Введение к работе
Актуальность исследования и степень разработанности темы
диссертации. В настоящее время ощущается острая потребность в
оригинальных лекарственных препаратах [Третьякова Е.А. и др., 2012; Kinch
M.S. et al., 2014; Кубиньи Г., 2006]. Вещества природного происхождения до
сих пор остаются актуальными для поиска соединений-лидеров в современном
драг-дизайне [Кубиньи Г., 2006; Стоник В.А. и др., 2008; Hill R.G. et al., 2013].
Одним из перспективных путей создания новых препаратов является
молекулярное капсулирование фармаконов растительными
углеводсодержащими метаболитами [Стоник В.А. и др., 2008; Толстиков Г.А. и др., 2007; Толстикова Т.Г. и др., 2007; Tolstikova T.G. et al., 2009]. Исследования в этой области являются важным направлением современной фармацевтической химии и наномедицинских биотехнологий. Молекулярное комплексообразование может быть использовано для адресной доставки, контролируемого высвобождения, повышения биодоступности, расширения спектра биологической активности, повышения стабильности, снижения терапевтической дозы и побочных эффектов лекарственных средств, а также для изменения или расширения спектра биологической активности самого носителя фармакона [Толстиков Г.А. и др., 2007; Толстикова Т.Г. и др., 2007; Tolstikova T.G. et al., 2009; Polyakov N.E. et al., 2011].
В данном направлении дизайна лекарств традиционно используют циклические олигосахариды (циклодекстрины, CD) и их производные [Challa R. et al., 2005; Brewster M.E. et al., 2007; Singh R. et al., 2010]. Получены комплексы фармаконов с различными полисахаридами [Tolstikova T.G. et al., 2009; Dushkin A.V. et al., 2012].
Молекулярное капсулирование фармацевтических субстанций
растительными тритерпеновыми гликозидами исследовано еще эпизодически. Работы по установлению природы межмолекулярных взаимодействий при образовании таких комплексов, определению их истинного состава и устойчивости совокупностью современных физико-химических методов еще малочисленны. Наиболее изучены супрамолекулярные комплексы глицирризиновой кислоты (GA), главного тритерпенового гликозида солодки, и ее моноаммонийной соли (глицирама, GC) [Толстиков Г.А. и др., 2007; Толстикова Т.Г. и др., 2007; Tolstikova T.G. et al., 2009; Polyakov N.E. et al., 2011; Dushkin A.V. et al., 2012]. На основе комплексов GA создано несколько лекарственных
препаратов [Толстиков Г.А. и др., 2007]. Но GA и GC из-за наличия 11-оксо-группы в их агликоне имеют структурное сходство с 11-оксостероидами. Поэтому они обладают минералокортикоидной активностью [Толстиков Г.А. и др., 2007], что ограничивает их применение.
Тритерпеновые гликозиды плюща и солодки являются одними из наиболее коммерчески доступных сапонинов [Hostettmann K. et al., 1995]. В России солодка распространена на юге европейской части, Северном Кавказе, юге Урала и в Западной Сибири. Плющ встречается в Крыму и на Черноморском побережье Кавказа. Однако тритерпеновые гликозиды плюща в качестве молекулярных контейнеров фармаконов ранее не рассматривались. Гликозиды плюща, как GA и GC, обладают амфифильностью. Но в отличие от GA и GC, агликоны гликозидов плюща не имеют 11-оксо-группы. Особенности физико-химического взаимодействия между тритерпеновыми гликозидами плюща и фармацевтическими субстанциями не изучены.
Одной из основных задач государственной программы России по развитию национальной фармацевтической и медицинской промышленности на период до 2020 г. является разработка оригинальных лекарственных средств [Постановление Правительства РФ от 15 апреля 2014 г. № 305]. Поэтому расширение арсенала тритерпеновых гликозидов, используемых для комплексообразования фармацевтических субстанций, актуально для инновационных решений в области дизайна отечественных лекарств. Тритерпеновые гликозиды сами обладают разнообразной биологической активностью [Hostettmann K. et al., 1995], что значительно расширяет возможности для создания новых лекарственных препаратов на основе их молекулярных комплексов.
