
1.4.1. ТЕМПО и его производные как миметики СОД и их антиоксидантная активность 40
1.4.2. Нитроксильные радикалы как компоненты потенциальных антиоксидантных препаратов 43
1.5. Методы анализа монооксида азота и его метаболитов 46
1.5.1. Метод ЭПР-спектроскопии при идентификации нитроксильных радикалов 46
1.5.2. Хемилюминесцентный метод определения NO 47
1.5.3. Электрохимический метод определения NO 48
1.5.4. Определение содержания метаболитов монооксида азота в
биологических образцах. Спектрофотометрический метод определения нитрит-аниона 49
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Объекты, материалы и приборы исследования 52
2.2. Методика получения монослоев Ленгмюра 53
2.2.1. Формирование монослоев и получение изотерм сжатия 54
2.3. Методика исследования биомиметического взаимодействия бис нитроксидного метанофуллерена и ТЕМПО с цитохромом с 55
2.4. Аналитические методики определения 5-нитрофурала, цитохрома с, натрия аскорбата и цинка оксида 56
2.4.1. Идентификация и количественное определение 5-нитрофурала и натрия аскорбата методом ВЭЖХ 56
2.4.2. Количественное определение цитохрома с атомно-абсорбционной спектроскопией в порошке 58
2.4.3. Количественное определение цинка оксида в порошке 58
2.5. Исследования влияния бис-нитроксидного метанофуллерена на антиоксидантные свойства дигидрокверцетина 59
2.6. Исследования эффективности действия мазей с ксимедоном и бис нитроксидным метанофуллереном на процессы заживления ожоговых ран у крыс и антиоксидантные свойства 60
2.7. Методика приготовления ранозаживляющих препаратов 61
2.8. Исследование эффективности действия ранозаживляющего препарата на процессы заживления ожоговых ран у крыс 61
ГЛАВА 3. Биомиметическое окислительно-восстановительное взаимодействие нитроксидных соединений с лекарственными веществами. результаты собственных исследований 64
3.1. Изучение взаимодействия газообразного монооксида азота и нитрита натрия с цитохромом с 66
3.2. Исследование биомиметического взаимодействия бис-нитроксидного метанофуллерена и ТЕМПО с цитохромом с 70
3.3. Влияние (NO)2-МФ на восстановление окисленных форм антиоксидантов и на их антиоксидантную активность 77
3.3.1. Изучение взаимодействия бис-нитроксидного малонатного метанофуллерена с дигидрокверцетином и аскорбиновой кислотой 79
3.3.2. Влияние бис-нитроксидного малонатного метанофуллерена на антиоксидантные свойства БАД с ДКВ 81
3.3.3. Биомиметическое взаимодействие бис-нитроксидного малонатного метанофуллерена с ксимедоном 82
3.3.4. Влияние бис-нитроксидного малонатного метанофуллерена на антиоксидантные свойства ксимедона 84
ГЛАВА 4. Разработка и стандартизация нового ранозаживляющего препарата 90
4.1. Обоснование состава ранозаживляющих препаратов 90
4.2. Разработка методик установления подлинности и количественного определения активных компонентов в ЛФ «Фуроцит» 92
4.2.1. Разработка пробоподготовки для проведения анализа активных компонентов противоожогового порошка «Фуроцит» 92
4.2.2. Разработка норм качества и валидационная оценка методики определения 5-нитрофурала и натрия аскорбата в порошке «Фуроцит» 94
4.2.3. Разработка норм качества и валидационных характеристик методики определения цитохрома с в порошке «Фуроцит» 97
4.2.4. Разработка норм качества и валидационная оценка методики определения цинка оксида в порошке «Фуроцит» 99
4.2.5. Спецификация на новый противоожоговый порошок «Фуроцит» 100
4.3. Вазодилатирующий эффект ранозаживляющего препарата на основе нитросодержащего компонента и цитохрома с 102
Заключение 109
Список литературы 113
- Физико-химические свойства монооксида азота
- Формирование монослоев и получение изотерм сжатия
- Исследование биомиметического взаимодействия бис-нитроксидного метанофуллерена и ТЕМПО с цитохромом
- Разработка методик установления подлинности и количественного определения активных компонентов в ЛФ «Фуроцит»
Физико-химические свойства монооксида азота
Скорость данной реакции высока и ограничена только быстротой диффузии частиц друг к другу (6,7Ю9М1 с"1) [59]. В ряде работ [76, 117, 122] было доказано, что антибактериальное действие пероксинитрит-аниона обусловлено ингиби-рованием цепи электронного переноса в митохондриях, связанного с процессами клеточного дыхания микроорганизмов. Пероксинитрит-анион играет ключевую роль в нарушении их энергетического метаболизма.
