Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Неорганические ионы в лекарственных средствах 11
1.2 Методы анализа неорганических ионов 16
1.3 Метод капиллярного электрофореза в анализе неорганических ионов 23
1.3.1 Сущность метода капиллярного электрофореза 24
1.3.1.1 Особенности метода капиллярного электрофореза. 24
1.3.1.1 Основные принципы капиллярного электрофореза. 25
1.3.1.2 Факторы, влияющие на разделение компонентов пробы при капиллярном электрофорезе 1.3.1.4 Разновидности капиллярного электрофореза. 32
1.3.1.5 Капилляры и их кондиционирование. 35
1.3.2 Особенности состава буферного раствора для анализа неорганических ионов методом капиллярного зонального электрофореза 38
1.3.2.1 Особенности анализа катионов. 39
1.3.2.2 Особенности анализа анионов 41
Выводы из обзора литературы. 44
ГЛАВА 2. Методы и материалы. 46
2.1 Объекты исследования. 46
2.2 Оборудование . 48
2.3 Реактивы и расходные материалы 48
ГЛАВА 3. Оптимизация условий разделения и детектирования методом капиллярного электрофореза. 51
3.1 Подбор условий разделения и детектирования катионов. 51
3.1.1 Подбор концентрации контрастного вещества 52
3.2 Тест пригодности электрофоретической системы для определения катионов. 60
3.3 Валидация методики идентификации и количественного определения катионов.
3.3.1 Валидация и метрологическая оценка методики для качественного и количественного анализа растворов для инфузий . 61
3.3.2 Валидация и метрологическая оценка методики в диапазоне 80-120 мг/л для качественного и количественного определения катионов калия, кальция, натрия и магния в таблетированных лекарственных препаратах. 73
Выводы по главе 3 83
ГЛАВА 4. Определение катионов в лекарственных препаратах . 84
4.1 Исследование растворов для инфузий. 84
4.2 Количественное определение катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах различной химической структуры . 102
Выводы по главе 4 110
Общие выводы. 111
Список использованной литературы
- Методы анализа неорганических ионов
- Оборудование
- Валидация и метрологическая оценка методики для качественного и количественного анализа растворов для инфузий
- Количественное определение катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах различной химической структуры
Методы анализа неорганических ионов
При зональном электрофорезе буфер, значение рН, а также напряженность поля во всем пространстве разделения остаются постоянными. Вещества разделяются за счет различий в электрофоретических подвижностях. Они вводятся в виде отдельной зоны на входе в капилляр и обнаруживаются в виде отделенных друг от друга зон на конце детектора. Назначение буфера при этой технике разделения -поддерживать постоянное значение рН и задавать необходимый электроосмотический поток, зависящий от концентрации, компонентов и pH буфера. Также выбор рН буфера определяется зарядом ионов пробы. Для дальнейшей оптимизации могут использоваться добавки к буферу, такие как различные селекторы, ПАВ, органические растворители. Электрофорез в гомогенной буферной системе при унифицированной напряженности поля является стандартным методом, который особенно эффективен при разделении малых молекул с постоянным зарядом. Поэтому он является наиболее пригодным для разделения неорганических ионов, алифатических и ароматических карбоновых кислот, сульфокислот, аминокислот, фенолов, нуклеотидов и аминов [10; 27; 66].
При изотахофорезе все компоненты пробы движутся с одинаковой скоростью. Однако из-за проблем выбора конкретных электролитов и ограничений в выборе детекторов (применимы только детекторы по электропроводности) этот метод невозможно использовать в качестве точного аналитического метода. В случае ИТФ проба вводится между двумя электролитами с различными подвижностями ионов, выбранными так, чтобы они ограничивали подвижности компонентов пробы. Обычно ведущий электролит обладает наивысшей, а конечный электролит - наиболее низкой подвижностью из всех движущихся ионов. После достижения стационарного состояния все одинаково заряженные ионы движутся с одинаковыми скоростями. В каждой зоне при ИТФ имеется своя напряженность поля. Внутри каждой зоны напряженность поля постоянна, изменения происходят скачком на границах зон. По этой причине методом ИТФ разделяли только анионы или катионы. ИТФ преимущественно применяют для разделения неорганических ионов и органических карбоновых кислот. Из-за проблем детектирования и трудностей, связанных с нахождением подходящих электролитов, для проб неизвестного состава метод ИТФ неприменим. ИТФ, также как вытеснительная хроматография, способен концентрировать разбавленные пробы, поэтому он может быть использован на стадии предварительного концентрирования перед разделением методом КЭ. Этим разрешаются проблемы, связанные с дозировкой относительно больших объемов разбавленных проб [10; 27; 64; 66].