Остается актуальным поиск доступных экспресс-методов фармацевтического анализа тритерпеновых гликозидов в растительном сырье и лекарственных препаратах на его основе. Для этих целей часто используют метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), однако при этом для идентификации гликозидов обычно применяют достаточно агрессивные реагенты, не всегда обладающие высокой селективностью [Hostettmann K. et al., 1995].
Цель работы. Направленная функционализация биологически активных соединений с помощью молекулярного комплексообразования тритерпеновыми гликозидами плюща и солодки с целью поиска новых перспективных фармацевтических субстанций для отечественных лекарств, включая изучение состава комплексов, их устойчивости и биологической активности, а также природы межмолекулярных взаимодействий между компонентами. Проведение
фармацевтического анализа тритерпеновых гликозидов, содержащихся в плюще и лекарственных препаратах на его основе.
Основные задачи исследования:
1. Выделение тритерпеновых гликозидов а-хедерина (гликозид 1) и
хедерасапонина С (гликозид 2) экстракцией из листьев плющей обыкновенного
Hedera helix L., крымского Hedera taurica Carr. и канарского Hedera canariensis
Willd. (Araliaceae Juss.), их разделение и очистка методом колоночной
хроматографии и подтверждение структуры химическими (кислотный и щелочной
гидролиз) и физико-химическими методами (ИК-, масс- и ЯМР-спектроскопией).
-
Жидкофазный синтез молекулярных комплексов тритерпеновых гликозидов 1, 2 и GC с фармацевтическими субстанциями и биомолекулами. Установление состава полученных комплексов методом изомолярных серий и масс-спектрометрии. Сравнительная оценка устойчивости комплексов гликозидов и других углеводсодержащих метаболитов (CD и их производные). Выявление комплексов, являющихся лидерами по стабильности. Подтверждение комплексообразования методами ИК-, УФ-, масс- и ЯМР-спектроскопии. Установление функциональных групп, участвующих в межмолекулярном взаимодействии.
-
Исследование моллюскоцидной, ихтиотоксической, нейротропной, аллелопатической и противоопухолевой активности гликозидов и комплексов, а также оценка их влияния на состояние эритроцитов и агрегацию гетерохроматина.
-
Установление зависимости между строением и биологическими свойствами веществ. Характеристика молекулярных основ действия тритерпеновых гликозидов. Оценка влияния процесса комплексообразования на проявление биологической активности тритерпеновых гликозидов. Выявление общих закономерностей между различными видами биологического действия гликозидов.
-
Поиск новых детектирующих реагентов для ТСХ тритерпеновых гликозидов. Идентификация тритерпеновых гликозидов в составе лекарственных препаратов на основе листьев плюща обыкновенного.
6. Оценка перспектив использования полученных комплексов в
разработке новых лекарственных препаратов.
Научная новизна. Впервые осуществлена направленная функционализация биологически активных веществ путем их молекулярного комплексообразования с тритерпеновыми гликозидами плюща, позволяющая
решать актуальные проблемы в области дизайна отечественных лекарственных средств, связанные с поиском перспективных фармацевтических субстанций, их стабильностью и изучением закономерностей «строение – биоактивность».