Достаточно эффективно NO реагирует и с свободными радикалами, так, при взаимодействии с гидроксильным радикалом образуется нитрит-анион: NO + OH— HN02 = = N02 +Н+ (1.13) Монооксид азота может взаимодействовать во внутриклеточной жидкости с различными веществами – тиолами, ионами металлов, сахарами, гемами протеинов, образуя различные типы нитрозильных комплексов.
В работе Осипова [29] высказано предположение, что динитрозильные же-лезосерные комплексы (ДНКЖ) являются стабильной формой существования NO в клетках. Эти комплексы образуются в макрофагах и эндотелиальных клетках при участии тиоловых групп белков или низкомолекулярных тиолов и негемового железа [145]. Кроме этого, в работе показано, что ДНКЖ имеют сходную физиологическую активность и стабильность с эндотелиальным релаксирующим фактором (EDRF), что свидетельствует об участии ДНКЖ в реализации биологического действия NO [108, 140].
S-нитрозотиолы (RSNO, GSNO, HbSNO) – продукты реакции S-нитрозилирования NO с тиоловыми группами аминокислот (сывороточный альбумин, глутатион), обладающие также как и ДНКЖ, EDRF-подобной активностью, но с более коротким временем жизни [140]. Кроме того, S-нитрозотиолы являются одной из форм депонирования NO в клетках, концентрация которых в плазме крови превышает в 3-4 раза концентрацию свободного NO. Распад нит-розопротеинов катализируется ионами металлов переменной валентности, например, ионами железа [56, 144, 150].
Кроме этого, NO способен нитрозилировать гемоглобин, взаимодействуя с его цистеиновым остатком, и образуя стабильный комплекс S-нитрозогемоглобин (HbSNO) [81, 82, 130]. За счет образования S-нитрозотиолов, NO может транспортироваться в организме [130], действуя как паракринный и эндокринный регулятор, то есть как «гормон» [131]. Нитрозильные комплексы цитохрома с Взаимодействие NO с геминовыми белками, включая взаимодействие с ци-тохромом с (cyt c) [3, 29, 30, 60, 65, 99], имеет особый интерес, поскольку образуются нитрозильные комплексы как в окисленном (1.15), так и в восстановленном (1.14) состояниях (cyt c2+ и cyt c3+):
Гемовое железо в нативном cyt с имеет шести-координационное состояние, а сам белок кроме четырех основных лигандов, содержит два аксиальных лиганда – гистидин в проксимальном положении и метионин – в дистальном. Под действием отрицательно заряженных липидов в cyt с происходит переход железа из низкоспинового шести-координационного состояния в высокоспиновую пяти-координированную форму [29].
Авторы работы [29] показали, что при взаимодействии NO с гемом наблюдается разрыв связи между метионином и железoм с пoследующим замещением аминoкислoты на NO в качестве шестогo лиганда. Следовательно, энергозатраты, связанные с замещением шестого лиганда, обуславливают низкие скорости реакций и константы равновесия. Таким образом, cyt с, в котором метионин алкили-рован, имеет на два порядка более высокое сродство к NO (2107 М-1), чем натив-ный белок [57].
Нитрозильный комплекс cyt c2+ имеет ЭПР сигнал с g 2,0. Шести координированное состояние железа в комплексе cyt c2+-NO было подтверждено низкотемпературным спектром ЭПР [29].
