Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние и перспективы фармакогностических исследований растений рода Euphrasia 23
1.1. Ботаническое описание, систематическое положение и распространение 23
1.2. Биологические особенности и явление сезонного полиморфизма 36
1.3. Химический состав 38
1.4. Биологическая активность и перспективы использования в медицине
1.4.1. Фармакологические исследования и данные о применении в научной и народной медицине 45
1.4.2. Обоснование перспективности изучения растений рода Euphrasia для использования в фармации 47
Выводы по главе 1 55
Экспериментальная часть 57
Глава 2. Объекты и методы исследования 57
2.1. Объекты исследования 57
2.2. Методы морфолого-анатомических исследований 61
2.3. Методы химических исследований 63
2.3.1. Исследование продуктов первичного метаболизма и
пигментов
2.3.1.1. Методы исследования углеводов 63
2.3.1.2. Методы исследования аминокислот 64
2.3.1.З. Методы исследования липофильных веществ 67
2.3.1.4. Методы исследования пигментов 68
2.3.2. Исследование продуктов вторичного метаболизма 71
2.3.2.1. Методы качественного анализа 71
2.3.2.2. Методы количественного анализа 74
2.3.2.3. Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ 77
2.3.3. Исследование макро- и микроэлементного состава 78
2.4. Общие методики стандартизации сырья 78
2.4.1. Методы отбора проб для анализа 78
2.4.2. Определение числовых показателей качества сырья 78
2.4.3. Определение микробиологической чистоты сырья 79
2.4.4. Определение содержания радионуклидов 79
2.4.5. Определение сроков хранения сырья 79
2.4.6. Статистическая обработка данных 79
2.5. Методы фармакологических исследований 79
2.5.1 Изучение антикоагулянтной активности 80
2.5.4. Изучение антимикробной активности 80
2.5.5. Определение антирадикальной активности 81
2.5.6. Изучение острой токсичности 82
2.5.7. Статистическая обработка результатов фармакологического эксперимента 82
2.6. Маршруты экспедиций и методы ресурсоведческого исследования 82
ГЛАВА 3. Морфолого-анатомическое исследование долговегетирующих видов рода Euphrasia 83
3.1. Исследование морфологического строения 84
3.1.1. Сравнительно-таксономический анализ
макродиагностических признаков 91
3.1.2. Установление отличительных признаков морфологического строения возможной примеси ЛРС 96
3.2. Исследование анатомического строения 98
3.2.1. Сравнительно-таксономический анализ микродиагностических признаков 127
3.2.2. Установление отличительных признаков анатомического строения возможной примеси ЛРС 130
3.3. Проявляение анатомо-диагностических признаков измельченного лекарственного растительного сырья 135
Выводы по главе 3 144
ГЛАВА 4. Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья, характеризующегося полиморфизмом на примере рода euphrasia 145
4.1. Химический состав продуктов первичного метаболизма, пигментов и элементный состава 145
4.1.1. Исследование углеводного состава 145
4.1.1.1. Качественный состав свободных и связанных углеводов 145
4.1.1.2. Выделение углеводных фракций из травы Е. brevipila 148
4.1.1.3. Химический состав углеводных фракций
4.1.1.3.1. Исследование мономерного состава методом хроматографии на бумаге 151
4.1.1.3.2. Исследование мономерного состава методом газожидкостной хроматографии 152
4.1.1.4. Разработка методики количественного определения суммы углеводов в траве Е. brevipila 155
4.1.1.4.1. Разработка методики количественного определения низкомолекулярных Сахаров и полисахаридов, а так же их суммы из одной навески 157
Исследование количественного содержания углеводов 164
Исследование аминокислотного состава J69
1. Определение аминокислот методом жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе 170
2. Изучение качественного состава методом TCX 172
3. Изучение количественного содержания свободных аминокислот по органам растений рода Euphrasia 174
Исследование липофильных веществ 177
1. Содержание жирного масла и состав жирных кислот масла семян 177
2. Содержание липофильных веществ в траве растений рода Euphrasia 180
Исследование пигментного состава 183
1. Выделение и идентификация основных фотосинтезирующих пигментов 184
2. Изучение качественного состава пигментов 187
3. Исследование количественного содержания пигментов
3.1. Сравнительный анализ содержания хлорофиллов и феофетинов 192