В рамках этого направления гликозиды плюща впервые рассмотрены в качестве молекулярных носителей фармацевтических субстанций. Разработаны условия жидкофазного способа получения комплексов. Всего синтезировано 70 новых молекулярных комплексов тритерпеновых гликозидов плюща и солодки с аминокислотами (глицином (Gly), аланином (Ala), валином (Val), фенилаланином (Phe), тирозином (Tyr), триптофаном (Trp), гистидином (His), аргинином (Arg), аспарагиновой кислотой (Asp), аспарагином (Asn)), азотистыми основаниями нуклеиновых кислот (аденином (Ade), гуанином (Gua)), холестерином (Chol), -циклодекстрином (-CD), друг с другом и фармацевтическими субстанциями (кофеином (Caf), стрептоцидом (Str), парацетамолом (Par), ацетилсалициловой кислотой (AcSal), силденафилом (Sil), цитратом силденафила (виагрой, SC), левомицетином (Lev), бромгексином (BG), метилурацилом (MeUra) и доксорубицином (DOX)). Впервые получены молекулярные комплексы тритерпеновых гликозидов друг с другом. Комплексы данного типа содержали гликозиды, выделенные как из одного, так и разных растений. Изучено взаимодействие эсцина ES (суммы тритерпеновых гликозидов из каштана конского обыкновенного Aesculus hippocastanum L. (Sapindaceae Juss.)) с L-лизином (Lys).
Впервые систематически исследованы особенности физико-химического взаимодействия между тритерпеновыми гликозидами и биологически активными веществами различной природы. Выявлены функциональные группы, участвующие в комплексообразовании. Установлено, что гликозиды в большинстве случаев образуют комплексы состава 1:1, имеющие константы устойчивости порядка 103–105. Комплексы гликозидов плюща с фармсубстанциями Str, DOX, Par и MeUra, а также с азотистыми основаниями Ade и Gua стабильнее подобных комплексов GC. Комплексы 1–Trp, 2–Trp и GC–Trp близки по устойчивости. Константы устойчивости комплексов гликозидов плюща и GC с Lev и BG имеют одинаковый порядок. Самые прочные комплексы дают фармаконы, имеющие пуриновое (Caf), пиразоло[4,3-d]пиримидиновое (SC) и антрациклиновое (DOX) кольцо. Комплексы фармацевтических субстанций с гликозидами плюща и солодки оказались более стабильными, чем их комплексы с CD. Метод масс-спектрометрии впервые применен для анализа молекулярных комплексов тритерпеновых гликозидов.
Показана его эффективность для установления состава и оценки стабильности комплексов гликозидов.
Разработан новый улучшенный способ получения тритерпеновых гликозидов из листьев различных видов плющей. Предложены новые неагрессивные селективные реагенты для определения и идентификации тритерпеновых гликозидов методом ТСХ. Разработана методика экспресс-анализа гликозидов в составе готовых лекарственных форм на основе листьев плюща обыкновенного.
Выявлены моллюскоцидная, ихтиотоксическая, нейротропная и аллелопатическая активности полученных комплексов и показано отсутствие у них гемолитического действия. Соотнесены результаты биоактивности со строением компонентов комплексов и взаимодействием между ними. Обнаружены цитопротекторные свойства у некоторых гликозидов плюща и солодки. Получены новые сведения, касающиеся комплексообразования ряда тритерпеновых гликозидов плюща и солодки с Chol клеточных мембран. Различными физико-химическими методами однозначно доказано межмолекулярное взаимодействие гликозидов с Chol, являющееся основой их биоактивности.
Теоретическая и практическая значимость работы. Установленный факт образования стабильных комплексов тритерпеновых гликозидов с рядом биологически активных веществ и наличия у них полезных биологических свойств позволяет рассматривать гликозиды в качестве перспективных молекулярных контейнеров в системах доставки фармацевтических субстанций и для создания на их основе новых лекарственных препаратов.
В связи с этим показано, что наличие собственной противоопухолевой активности у гликозида 1, выделенного из плюща, и доказанная его способность к комплексообразованию с противоопухолевым антибиотиком DOX создают основу для поиска новых средств для лечения рака. Комплексы гликозидов плюща с DOX стабильнее комплекса GC–DOX. Молекулярные комплексы гликозидов плюща с Caf и SC являются потенциальными нейротропными веществами. Полученные результаты по моллюскоцидной активности гликозидов и их комплексов могут быть использованы для профилактики и борьбы с шистосоматозом и другими паразитарными заболеваниями, переносчиками которых являются моллюски, а также для уничтожения моллюсков, повреждающих сельскохозяйственные посевы.