Помимо образования нитрозильных комплексов cyt с вступает в окислительно-восстановительные реакции c NO. Было доказано, что cyt с может восстановиться под действием NO по предложенной ниже схеме реакций [113]: cyt c3+ + NO cyt c3+-NO (1.16) cyt с3+-NO cyt с2+-NO+ (1.17) cyt с2+-NO+ + 2OH cyt с2+ + NO2- + H2O (1.18)
Авторами ряда работ было показано, что реакция cyt с2+ и NO в растворе является одной из основных реакций, катализируемых цитохромом с в митохондриях [115].
M.A. Sharpe, C.E. Cooper в своих работах оценивали аэробные реакции NO с митохондриальным цитохромом с. Исследования этих ученых доказали, что NO реагирует с ферроцитохромом с со скоростью 200 М-1с-1 с образованием ферри-цитохрома с (видимая спектроскопия) и нитроксильного аниона, который вступает в реакцию с кислородом с образованием пероксинитрита [133]. Связывание NO с феррицитохромом с приводит к образованию комплекса феррицитохрома с-NO. Константа диссоциации (Kd) комплекса равна 22±7 M. Реакции NO с цитохро-мом с играют роль в митохондриальном метаболизме NO, поскольку феррицито-хром с может выступать в качестве обратимой ловушки для избыточного содержания NO в митохондриях. Восстановление NO до NO- под действием ферроци-тохрома с приводит к необратимому ингибированию митохондриального потребления кислорода за счет образования пероксинитрита. Кроме того, авторы продемонстрировали реакцию восстановления NO до нитроксил-аниона (NO-), которая имеет константу скорости 200 M-1с-1 [133]: cyt с2+ + NO cyt с3+ + NO- (1.19) В литературе имеются данные, что нитрозильные комплексы могут изменять пероксидазную активность цитохрома с и управлять апоптозом [149]. Однако эти результаты противоречат данным работы [132], в которой показано, что эндогенное нитролизирование цитохрома с во время апоптоза является невозможным, поскольку цитохром с находится в шести-координационном состоянии, имеющий меньшее сродство к NO, чем пяти-координационный гем гуанилатциклазы и ци-тохромоксидазы. Одно из возможных объяснений этого результата является то, что cyt с претерпевает конформационные изменения во время апоптоза, что повышает активность гемового железа с NO. Такие изменения в cyt с происходят при связывании с анионными фосфолипидными везикулами, которыми богата митохондриальная мембрана [132]. Аналогичные конформационные изменения в cyt с были обнаружены в клетках на ранних стадиях апоптоза. Данные указывают на возможность липидов при апоптозе вызывать изменения в структуре cyt с. Такие конформационные изменения могут способствовать стабильному нитрозили-рованию гема цитохрома с во время апоптоза [30].
В настоящее время cyt с используется в качестве антиоксиданта и антигипо-ксанта, что обусловлено его уникальными биокаталитическими функциями: переносчика электронов при фотосинтезе, дыхании, окислительного фосфорилирова-ния и других окислительно-восстановительных процессов [13, 26, 50, 72, 73]. Учитывая вышеизложенное, следует ожидать расширение фармакологического спектра действия и усиление биологической активности cyt с за счет способности железопорфиринового гема металлопротеина к комплексообразованию с монооксидом азота и, соответственно, ингибирование апоптоза.
Формирование монослоев и получение изотерм сжатия
Изучение биомиметического взаимодействия нитроксидных соединений с цитохромом с (cyt с) осуществляли с использованием адслоев нитроксидных соединений на Si02 и ленгмюровских монослоев бис-нитроксидного метанофуллерена и УФ-спектроскопии растворов над ними.
Ленгмюровские монослои на водной субфазе являются удобной моделью для биомиметического исследования. Они позволяют оценить межмолекулярные взаимодействия молекул в монослое, так и молекул монослоя с компонентами субфазы на основании изучения изотерм сжатия. Молекулярная плотность монослоя легко контролируется на границе раздела фаз «воздух-вода». В данной работе ленгмюровские монослои используются для исследования red-ox состояний монослоев (NO)2-MФ, а предельная молекулярная площадь А0jHm (Ж))2-МФ зависит от заряд-зарядных взаимодействий между монослоем и компонентами субфазы [103].