3.2. Количественное содержание каротиноидов 196
4. Роль фотосинтетических пигментов в жизнедеятельности гемипаразитических видов рода Euphrasia 197
Исследование макро- и микроэлементного состава 200
1. Элементный состав долговегетирующих видов рода Euphrasia 201
Химический состав продуктов вторичного метаболизм 205
Качественный анализ на содержание основных групп биологически активных веществ 205
Исследование фенольных соединений 207
4.2.2.1. Определение компонентного состава фенольных соединений методом ВЭЖХ 207
4.2.3. Исследование иридоидных соединений 210
4.2.4. Определение таксономической значимости продуктов вторичного метаболизма
4.2.4.1. Межвидовая изменчивость комплекса фенольных соединений в пределах рода 214
4.2.4.2. Межвидовая изменчивость иридоидного комплекса в пределах рода 222
4.2.4.3. Особенности внутривидовой изменчивости биохимических признаков под влиянием эколого-географических факторов 227
4.2.5. Таксономический анализ количественного содержания основных групп биологически активных веществ 236
4.2.5.1. Разработка методики количественного определения суммарного содержания гидроксикоричных кислот 236
4.2.5.2. Сравнительный анализ количественного содержания БАВ в траве и органах рода Euphrasia 240
4.2.5.3. Влияние географического фактора на накопления БАВ 244
Выводы по главе 4 249
ГЛАВА 5. Разработка технологии, стандартизация и фармакологические свойства фитосубстанций на основе растений рода euphrasia 252
5.1. Разработка технологии и стандартизация фитосубстанций 253
5.1.1. Оптимальные условия получения настойки и её стандартизация 253
5.1.1.1. Выбор концентрации экстрагента и измельченности сырья 253
5.1.1.2. Выбор метода экстрагирования 254
5.1.2. Стандартизация настойки 255
5.1.2.1. Методы испытания на подлинность 255
5.1.2.2. Определение сухого остатка, плотности и тяжелых металлов 263
5.1.2.3. Количественное определение 264
5.1.2. Разработка состава и технологии косметического
средства 265
5.1.2.1. Выбор оптимальных условий извлечения гидрофильного комплекса БАВ 265
5.1.2.2. Выбор структурообразующего компонента 267
5.1.2.3. Выбор оптимальных условий извлечения липофильного комплекса БАВ 268
5.1.2.4. Влияние концентрации витаминов в составе эмульсионной композиции на выход БАВ 268
5.2. Исследование фармакологических свойств и острой токсичности фитосубстанций 271
5.2.1. Изучение антикоагулянтной активности 271
5.2.4. Изучение антирадикальной активности 276
5.2.5. Изучение антимикробной активности 279
5.2.7. Изучение острой токсичности 282
Выводы по главе 5 283
ГЛАВА 6. Стандартизация сырья полиморфных видов лекарственных растений 284
6.1. Определение товароведческих показателей 285
6.1.1. Показатели доброкачественности производящих растений ЛРС цельного и резанного 285
6.1.2. Показатели доброкачественности модельных образцов ЛРС характеризующегося полиморфизмом на примере растений рода Euphrasia 288
6.1.3. Показатели доброкачественности природных образцов
ЛРС, содержащего смесь различных видов рода
Euphrasia 304
Выводы по главе 307
ГЛАВА 7. Проблемы и пути решения обеспеченности сырьевой базы рода euphrasia на территории пермского края 308
7.1. Распространение, экспедиционное обследование и запасы сырья в пермском крае 308
7.2. Экспериментальная интродукция и её влияние на изменчивость биохимических призанаков 316
7.2.1. Изменчивость биохимических параметров в условиях интродукции 317
Выводы по главе 7 322
Общие выводы 323
Список сокращений 328
Список литературы
- Фармакологические исследования и данные о применении в научной и народной медицине
- Методы исследования липофильных веществ
- Установление отличительных признаков морфологического строения возможной примеси ЛРС
- Определение аминокислот методом жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе
Фармакологические исследования и данные о применении в научной и народной медицине
Очанки относятся к экологической группе терофитов, мезофитов (по К. Раункиеру) и полупаразитных монокарпиков (по И. Г. Серебрякову) [271, Raunkiaer, С, 1937]. Являясь полупаразитными видами, очанки имеют зеленые листья и способны к самостоятельному фотосинтезу. На корневой системе имеются корневые присоски - гаустории, с помощью которых растения получают дополнительные питательные вещества от других растений сообщества.