Материалы исследования аллелопатической активности ряда тритерпеновых гликозидов могут найти применение при оценке перспектив
совместного выращивания сапониноносов и других растений. Комплексы гликозидов друг с другом, а также с SC, P-CD и Phe можно рассматривать как перспективные стимуляторы роста и развития лекарственных растений. Предложен способ экспресс-оценки воздействия тритерпеновых гликозидов на организм человека, основанный на подсчете количества гранул гетерохроматина (HGQ) в клетках буккального эпителия.
Наличие общих закономерностей проявления разных видов биоактивности гликозидами, установленных в данной работе (принадлежность агликона к -амириновому ряду, наличие у него группы СООН при атоме С-17, степень полярности агликона и углеводной цепи у его атома С-3), позволяют прогнозировать биологическое действие гликозидов, выделенных и из других природных источников.
P-CD является перспективным стабилизатором GC в водных растворах, а также в составе его лекарственных препаратов.
Предложенный способ извлечения, разделения и очистки главных
тритерпеновых гликозидов из листьев плюща, обладающий повышенным
выходом, может быть использован для их коммерческого препаративного
получения. Показана возможность применения разработанных
идентифицирующих реагентов для ТСХ-анализа тритерпеновых гликозидов в составе готовых лекарственных форм и фитокомплексов на основе плюща (проспан, геделикс, гедерин, пектолван плющ, хедерикс+).
Результаты фармацевтического анализа гликозидного состава препаратов плюща внедрены в ООО «Витаукт-пром» (Республика Адыгея, Россия, 2016) и ООО «ДКП «Фармацевтическая фабрика» (Житомир, Украина, 2013), а результаты изучения взаимодействия ES с Lys - в фармацевтической корпорации «Артериум» (Киев, Украина, 2012). Результаты работы также внедрены в учебный процесс в Политехническом институте Севастопольского государственного университета (Севастополь, 2016) и Таврической академии Крымского федерального университета им. В.И. Вернадского (Симферополь, 2016).
Методология и методы исследования. Растительное сырье предварительно высушивали и затем измельчали. Из него экстрагировали малополярные вещества, а затем извлекали тритерпеновые гликозиды методом экстракции, которые разделяли и очищали от сопутствующих примесей колоночной хроматографией на силикагеле. Контроль за разделением веществ осуществляли восходящей ТСХ. Структуру выделенных гликозидов подтверждали кислотным и щелочным гидролизом и методами ИК-, масс-
(ионизация электрораспылением) и ЯМР-спектроскопии. Молекулярные комплексы препаративно получали жидкофазным способом. Для характеристики комплексов использовали методы ИК-, УФ-, масс- и ЯМР-спектроскопии. Состав комплексов установлен методом изомолярных серий и масс-спектрометрически. Расчет констант устойчивости выполнен на основе изомолярных кривых в спектрофотометрическом варианте. Тритерпеновые гликозиды из готовых лекарственных форм выделяли экстракцией и анализировали восходящей ТСХ.
Положения, выносимые на защиту:
1. Данные по выделению, очистке и подтверждению строения главных
тритерпеновых гликозидов различных видов плющей.
2. Результаты получения молекулярных комплексов тритерпеновых
гликозидов плюща и солодки и их исследования методами ИК-, УФ-, масс- и
ЯМР-спектроскопии. Особенности межмолекулярных взаимодействий в
комплексах и результаты определения их устойчивости.
3. Результаты исследования моллюскоцидной, ихтиотоксической,
нейротропной, противоопухолевой и аллелопатической активности
тритерпеновых гликозидов и молекулярных комплексов, а также их влияния на
состояние эритроцитов и агрегацию гетерохроматина.
-
Новые идентифицирующие реагенты для ТСХ-анализа тритерпеновых гликозидов.
-
Методика фармацевтического анализа тритерпеновых гликозидов в лекарственных препаратах на основе листьев плюща обыкновенного.
-
Перспективы практического применения тритерпеновых гликозидов и супрамолекулярных комплексов, полученных на их основе.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов определяется использованием современных физико-химических методов исследования, хорошо апробированных для анализа молекулярных комплексов веществ. Полученные данные подвергались статистической обработке и валидационной оценке.