При нейтральных рН (рН 5-7) предельная молекулярная площадь для плотной упаковки сфер молекул (Ш МФ равна 0,86 нм2, теоретически рассчитанная по данным рентгеноструктурного анализа площадь составляла 0,78 нм2 [151]. Незначительные различия в величинах теоретической и экспериментальной площади А0Дш1 (NO)2-MФ позволили авторам работ [43] предположить, что образующаяся пленка представляет собой монослой. Считается, что нитроксилсодержащая группа погружена в воду, а два фуллереновых цикла двух молекул (NO)2-MФ остаются связанными между собой [103].
Основной особенностью бис-нитроксидного метанофуллерена является легкость его взаимодействия с свободными радикалами [96, 107]. По этой причине фуллерены были названы «радикальными губками». «Окислительная» активность (NO )2-MФ связана с его способностью генерировать различные активные формы кислорода (АФК). Молекула (Ш МФ в возбужденном состоянии представляет собой сильный акцептор электронов, поэтому при наличии в среде доноров электронов - антиоксидантов возбужденные состояния могут восстанавливаться в анион-радикал [43]. В присутствии кислорода анион-радикал, отдавая электрон молекуле кислорода, превращает ее в супероксиданион-радикал (Схема 3.1).
Таким образом, одним из биологических свойств (NO )2-MФ является его антиоксидантная активность, и в биологических системах он способен выступать в роли антиоксиданта.
Сорбция органических лигандов на поверхности пористых оксидных носителей позволяет получать эффективные сорбенты, способные селективно извлекать вещества из различных сред. В качестве носителя в нашей работе был выбран силикагель.
Окислительно-восстановительные реакции между бис-нитроксидным мета-нофуллереном и ТЕМПО с cyt с изучались методом УФ-спектроскопии при нанесении нитроксидных соединений на твердый носитель-силикагель. На рисунке 3.6. продемонстрировано изменение UV-vis спектров растворов cyt с после его взаимодействия с ТЕМПО или (Ж) )2-МФ, сорбированных на Si02. В течение первых 30 минут появлялись полосы - (550 нм) и - (520 нм), характерные для cyt с2+, а положение -полосы отличалось в системах [ТЕМПО- cyt с] и [(NO )2-МФ-cyt с]. Рисунок 3.6б показывает динамику изменения -полосы во времени: в течение десяти часов -полоса cyt с в системе, содержащей ТЕМПО, соответствует положению -полосы для cyt с3 \ (пунктирная линия), а в системе [(Ш МФ -cyt с] -полоса характеризует восстановленную форму cyt с2+ (сплошная линия).
Таким образом, положение -полосы в присутствии ТЕМПО указывало на быстрое окисление cyt с2+. В отличие от этого под действием (Ж) )2-МФ восста новление железа (III) в геме cyt с носит необратимый характер, что характеризует (Ж) )2-МФ как сильный антиоксидант, red-ox потенциал которого меньше чем у Данные UV-vis спектров раствора cyt с после обработки сорбированным ТЕМПО (пунктирная линия) или (Ш МФ (сплошная линия) на Si02. a) A=f (); 6) = f (), где - время взаимодействия cyt с с сорбентом.
Предполагаемый механизм взаимодействия ТЕМПО с cyt с представлен на схеме 3.2. В течение этого процесса оксоаммониевый ион TEMПО+ непрерывно регенерируется in situ под действием первичных окислителей (О2, Fe3+ в цитохро-ме с). N-OH + Cyt c3+ N-0 + Cyt c2+
Таким образом, валентное координационное состояние Fe в геме цитохрома с, характеризующееся изменениями в видимой части электронного спектра, может быть использовано в качестве маркера окислительно-восстановительных реакций с участием самого Fe, а cyt c индикатором взаимодействия цитохрома с с нитроксильными частицами in vitro и (NO )2-МФ может выступать в роли восстановителя по отношению к соединениям, которые имеют окислительно-восстановительный потенциал ниже.