Гаустории - образование, которое состоит из одной одноядерной или многоядерной клетки, сильно разрастающейся, проникающей своими ветвями вглубь соседних тканей и выполняющей питательную функцию. В настоящее время известно шесть типов гаусториев, отличающихся по своему происхождению и внешнему виду. Для представителей семейства Scrophulariaceae характерны так называемые эндоспермальные гаустории. Как и гаустории любого другого типа, они способствуют увеличению интенсивности обмена веществ во время роста и развития зародыша, облегчая приток к нему питательных веществ из тканей материнского растения [181].
Гаустории очанки развиваются после того, как боковые корни достигли длины 12-24 мм, и только в том случае, если последние соприкасаются с корнями других подходящих растений, что чаще всего и происходит, так как боковые корни паразита многочисленны и отходят от главного корня по всем направлениям, и неизбежно должны задеть корни других растений. Присоски, образующиеся на корнях очанки, очень мелкие, в виде округлых узелков, которые только прилегают к корню хозяина, не обхватывая его [107, 232].
Одной из важнейших цитологических характеристик видов являются хромосомные числа, которые с успехом могут быть использованы при решении многих вопросов систематики, филогении, генетики и практических задач селекции. Хромосомные числа установлены для 31 вида рода Euphrasia. При этом обнаружен вид Е. officinalis с внутривидовой полиплоидией и вид Е. brevipila с несколькими разными числами. Семь видов рода Euphrasia имеют диплоидный набор хромосом, а у 22 видов обнаружен тетраплоидный набор [24, 254,336].
Вопрос о характерном для видов рода Euphrasia явлении «сезонного полиморфизма» и существовании двух рас, раннецветущей весенней и позднецветущей осенней, долгое время оставался спорным в научных кругах. R. Wettstein выделял весенние расы, успевающие закончить свой жизненный цикл на лугах до покоса, и осенние расы, достигающие полного развития после покоса, объясняя причину этого явления хозяйственной деятельностью человека, а именно регулярным скашиванием травы на лугах, что послужило причиной микроэволюционных изменений и появлением рас, отличающихся жизненным циклом [Wettstein R., 1894; Wettstein R., 1896]. При этом, весенние расы характеризуются раздвинутыми нижними узлами и удлиненными междоузлиями, малым числом междоузлий, простыми и мало ветвистыми стеблями, сравнительно тупыми зубцами стеблевых и прицветных листьев. Они рано закладывают первые цветки, обычно на 2-4-ом узле, считая снизу. Осенние, наоборот, имеют сближенные нижние узлы, что приводит к образованию как бы розетки нижних листьев, укороченные междоузлия (большое их число), ветвистые стебли, более острые зубцы листьев, первые цветки развивают обычно на 6-12-ом узле.
Однако ряд исследователей являлись противниками заключений Р. Веттштейна о роли человека в возникновении «сезонного полиморфизма». Е. Jorgensen [306], Н. Pugsley [320, 321], СВ. Юзепчук [247], считали, что на архитектонику видов оказывают влияние естественные условия произрастания, так как большое количество видов очанок не обнаруживают признаков расчленения на сезонные расы в зависимости от деятельности человека [332]. Венгерский ботаник Шу пришел к выводу, что полиморфизм видов рода Euphrasia обусловлен в основном эколого-географическими факторами, среди которых особенно важное значение имеют длина вегетационного периода и местные условия развития растений [53, 247].
На современном этапе развития теоретических представлений о виде и сегодняшнем состоянии изученности группы, Г.Л. Гусаровой (2000) обоснована необходимость сохранения концепции монотипического вида в роде Euphrasia. Виды рода Очанка представляют собой географо-морфологические расы. Предложено не распространять термины «ранне- и позднецветущие виды» на географический и поясной викариат [79]. В зависимости от сезонного викариата, виды очанок могут быть разграничены на «долго»- и «коротко»- вегетирующие. Их отличительным признаком является число вегетативных узлов. Установлено, что с этим признаком коррелируют такие морфологические характеристики, как количество боковых побегов, число прицветных листьев, их остистость, обуславливающие характерный габитус долго- и коротковегетирующих растений [74, 75, 76, 78, 329].