Мицеллярная электрокинетическая хроматография. С помощью данного метода проводится разделение незаряженных компонентов пробы за счет различной вероятности нахождения их в водной (подвижной) и псевдостационарной (мицеллярной) фазах. При добавлении к буферу детергентов при превышении их критической концентрации мицеллообразования образуются мицеллы, которые обладают гидрофобным характером внутри и заряжены снаружи, чем и достигается их электрофоретическая подвижность в электрическом поле. В зависимости от знака заряда эта электрофоретическая подвижность направлена в сторону катода или анода. МЭКХ может быть реализована в той же аппаратуре, что и КЗЭ и требует лишь добавок детергента. Наиболее часто в качестве детергента используется додецилсульфат натрия. Получаемые мицеллы имеют отрицательный заряд и приобретают электрофоретическую подвижность в направлении анода. По аналогии с КЗЭ эффективная скорость перемещения компонентов пробы, так же, как и мицелл, представляет собой векторную сумму электрофоретической и электроосмотической скоростей. Если вклад электрофоретической подвижности мицелл меньше вклада электроосмотической подвижности, то мицеллы движутся в сторону катода, т.е. в сторону детектора. Полярные молекулы, которые задерживаются только в водной фазе, движутся со скоростью электроосмотического потока и, спустя «мертвое» время, достигают детектора. Сильно гидрофобные молекулы пробы задерживаются прежде всего внутри мицелл и движутся со скоростью мицеллы. Вследствие того, что молекулы пробы взаимодействуют с псевдостационарной фазой, точность метода МЭКХ соответствует точности обычного хроматографического метода. Значение нагрузочного коэффициента k , по аналогии с хроматографией, можно определить как соотношение между числом молекул пробы в подвижной и стационарной фазах. В отличие от ВЭЖХ, в данном случае через детектор могут проходить также молекулы пробы полностью связанные с псевдостационарной фазой. Для определения «мертового» времени в качестве инертных маркеров подходят: ацетон; формамид или метанол - взаимодействием которых с мицеллами можно пренебречь и которые движутся со скоростью ЭОП. В дальнейшем эти вещества можно детектировать с помощью УФ-поглощения или изменения показателя преломления как пик показателя преломления. В качестве маркера для определения времени миграции мицелл находят применение такие водорастворимые соединения, которые задерживаются только внутри мицелл, например, судан III и судан IV [10; 27; 66].
Область применения метода МЭКХ не ограничивается только разделением нейтральных веществ, им можно разделять и заряженные пробы. Распределение веществ между водной и мицеллярной фазами может приводить к росту селективности и воздействовать тем самым на разделение ионов с очень схожими электрофоретическими подвижностями. В этих случаях разрешение пиков, достигаемое методом МЭКХ, превышает разрешение КЗЭ. Данный метод можно использовать для определения некоторых металлов после образования комплексов [60; 62; 65].
Идеальный материал капилляра должен быть химически и электрически инертным, а также прозрачным в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Чаще всего в качестве материала капилляра используется кварц. Однако данный материал является весьма хрупким, поэтому используется полиимидное покрытие, что значительно улучшает эксплуатационные характеристики капилляра. Для обеспечения возможности обнаружения веществ с помощью спектрофотометрического детектора, на капилляре делается оптическое окошко (удаляется полиимидное покрытие) в месте прохождения луча. Альтернативным материалом для капилляров является тефлон. Он прозрачен в ультрафиолетовой области спектра и, поэтому, специального окошка не требуется. Хотя на поверхности тефлонового капилляра нет заряда, электроосмотический поток тоже оказывается значительным. Кроме того, трудно получить капилляры с равномерным внутренним диаметром; отмечаются трудности, связанные с адсорбцией образца (аналогичные встречающимся при работе с кварцем); тефлон обладает плохой способностью к теплопередаче. Эти недостатки ограничивают его область применения. [52]
Обычно используются капилляры с внутренним диаметром 25 - 75 микрон и внешним диаметром 350 - 400 микрон. Если исходить из потребности сокращения продолжительности анализа, следует применять самые короткие капилляры. Диапазон эффективной длины капилляров составляет от 10 см (для капилляров, заполненных гелем) до 100 см (капилляры для разделений по методу капиллярного зонального электрофореза). Наиболее часто пользуются капиллярами, имеющими эффективную длину 50 - 75 см [27; 52].