Для доказательства участия NO-фрагмента водонерастворимого (Ш МФ в восстановлении cyt c3+ на межфазной границе «водный раствор cyt c- (NO )2-МФ» изучено их взаимодействие с использованием ленгмюровских монослоев (Ж) )2-МФ на водной поверхности (субфазе) cyt c. Изменение структуры NO-фрагмента в монослоях (Ж) )2-МФ под действием cyt c устанавливали по зависимости предельной молекулярной площади А0 (NO )2-МФ от концентрации cyt c. Зависимость имеет вид изотермы адсорбции ленгмюровского типа с выходом на плато в области 1,35 ± 0,03 нм2 при концентрации cyt c равной 20 мг/л. Величина А0 увеличивалась от 0,88 до 1,40 нм2, что почти в 1,5 раза превышает АОДІШ в гомогенном монослое (NO )2-МФ (Рисунок 3.7).
Исследование биомиметического взаимодействия бис-нитроксидного метанофуллерена и ТЕМПО с цитохромом
В то же время у животных контрольной группы на 3 сутки наблюдали выраженное угнетение микроциркуляции (p 0,05 по отношению к уровню интакт-ных животных и представителей основной группы) с частичным восстановлением лишь к 10 дню после термической травмы. В то же время именно в ранний период обеспечивается наиболее эффективная стимуляция регенераторных процессов, запускаемая через NO-зависимые механизмы [24, 25, 74, 112].
Следует отметить, что на десятые сутки послеожогового периода уровень показателя микроциркуляции у крыс контрольной группы практически возвращался к значениям, характерным для интактных животных, тогда как в основной группе он оставался повышенным (p 0,05), оптимизируя условия для регенерации кожного покрова.
Анализ параметров вариабельности сердечного ритма позволил установить, что на третьи сутки после нанесения термической травмы у животных контрольной группы имел место выраженный стресс-ответ, тогда как крысы, лечение которых осуществляли с применением NO-содержащей композиции, демонстрировали менее существенные вегетативные сдвиги с акцентом на парасимпатическую стимуляцию (Рисунок 4.7).
Некоторые параметры вариабельности сердечного ритма крыс с термической травмой в зависимости от применного варианта местного лечения, « » – уровень статистической значимости различий p 0,05.
Так, у представителей контрольной группы на третьи сутки послеожогового периода имело место изменение структуры сердечного ритма со смещением его в симпатическую сторону, а при использовании NO-содержащей препарата соотношение индекса напряжения, отражающего симпатическую стимуляцию мио 107 карда, и амплитуды моды, визуализирующей ваготонические влияния, в целом соответствовало исходному уровню. На десятые сутки у крыс обеих групп наблюдали оптимизацию структуры сердечного ритма.
Наиболее четко указанные тенденции просматриваются в отношении спектральных параметров вариабельности сердечного ритма, в частности, соотношения мощностей спектра в диапазонах низких и высоких частот (Рисунок 4.8).
Соотношение мощностей спектра кардиоритма в диапазонах низких и высоких частот у животных с термической травмой в зависимости от применного варианта местного лечения, « » – уровень статистической значимости различий p 0,05. Установлено, что на третьи и на десятые сутки послеожогового периода у животных контрольной группы была обнаружена выраженная гиперсимпатикото 108 ния (до 0,2 усл. ед.), в то время как у крыс основной группы она была существенно меньшей, причем на десятые сутки после нанесения травмы регистрируется тенденция к нормализации указанного показателя.
В результате проведенных исследований веществ, содержащих в своем составе NO-высвобождающий фрагмент и их взаимодействия с биологически активными веществами, сформулированы условия образования NO in situ и разработаны нитроксидсодержащие ранозаживляющие препараты. Приведнные ниже выводы позволяют конкретно оценить полученные в диссертационной работе данные, которые могут быть использованы при разработке новых лекарственных средств.
1. Изучено взаимодействие нитроксидного фрагмента биологически активных веществ с цитохромом с в окисленной форме (cyt c3+), используя бис-нитроксидный малонатный метанофуллерен как модель нитроксид-генерирующих веществ и монооксида азота. Методами ЭПР и электронной спектроскопии доказано антиоксидантное действие нитроксидных фрагментов мета-нофуллерена, приводящее к восстановлению железа цитохрома с (cyt c2+) и образованию нитрозильного катиона.
2. Теоретически (электронная спектроскопия, биомиметическое моделирование на монослоях) и экспериментально (крысы) доказано увеличение антиокси-дантной активности препарата, содержащего ксимедон, в присутствии бис-нитроксидного метанофуллерена, содержащего стабильные NO-радикалы.