Из одиннадцати видов, представленных во флоре Пермского края, четыре вида (Е. onegensis, Е. hirtella, Е. vernalis, Е. wettsteinii) относятся к коротковегетирующим (раноцветущим) и семь (Е. officinalis, Е. tatarica, Е. stricta, Е. х reuteri, Е. х murbeckii, Е. brevipila, Е. parviflora) - к долговегетирующим (позднецветущим) (рис. 2, табл. 2). Долговегетирующие виды характеризуются длинным периодом вегетации и значительным накоплением фитомассы и являются перспективными для фармакологического изучения. Большинство из них по встречаемости относятся к «часто» или «нередко» встречающимся видам [97, 162]. В то время как раноцветущие представители очанок флоры Пермского края имеют короткий период вегетации и относятся к «редко» или «изредка» встречающимся.
Большинство исследований химического состава растений рода Очанка были выполнены в 70 - 80-е годы прошлого века. Поэтому при составлении обзора мы придерживались систематической характеристики рода предложенной Юзепчуком СВ. [247]. Сведения о биологически активных веществах Е. rostkoviana Наупе. и Е. officinalis L., а также Е. pectinata Tenore и Е. tatarica Fisch. ex Spreng в некоторых источниках дублированы и имеют не однозначное толкование, в части видовой принадлежности. В связи с этим приведены обобщенные сведения, указанные соответственно для Е. rostkoviana и Е. pectinata.
Наиболее подробно изучен химический состав у ряда видов рода Euphrasia L.: Е. rostkoviana, Е. brevipila Burnat et Gremli, E. parviflora Schag., E. montana Jord., E. pectinata, E. condensata Jord., E. stricta D. Wolff, ex J.F.Lehm., E. salisburgensis Funk, E. maximowiszii Wettst., E. x reuteri Wettst.
Преобладающими группами БАВ являются фенольные соединения (флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты) и иридоидные гликозиды (табл. 3). В минорных количествах содержатся липофильные вещества, высшие жирные кислоты, стерины, каротиноиды, стероидные сапонины.
Из перечисленных классов природных веществ наиболее полно изучен флавоноидный состав. Большинство флавоноидных соединений, выделенных из растений рода Очанка, относятся к производным флавона и лишь небольшое количество к производным флавонола. Кроме того, в растениях рода Очанка обнаружены монометоксилированные флавоноиды (хризеориол, диосметин), которые широко распространены в семействе норичниковые [27]. Органические кислоты представлены в основном коричной кислотой и её производными. Их количественное содержание довольно значительно, например у Е. rostkoviana превышает 0,6% [291].
Методы исследования липофильных веществ
Приготовление раствора РСО глутаминовой кислоты: Около 0,05 г (точная навеска) глутаминовой кислоты (ФС 42-0229-07) помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяют в 50 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают (раствор В).
Приготовление фосфатного буферного раствора с рН 6,4 согласно ОФС 42-0072-07 «Буферные растворы».
Определение аминокислот с использованием аминокислотного анализатор марки ААА-339 (Чехия), проводили согласно ГОСТ 13496.21-87.
Образец травы очанки (Юг - точная навеска) исчерпывающе экстрагировали горячей водой, извлечение фильтровали, сгущали в вакууме до сухого остатка. Пробы сухого остатка по 10 мг растворяли в 1,2 мл цитратно-натриевого буфера и использовали для анализа свободных аминокислот. Пробы сухого остатка по 30 мг помещали в ампулу, растворяли в 5 мл 6н хлористоводородной кислоты, запаивали ампулу и выдерживали в сушильном шкафу при 100 - 105 С в течение суток. Гидролизаты отфильтровывали, осадки промывали горячей водой очищенной до нейтральной реакции. Фильтраты упаривали на водяной бане до густой консистенции, растворяли в 20 мл воды очищенной и вновь упаривали до исчезновения паров хлористоводородной кислоты. После окончания упаривания остаток заливали 10 мл цитратно-натриевого буфера и использовали для анализа связанных аминокислот.