В связи с использованием капилляров со столь малым диаметром одной из основных проблем в капиллярном электрофорезе является концентрационная чувствительность. В сравнении с ВЭЖХ путь луча детектора является приблизительно в 12-20 раз меньшим и предел обнаружения уменьшается примерно в 100 раз. Для улучшения пределов детектирования используются капилляры с пузырьком в месте детектирования (увеличение оптического пути в 3 раза) или применяются специальные кюветы (увеличение оптического пути в 10 раз) [27; 52].
Оборудование
По полученным результатам видно, что оптимальной является концентрация имидазола 15-20 ммоль/л. При низких концентрациях не достигается необходимого разделения катионов магния и натрия, присутствует нестабильность базовой линии. При высоких концентрациях происходит значительное возрастание шума, наблюдается нестабильность базовой линии, потеря эффективности в результате избыточного джоулева разогрева и нарушается разделение катионов кальция и натрия.
Первоначально для приготовления буфера использовалась уксусная кислота, однако были обнаружены искажения аналитического сигнала для низких концентраций ионов калия. После замены уксусной кислоты на муравьиную такие искажения не наблюдались.
Значение pH буферной системы определеялось pKa муравьиной кислоты (pKa = 3,75, для обеспечения максимальной буферной емкости и стабильности системы), а так же pKa имидазола и определяемых веществ (должны быть ионизированы).
Для исследования зависимости эффективности разделения от pH была проанализирована смесь катионов с использованием буферных систем с различными значениями pH. Полученные данные представлены на рисунках 7 и 8. Рисунок 7. Зависимость электрофоретического поведения исследуемых катионов от pH.
В диапазонах pH 3,0 - 3,5; 4,5 - 6,0 наблюдалась нестабильность базовой линии. При возрастании pH наблюдается уменьшение времен миграции, вследствие увеличения скорости электроосмотического потока. Хотя данное явление можно рассматривать как позитивное, при значениях pH от 4.0 и выше наблюдалось уменьшение буферной емкости и, вследствие этого, усложнение титрования для получения необходимого значения pH, что приводит к ухудшению робастности системы. Рисунок 8. Зависимость кажущегося числа теоретических тарелок (ось ординат) от pH. Использовались средние значения трех определений для каждого типа буфера.
Изменение значения pH не оказывало существенного влияния на кЧТТ исследуемых катионов, за исключением катионов магния – параметр увеличивался при росте pH, пока значение не составило более 5,5, после чего происходило его уменьшение.
Поскольку, при капиллярном зональном электрофорезе в рабочем буфере, состоящем только из имидазола и муравьиной кислоты, не происходит разделения катионов калия и катионов аммония, как возможной примеси, добавляли 18-краун-6 эфир. Было исследовано влияние концентрации 18-краун-6 эфира (0; 0,32; 1; 1,5; 2; 2,5; 4 ммоль/л) на разделение катионов и относительные времена миграции. Полученные результаты представлены на рисунках 9 и 10 соответственно, а также в приложении 2. кЧТТ
На рисунках 9 и 10 видно, что 18-краун-6 эфир селективно уменьшает электрофоретическую подвижность катионов калия, что приводит к их разделению с катионами аммония.
По приведенным данным можно сделать вывод о том, что концентрация 18-краун-6 эфира около 2 ммоль/л является достаточной для необходимого разделения катионов калия с другими исследуемыми катионами.