Результаты диссертационной работы были представлены на II и III Международных конференциях «Лесные биологически активные ресурсы» (Хабаровск, Россия, 2004, 2007), IV, VII и VIII Всероссийских научных конференциях «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, Калининград, Россия, 2006, 2011, 2013), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных
соединений» (Алматы, Казахстан, 2007), V–XI Международных научно-технических конференциях «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики и химии» (Севастополь, Россия, 2009–2016), Международных конференциях «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, Узбекистан, 2009, 2010), VIII и IX Всероссийских конференциях «Химия и медицина» (Уфа, Россия, 2010, 2013), International conference «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine» (Saint-Petersburg, Russia, 2011), VIII–X Международных конференциях «Спектроскопия координационных соединений» (Туапсе, Россия, 2011–2013), IX International symposium on the chemistry of natural compounds (Urumqi, China, 2011), V Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, Россия, 2012), X International symposium on the chemistry of natural compounds (Tashkent–Bukhara, Uzbekistan, 2013), Междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической и биологической химии (Новый Свет, Россия, 2014), XXVI Международной Чугаевской конференции по координационной химии (Казань, Россия, 2014), International research and practice conference «Achievements and prospects for the development of phytochemistry» (Karaganda, Kazakhstan, 2015), VI Международной научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, Россия, 2016) и ряде других конференций.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенных исследований соответствуют пунктам 1, 6 и 7.
Личный вклад автора. Автором лично определено направление научных исследований, проведена постановка цели и задач исследования и найдены пути их решения, осуществлен выбор объекта и методов исследования, выполнен поиск и анализ литературных источников по теме работы. Основной объем экспериментальной работы, обработка и обобщение полученных результатов, а также полученные заключения и выводы выполнены соискателем лично. По теме работы 7 статей опубликовано без соавторов.
Исследование нейротропной активности комплексов проведено совместно с к.б.н. Колотиловой О.И. (Таврическая академия Крымского федерального
университета им. В.И. Вернадского). Влияние гликозидов на агрегацию хроматина изучено совместно с д.б.н. Шкорбатовым Ю.Г. (НИИ биологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина). Изучение моллюскоцидной и гемолитической активности некоторых веществ проведено совместно с д.х.н. Гришковцом В.И. (Таврическая академия Крымского федерального университета им. В.И. Вернадского) и к.х.н. Довгим И.И. (Морской гидрофизический институт РАН). Противоопухолевая активность гликозидов изучена к.б.н. Артамоновой А.Б. (Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины). Масс-спектры получены д.х.н. Борисенко Н.И. (НИИ физической и органической химии Южного федерального университета), ЯМР-спектры сняты д.х.н. Шашковым А.С. (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН); к.физ.-мат.н. Бучельниковым А.С. и к.х.н. Папоновым Б.В. (Белгородский государственный национальный исследовательский университет). В получении некоторых комплексов принимали участие д.х.н. Гришковец В.И., к.х.н. Корж Е.Н. (Севастопольский государственный университет) и руководимые соискателем аспирантка Рубинсон (Вожжова) М.А. и магистранты.
Автор выражает глубокую благодарность и признательность своим коллегам, которые принимали участие в проведении экспериментальных исследований и в обсуждении их результатов.
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 5 главах в международных коллективных монографиях и 62 статьях в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК для размещения материалов диссертаций и приравненных к ним (п. 10 Постановления Правительства РФ № 723 от 30.07.2014 г.). По теме работы опубликовано более 100 тезисов докладов на конференциях и симпозиумах.
Связь работы с научными программами и планами. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (проект 14-43-01031 р_юг_а; 2014 г.) и Фонда социально-экономического развития Севастополя (2010, 2011 гг.).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 351 странице машинописного текста, содержит 56 таблиц, 91 рисунок и состоит из введения, 6 глав, заключения, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 535 источников.