Количественное содержание аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе AAA -399 (ЧССР), в стандартных условиях, используемых обычно для разделения белковых гидрализатов. В качестве внутреннего стабилизатора использовали смесь, состоящую из 12 аминокислот.
По 50 мкл исследуемых образцов вводили в колонку анализатора. Колориметрическое измерение окрашенных комплексов, образующихся в результате реакции с нингидрином, проводили при длине волны 570 нм. Для количественной оценки определяли автоматически площади пиков удерживания идентифицированных аминокислот. Количество каждой идентифицированной кислоты определяли в наномолях и нанограммах в аликвоте.
Анализ липофильных веществ семи видов рода Euphrasia проводили на газовом хроматографе Hewlett - Packard 5890/П (США) с квадрупольным масс-спектрометром (MS) (HP MSD 5971).
Приготовление извлечения: 1,0 г измельченного сырья заливали гексаном в соотношении 1:10 и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 60 минут. Извлечение охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили объем раствора до метки гексаном и перемешивали. Гексановый раствор подвергали хроматографированию.
Условия хроматографического разделения: колонка кварцевая НР-5 (5% фенильных групп) длинной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм, газ-носитель гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Температура испарителя 250 С, источника ионов 170, интерфейса между ГХ и MS детектора 280С. Скорость сканирования 1,2 скан/с для области 45 - 450 а.е.м. Проба 1 мкл.
Компоненты липофильного извлечения идентифицировали путем сравнения времени удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными библиотеки Wiley275 и NIST98. Содержание индивидуальных веществ вычисляли по площади пиков, без использования градуировочных коэффициентов с программированным автоматическим интегрированием. Учитывали компоненты с концентрацией выше 0,005% и вероятностью совпадения масс-спектров более 80%. Повторность проведенных определений - трехкратная.
Жирнокислотный состав исследовали у семян растений рода Euphrasia. Для анализа использовали семена, имеющие одинаковую окраску, без видимых нарушений и находившиеся в условиях сухого хранения при комнатной температуре. Семена (1 г) высушивали до постоянной массы при температуре 100-105иС, растирали в ступке до порошкообразного состояния и помещали в патроны из фильтровальной бумаги. Жирное масло экстрагировали из семян в аппарате Соксклета гексаном в течение 48 часов. Растворитель отгоняли в вакууме при температуре 45 - 50 С, а остаток выдерживали в вакуум-сушильном шкафу при 30 С в течение 30 мин. Масла подвергали горячему метанолизу метилатом натрия в среде абсолютного метанола [5].
Метиловые эфиры жирных кислот анализировали на газовом хроматографе (ГХ) Hewlett - Packard 5890/П (США) с квадрупольным масс-спектрометром (MS) (HP MSD 5971) с ионизацией электронным ударом (70 эВ). Использовали кварцевую колонку НР-5 (5% фенильных групп) длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм, газ носитель гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Температура испарителя 250 С, источника ионов 170, интерфейса между ГХ и MS детектора 280 С. Температуру колонки программировали в следующем режиме: 2 мин при 100 С, 10 С/мин до 200 С, 2 мин при 200 С, 20 С/мин до 300 С, 2 мин при 300 С. В инжектор вводили 1 мкл раствора, скорость сканирования 1.2 скан/с для области 45 - 450 а.е.м.
Жирные кислоты идентифицировали путем сравнения времени удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными для их метиловых эфиров из базы данных Wiley 275 (275 тыс. масс-спектров) [316, Silverstein R.M., 1967]. Использовали эталонные образцы пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой кислот. Содержание индивидуальных кислот вычисляли по площади пиков, без использования градуировочных коэффициентов с программированным автоматическим интегрированием. Для идентификации и количественного определения олеиновой и линолевой кислот использовали селективное ионное детектирование [105], условия которого изложены в работе [178]. Повторность проведенных определений - трехкратная.
Приготовление извлечения: 0,2 г измельченного сырья растирали в ступке с ацетоном в присутствии стеклянного песка и кальция карбоната до обесцвечивания сырья. Полученное извлечение фильтровали и упаривали на ротационном испарителе под вакуумом при температуре 35 С досуха, остаток растворяли в 5 мл ацетона.