Таким образом, оптимальный состав рабочего буферного раствора (на литр) для определения катионов можно определить как: 15-20 ммоль имидазола, 2 ммоль 18-краун-6 эфира, кислоты муравьиной до рН 3,6, воды деионизированной до 1 л.
При количественной оценке использовалось соотношение площади пика ко времени миграции, поскольку исследуемые ионы мигрируют с разной скоростью и, вследствие этого, могут проводить разное количество времени в зоне детектирования.
Для уменьшения отклонений количественных результатов проводилась их коррекция по внутреннему стандарту (катионам лития) - в расчетах использовались приведенные соотношения площадей пиков к временам миграции относительно внутреннего стандарта.
Расчет содержания катионов проводили по уравнению линейности, получаемому при калибровке (зависимость концентрации от получаемого скорректированного соотношения площади пика к времени миграции). Скорректированное отношение площади пика к времени миграции определяли по формуле: Cst St tst tt sst где Cst - концентрация внутреннего стандарта в пробе, мкг/мл; Sst -полученная площадь пика внутреннего стандарта на электрофореграмме; S; -полученная площадь пика исследуемого катиона; tst - полученное время миграции внутреннего стандарта, мин.; t; - полученное время миграции исследуемого катиона, мин. 3.2 Тест пригодности электрофоретической системы для определения катионов. Электрофоретическая система считалась пригодной, если выполнялись следующие условия:
Валидация методики идентификации и количественного определения катионов. Оценка разработанной методики была проведена согласно ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» и [4]. Методика была провалидирована по следующим параметрам: специфичность, линейность, сходимость, правильность. 3.3.1 Валидация и метрологическая оценка методики для качественного и количественного анализа растворов для инфузий.
Оценка специфичности. Специфичность – это способность аналитической методики давать правильный результат определения вещества в присутствии сопутствующих компонентов.
Специфичность методики проверялась исследованием модельной смеси, содержащей некоторые другие лекарственные вещества, встречающиеся в лекарственных препаратах вместе с исследуемыми катионами (рутин, фолиевая кислота, рибофлавин, аскорбиновая кислота, никотинамид, ретинола ацетат, токоферола ацетат), а также часто используемые вспомогательные вещества (целлюлоза, крахмал, глюкоза, фруктоза, лактоза, сахароза). Полученные электрофореграммы представлены на рисунке 11.
Валидация и метрологическая оценка методики для качественного и количественного анализа растворов для инфузий
Растворы для инфузий являются широко распространенными лекарственными средствами для детоксицирующей, плазмозамещающей и восстановительной терапии. Особенностью данных лекарственных препаратов является введение их значительных объемов парентеральным способом, что обуславливает необходимость тщательного контроля их безопасности и качества, в том числе определения катионов калия, кальция, натрия и магния, как основных действующих веществ.
Особенностью данных препаратов с аналитической точки зрения является значительное преобладание концентрации натрия и, соответственно, возможное неполное разделение на электрофореграмме зон с данным катионом и других при недостаточно оптимизированных условиях.
При исследованиях применялась следующая методика подготовки проб: точную навеску образца (около 5 г) помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли около 1 г (с точностью до 0,01 г) раствора лития ацетата с содержанием ионов лития 0,05 %, затем доводили объем раствора водой до метки, перемешивали. При необходимости отбирали аликвоту и центрифугировали при 20000 g, около 700 мкл переносили в виалу на 2 мл для последующего проведения КЗЭ.
Разработанная методика была апробирована на 19 образцах растворов для инфузий. Результаты представлены в таблице 22. Примеры полученных электрофореграмм представлены на рисунках 20 - 37. Поскольку для всех препаратов характерно сравнительно одинаковое количественное соотношение компонентов, а именно значительное преобладание содержания ионов натрия по сранению с другими катионами, для построения калиброчного графика использовалась стандартная смесь катионов с концентрацией, сходной с концентрациями в исследуемых объектах. Также необходимо отметить, что хотя получаемый сигнал для катионов кальция и магния в препаратах "Мафусол", "Квинтасоль" и "Рингер" был сравнительно слабым, при данном разбавлении сохранялась линейность в необходимом диапазоне. Повышение концентрации за счет разбавления приводило к нарушению линейности отклика для катионов натрия.