3. Сформулированы условия регулируемой генерации монооксида азота из препарата, содержащего натрия нитрит, натрия аскорбат и цитохром с (молярное соотношение компонентов 1:0,1:0,05) при совместном использовании цитохрома с в виде геля и порошка натрия нитрита. Образование монооксида азота и нитро-зильных комплексов в растворе и на ране доказано электронной спектроскопией (появление полосы нитрозильного комплекса - 358 нм, -полосы восстановленной формы цитохрома с – 415 нм, - и -полос в области 520 и 550 нм) и результатами с использованием реактива Грисса.
4. Установлено образование нитрозильных комплексов в растворах, содер жащих лекарственные нитраты – 5-нитрофурал, 5-нитроксолин, метронидазол, натрия аскорбат, и цитохром с. На основе спектральных исследований разработан состав двух ранозаживляющих препаратов наружного применения, содержащих 5-нитрофурал, цитохром с, натрия аскорбат, цинка оксид в форме порошка и ком бинированной лекарственной формы порошок+гель. Показано, что средства удо влетворяют требованиям ГФ 12.
5. В экспериментах на крысах линии Вистар на модели ожоговой раны установлено лучшее заживление раны за счет стимуляции регенеративных процессов и вазодилатирующего эффекта предлагаемых препаратов, содержащих нитропрепараты, цитохром с и натрия аскорбат.
6. Разработаны методы контроля качества порошка для лечения ожоговых ран, содержащего смесь цитохрома с, 5-нитрофурала, натрия аскорбата и оксида цинка. Предложены методики идентификации и количественного определения 5-нитрофурала и натрия аскорбата с использованием УФ-спектроскопии и ОФ ВЭЖ хроматографии.
7. Проведена валидационная оценка методов количественного определения всех действующих веществ по показателям правильность, воспроизводимость, линейность и сходимость.
Разработка методик установления подлинности и количественного определения активных компонентов в ЛФ «Фуроцит»
В результате проведенных исследований нами были предложены два проти воожовых средства в виде комбинированной лекарственной формы (гель+порошок) и в виде порошка. Комбинированная лекарственная форма представляет собой гель и порошок натрия нитрита, который добавляли в гелевую основу перед нанесением на раневую поверхность. В качестве гелеобразoвателя нами был выбрaна высoкомолеку-лярная натриевая соль гиалурoновой кислoты, хорошо зарекомендовавшая себя как компонент, способствующий регенерации различных тканей [26]. Роль консерванта выполняет метилпарабен (нипагин), способный в нейтральной среде (рН 6,5) проявлять антимикробные и фунгицидные свойства. Предложен следующий состав комбинированной лекарственной формы (масс. %): цитохром с 0,05 натрия аскорбат 0,10 метилпарабен 0,15 этиловый спирт 0,08 натрия гиалуронат 1,00 вода очищенная до 100,00 г Натрия нитрит в количестве 1,0 г добавляли в гель перед использованием средства. Относительная вязкостиь отн при разбавлении геля до 0,25% раствора натрия гиалуроната составила 25. Одним из востребованных направлений в комбустологии является вульне-росорбция, поскольку наряду с основными фармакологическими эффектами (антибактериальными, противовоспалительными, ранозаживляющими) способствует эффективному удалению экссудата, микроорганизмов и их токсинов из раны, используя компоненты лекарственных средств в качестве сорбентов. В связи с этим для лечения ожоговых ран нами предложена лекарственная форма в виде порошка.
Оптимизация состава порошка была выполнена, принимая во внимание доступность на рынке, высокую эффективность и минимальные побочные эффекты нитропрепаратов. Количественное содержание нитропрепарата должно быть в большом избытке по отношению к cyt с, выполняющего роль не только антиокси-данта и антигипоксанта, но и катализатора генерации монооксида азота в восстановленной форме. Избыток нитропрепарата необходим для усиления антибактериальных свойств ранозаживляющего препарата. Введение цинка оксида в состав средства обусловлено его антисептическими, вяжущими, подсушивающими свойствами. Основной компонент – наполнитель, должен обеспечивать необходимые технологические свойства порошка как сорбента для комбустологии: способность сорбировать экссудат, обеспечивать необходимую сыпучесть, не вызывать аллергических реакций.