Извлечение наносили на хроматограмму в количестве 6 мкл. Нанесенный на пластинку раствор подсушивали в токе теплого воздуха, избегая света.
Детектирование пигментов осуществляли путем обработки хроматограмм 10% спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты с последующим нагреванием при 100С в течение 2 минут. Пятна веществ приобретали синюю окраску.
В качестве стандартных образцов использовали 0,01% растворы /?-каротина и хлорофилла а в ацетоне. Стандартные образцы - производства фирмы «Sigma», США.
Выделение пигментов проводили методом препаративной бумажной хроматографии, основанным на экстракции суммы пигментов ацетоном с последующим хроматографическим разделением [64, 312].
Ход анализа. Навеску сырья 5,0 г измельчали ножом из нержавеющей стали, помещали в ступку и растирали с небольшими порциями экстрагента до полного обесцвечивания сырья. Для нейтрализации органических кислот добавляли немного гидрокарбоната натрия, так как пигменты не устойчивы в кислой среде.
Разделение проводили на хроматографической бумаге марки FN-1 («Filtrak», Германия) размером 25 х 15 см без доступа света. Ацетоновое извлечение наносили на стартовую линию в количестве 3 мл. Далее хроматограмму помещали в систему с петролейным эфиром, в камеру, защищенную светонепроницаемым материалом. После прохождения растворителем расстояния 20 - 23 см, хроматограмму вынимали и высушивали, до удаления растворителя. Зону, окрашенную в желтый цвет, вырезали и элюировали ацетоном до полного обесцвечивания и рехроматографировали.
После отделения полоски с каротином от исходной хроматограммы, оставшуюся часть хроматограммы помещали нижним концом в смесь бензол - петролейный эфир (3:1). После разделения и удаления растворителя с хроматограммы зоны темно-зеленого и светло-зеленого цвета вырезали и элюировали ацетоном до обесцвечивания и рехроматографировали.
Установление отличительных признаков морфологического строения возможной примеси ЛРС
Лист имеет дорсовентральное строение (рис. 12 А, 13 А), толщина губчатого мезофилла составляет 43%, а столбчатого 33% к толщине листовой пластинки. Клетки нижней эпидермы более извилистые и по размерам больше, чем нижней (рис. 12 В, Г, 13 Б). Размеры устьиц верхней и нижней эпидермы отличаются незначительно.
На листовой пластинке расположены многочисленные трихомы двух типов: железистые (головчатые) и кроющие (простые) (рис. 13 В, 14).
Железистые волоски, высотой более 0,2 мм, состоят из трех и более клеток ножки и одноклеточной головки, встречаются по всей поверхности листовой пластинки и по жилкам; железистые волоски, состоящие из короткойодноклеточной ножки и двухклеточной головки, располагаются преимущественно с верхней стороны листа по жилкам, и по всей поверхности листовой пластинки; простые одно-, двух- и трехклеточные волоски встречаются по всей поверхности пластинки и преобладают при основании листа; простые сильно изогнутые одноклеточные волоски -«шипики», располагаются преимущественно по краю листовой пластинки
Анатомическое строение листа Е. officinalis: А - главная жилка (хЮО); Б - поперечный срез листовой пластинки ( 100); В -эпидерма верхней стороны ( 400); Г - эпидерма нижней стороны листа (х400): 1 - верхняя эпидерма; 2 - нижняя эпидерма; 3 -столбчатая паренхима; 4 - губчатая паренхима; 5 - закрытый коллатеральный пучок; 6 - устьица.