Электрофореграмма пробы препарата «Раствор Хартмана». Состав: кальция хлорид 0,294 г; калия хлорида 0,373 г; натрия хлорида 6,02 г; натрия лактат 3 г (на 1 л) Рисунок 22. Электрофореграмма пробы препарата «Квинтасоль». Состав: натрия хлорид 5,26 г; калия хлорид 0,37 г; кальция хлорид 6-водный (в пересчете на безводный) 0,28 г; магния хлорид 6-водный (в пересчете на безводный) 0,14 г; натрия ацетат 3-водный (в пересчете на безводный) 4,1 г (на 1 л)
Полученные электрофореграммы показывают, что в предложенных условиях происходило полное разделение всех присутствующих катионов в исследованных образцах. Также имеется возможность определения примеси иона аммония в присутствии катионов калия.
Метрологическая оценка полученных результатов представлена на примере препаратов: «Квинтасоль» (ОАО «Биосинтез», 30911) в таблице 18, препарата «Мафусол» (ОАО «Биосинтез», 60412) в таблице 19, препарата «Мафусол» (ОАО «Биосинтез», 40511) в таблице 20, препарата «Рингер» (ОАО «Биосинтез», 40511) в таблице 21. Таблица 18. Метрологическая оценка результатов количественного определения неорганических катионов в препарате Квинтасоль (ОАО «Биосинтез», 30911).
Катион Норма понормативнойдокументации,мг/л Найденнаяконцентрация впробе, мг/л Среднее, мг/л Дисперсия (D) Стандартное отклонение (S) Полуширина доверительного интервала (при P=0,95) Относительная ошибка среднего результата, %
Таблица 20 Метрологическая оценка результатов количественного определения неорганических катионов в препарате «Мафусол» (ОАО «Биосинтез», 40511).
Катион Норма понормативнойдокументации,мг/л Найденнаяконцентрация впробе, мг/л Среднее Дисперсия (D) Стандартное отклонение (S) Полуширина доверительного интервала (при P=0,95) Относительная ошибка среднего результата, %
Полученные результаты количественного определения катионов в растворах для инфузий соответствовали нормам количественного содержания указанных катионов в нормативной документации из чего можно сделать вывод о применимости разработанной методики к анализу катионов калия, натрия, кальция и магния в растворах для инфузий.
Основными особенностями, имеющими значение для исследования таблетированных лекарственных препаратов является присутствие в их составе других действующих и вспомогательных веществ, а также необходимость перевода содержащихся в них катионов в раствор для последующего анализа. Для определения оптимальных условий экстрагирования проводилась серия испытаний на таблетированном препарате (имеющим следующий состав вспомогательных веществ: целлюлоза микрокристаллическая, повидон, лактоза, кросповидон, маннитол, магния стеарат, сахароза, рисовый крахмал, тальк, титана диоксид, кантаксантин 10% водорастворимый, парафин твердый, парафин жидкий легкий) с различными вариантами условий экстрагирования. В качестве экстрагентов использовались следующие растворители: вода, раствор хлористоводородной кислоты с концентрацией 0,5 моль/л, раствор хлористоводородной кислоты с концентрацией 0,1 моль/л, раствор муравьиной кислоты с концентрацией 1%.
Количественное определение катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах различной химической структуры
Поскольку определяемые вещества не обладают необходимым поглощением в УФ и видимой областях спектра электромагнитного излучения, обычно применяется непрямое детектирование - зоны веществ регистрируются как области с пониженной концентрацией поглощающего вещества. Хотя помимо этого существуют различные варианты детектирования, применяющиеся для данных объектов (масс спектрометрический, хемилюминисцентный, электрохимический, флуоресцентный, и т. д.), данный подход является наиболее распространенным, что, по-видимому, связано с распространенностью коммерческих систем для капиллярного электрофореза, оснащенных спектрофотометрическим детектором [27; 65]. Для получения фонового электролита с оптимальным составом для капиллярно-зонального электрофореза неорганических катионов с косвенным детектированием следует придерживаться ряда положений [10; 18; 27]: 1. Буферный электролит должен содержать достаточную концентрацию ионов, чтобы проводить ток, создавать условия для оптимального разделения и не быть причиной избыточного Джоулевого разогрева; 2. По крайней мере один компонент буфера должен иметь достаточную буферную емкость при выбранном значении pH, т.е. pH раствора должен быть в диапазоне pK ± 1 буферного компонента; 3. Ион, обеспечивающий фоновый сигнал, в буферном электролите должен иметь сходную с определяемыми компонентами электрофоретическую подвижность для уменьшения размывания зон и, вследствие этого, потери эффективности из-за электродисперсии; 4. Следует избегать использования нескольких мигрирующих в одном направлении с исследуемыми веществами ионов, поскольку это приводит к формированию системных зон, которые при взаимодействии с зонами исследуемых веществ могут искажать количественные результаты анализа. Таким образом, состав буферного электролита должен быть максимально простым.