Предложен следующий состав противоожогового средства (масс. %): 5-нитрофурал 0,50-5,00 цитохром с 0,05-0,1 аскорбиновая кислота или натрия аскорбат 0,10-1,00 цинка оксид 0,10-1,00 крахмал картофельный до 100,00 г На основании доклинических испытаний был выбран оптимальный состав ранозаживляющего порошка, в котором 5-нитрофурал содержится в десятикратном избытке по отношению к цитохрому с. Концентрация 5-нитрофурала была выбрана на основании данных в эксперименте на животных и составила 0,5% при постоянной концентрации цитохрома с, равной 0,05%, что показывало наилучшие вазодилатирующие свойства. 5-нитрофурал 0,50 цитохром с 0,05 аскорбиновая кислота или натрия аскорбат 0,10 цинка оксид 0,10 крахмал картофельный до 100,00 г
В ходе исследований показано, что порошок удовлетворяет требованиям ГФ 12 ч.2 по: сыпучести - от 3,93 до 4,05 г/с; насыпной массе - 0,885-0,890 г/см3; степени измельчения порошка, определенного по ситовому анализу (очень мелкий порошок –96% массы порошка проходит через сито номер 125 и 38% массы порошка проходит через сито номер 90) [7].
Разработка методик установления подлинности и количественного определения активных компонентов в ЛФ «Фуроцит»
Контроль качества ранозаживляющего препарата в виде порошка предполагает проведение оптимальной пробоподготовки для каждого вида анализа и количественного определения действующих компонентов с использованием методов модельных смесей.
Способ пробоподготовки представлен на схеме 4.1, основанный на способности основных компонентов растворяться в различных растворителях, и включает следующие стадии: I стадия пробоподготовки включает получение 3х растворов порошка путем добавления раствора азотной кислоты, воды дистиллированной и раствора ацетонитрил—фосфатный буфер 27:73 (/), которые в дальнейшем используются для анализа всех остальных компонентов. Порошок(cyt c+NaAsc+5-NO2Ф+ZnO+ + крахмал) у 5-NO2Ф+NaAscв CH3CN:фосф.- буф. р-ре H2U р-р Zn2+ + HAsc + Fe3+ крахмал+5-NO Ф осадок (ZnO +крахмал +cyt c) /ОУХ ААС р-р cyt c v Zn 5-N02Ф NaAsc осадок UV-vis 1 cyt c Схема 4.1. Общая схема установления подлинности и количественного определения основных компонентов противоожогового порошка. II стадия включает осаждение крахмала, оксида цинка и цитохрома с рас твором ацетонитрил—фосфатный буфер, центрифугирование и отделение осадка, и дальнейший количественный анализ натрия аскорбата и 5-нитрофурала в надо садочной жидкости методом ОФ-ВЭЖХ при длинах волн 310 и 254 нм, подвиж ная фаза ацетонитрил—фосфатный буфер 27:73 (/). III стадия включает качественный анализ методом УФ-спектроскопии, анализируя видимую область спектра (=410-415, 520, 550 нм), цитохрома с путем получения водного раствора порошка и удалением нерастворимого осадка. IV стадия – количественное определение железа в цитохроме с и цинка в цинке оксида атомно-абсорбционным спектрофотометрическим методом при длинах волн =248,33 и =213,9 нм, соответственно. Стадия включает осаждение крахмала концентрированной азотной кислотой в виде осадка, дальнейшее его удаление и анализ цинка и железа в надосадочной жидкости.
Разработка норм качества и валидационная оценка методики определения 5-нитрофурала и натрия аскорбата в порошке «Фуроцит» Идентифиaцию 5-нитрoфурaла прoвoдили, испoльзуя визуaльный тест (пе рехoд из желтoй в oрaнжевый цвет aци-сoли пoсле дoбaвления 30% гидрoксидa нaтрия) и УФ-спектрoскoпически, aнaлизируя пoлученный вoднo ацетoнитрильный рaствoр (=375 нм) и, сoпoстaвляя этoт спектр сo спектрoм aци-сoли (пoявление плечa =450 нм) (Рисунок 4.1).