В качестве фоновых электролитов используются вещества с близкой наблюдаемой электрофоретической подвижностью по отношению к исследуемым катионам и обеспечивающие необходимое фоновое поглощение для осуществления косвенного детектирования. Сравнение электрофоретических подвижностей ряда катионов и веществ, используемых для непрямого детектирования представлены в таблице 5. Видно, что катионы аммония и калия имеют одинаковые значения электрофоретических подвижностей, в связи с чем для их разделения в процессе анализа рекомендуется использовать селективно взаимодействующие с ними специальные вещества, например 18-краун-6 эфир. Данное вещество взаимодействует с ионами калия по принципу хозяин-гость за счет наличия полости внутри молекулы, что приводит к селективному уменьшению подвижности катионов калия и отделению их зоны от зоны катионов аммония. Для улучшения разделения d-элементов и щелочно-земельных металлов используют добавки в рабочий буфер различных окси-кислот, таких как молочная, гидроксиизомасляная, лимонная, щавелевая и т. д. По литературным данным они образуют комплексные соединения с металлами в процессе анализа, что также приводит к изменениям электрофоретических подвижностей [7; 10; 43].
Наиболее часто используемым фоновым электролитом является имидазол, что связано с его электрофоретической подвижностью и стабильностью [10; 15; 27]. Примеры буферных систем для анализа катионов представлены в таблице 6. Таблица 5. Электрофоретические подвижности катионов.
Помимо представленных в предыдущем разделе положений, при анализе неорганических анионов можно выделить следующие особенности: 1. Для анализа анионов с высокой электрофоретической подвижностью предпочтительным является использование обращенной полярности, поскольку их миграция будет происходить в сторону анодного конца. 2. Применение модификаторов направления электроосмотического потока для уменьшения размывания зон анализируемых веществ, так как в обычных условиях анионы мигрируют в направлении противоположном направлению миграции электроосмотического потока. В качестве модификаторов применяются цетилтриметиламмония бромид, цетилтриметиламмония гидроксид, тетрадецил триметиламмония бромид, тетрадецилтриметиламмония гидроксид, миристилтриметил амония бромид, гексаметоний, гексадиметрин и другие подобные вещества. 3. При подборе фоновых веществ для непрямого детектирования руководствуются принципами, представленными выше. В качестве таких веществ используются: фталаты, пиромеллитовая кислота, дипиколиновая кислота, тримеллитовая кислота, морфолинэтансульфоновая кислота, 2,4-динитробензойная кислота, бензойная кислота, салициловая кислота и др. Из неорганических веществ используются молибдаты, хроматы, однако по литературным данным фоновый электролит с хромат-ионами является недостаточно стабильным, так как через несколько часов после приготовления начинается выпадение мелкокристаллического осадка, что оказывает негативное влияние на процесс анализа [10], хотя рабочие буферные растворы на основе хромат-ионов являются очень популярными, поскольку хромат-ионы имеют высокую подвижность и сравнительно широкую полосу поглощения электромагнитного излучения [27]. Пиромеллитат-ионы имеют меньшую подвижность, однако рабочий буферный раствор на их основе является более стабильным и может обеспечить лучшую чувствительность [46]. Для предотвращения данного явления необходимо придерживаться определенной последовательности смешивания. Подвижности исследуемых ионов и веществ, используемых в качестве фоновых представлены в таблице 7. Таблица 7. Электрофоретические подвижности анионов.