Трихомы листа Е. officinalis: А - фрагмент основания листовой пластинки (хЮО); Б - зубец листовой пластинки (хЮО); В -фрагмент верхней стороны листа (хЮО); Г - фрагмент жилки верхней стороны листа (хЮОО): 1 - железистые волоски с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой, 0,2 мм; 2 -простой двухклеточный волосок; 3 - простые одноклеточные сильноизогнутые волоски; 4 - железистые волоски с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой. Euphrasia tatarica - очанка татарская
Стебель в сечении округло четырехгранный, беспучкового строения (рис. 15 А). Покровная ткань эпидерма, толщина которой составляет 2,0% к радиусу стебля. Первичная кора состоит из 3 - 5 рядов клеток и составляет 11,3% к длине радиуса. Толщина слоя - флоэма, перицикл и камбий составляет 45,8 мкм или 4,9%, а слоя ксилемы 327 мкм или 35,1%, к длине радиуса стебля. Древесина насчитывает 18-30 рядов клеток. Средний диаметр сосудов 20,4 мкм. Сердцевина составляет 45,7% от длины радиуса стебля. Стебель покрыт многочисленными простыми плотно прижатыми по трихомами. Чаще всего, волоски слегка изогнутые одно-, двух-, или трехклеточные, тонкостенные, с гладкой или бородавчатой кутикулой.
Главный и боковые корни округлые в сечении и имеют вторичное строение (рис. 30 Б, 31 Б). Толщина перидермы составляет 60,4 мкм или 9,8%, флоэмы 26,2 мкм или 4,3%, слой клеток древесины 539,2 мкм или 87,8% к радиусу корня. В центре органа расположена первичная ксилема диархного типа, представленная несколькими сосудами [44].
Рис. 15 30. Анатомическое строение осевых органов Е. tatarica: А-поперечный срез стебля (хЮО); Б - поперечный срез корня (хЮО): 1 - эпидерма стебля; 2 - первичная кора; 3 - экзодерма; 4 -перицикл; 5 - флоэма, камбий; 6 - ксилема; 7 - пробка; 8 -феллодерма; 9 - вторичная ксилема.
Лист на поперечном срезе имеет дорсовентральное строение (рис. 16 А, 17 А). Толщина листовой пластинки 247 мкм. Столбчатая ткань располагается в 2 - 3 ряда, а губчатая в 3 - 5 рядов, и составляет 38,9% и 46,2%, соответственно к толщине листовой пластинке. Длина, ширина и извилистость клеток нижней эпидермы больше, чем верхней. Размеры устьиц с обеих сторон листа отличаются незначительно, их количество больше на нижней эпидерме (рис. 16 Б, В).
Листья опушены с обеих сторон. По краю, жилкам и зубцам встречаются многочисленные простые одноклеточные волоски, иногда они изогнуты (рис. 16 Г, Д, 17 В). Железистые волоски, состоящие из короткой одноклеточной ножки и двухклеточной головки, располагаются преимущественно с верхней стороны листа по жилкам и по всей поверхности листовой пластинки (рис. 16 Е).
Анатомическое строение листа Е. tatarica: А - поперечный срез листовой пластинки (хЮО); Б - эпидерма верхней стороны листа (хЮО); В - эпидерма нижней стороны листа ( 400); Г - фрагмент края листовой пластинки (х400); Д - фрагмент края листовой пластинки (хЮО); Е - фрагмент верхней стороны листа (хЮОО): 1 -верхняя эпидерма; 2 - нижняя эпидерма; 3 - столбчатая паренхима; 4 - губчатая паренхима; 5 - простые одноклеточные волоски; 6 -устьица; 7 - железистый волосок с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой.
Стебель в сечении округлый (рис. 18 А). Эпидерма тонкостенная, составляет 19,6 мкм или 2,8% к радиусу. Первичная кора состоит из 3 - 5 рядов клеток и составляет 11,2% к радиусу стебля. Флоэма и ксилема располагаются кольцом по окружности и составляют 5,8% и 35,7% к длине радиуса стебля соответственно. Ксилема состоит из 13 - 27 рядов клеток. Средний диаметр сосудов 15,7 мкм. Сердцевина составляет 45,5% от длины радиуса стебля, в центральной зоне стебля образуется полость (рис. 18 А, Б).
Главный и боковые корни имеют вторичное строение (рис. 18 В). Толщина перидермы составляет 87,2 мкм или 12.8%, флоэмы 35,6 мкм или 5,2%, слой клеток древесины 582,4 мкм или 85,7% к радиусу корня. В центре органа расположена плохо различимая первичная ксилема, представленная несколькими сосудами (рис. 18 Г).
Определение аминокислот методом жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе
При исследовании растений рода Euphrasia, характеризующихся гемипаразитизмом, большое значение имеет изучение пластичности фотосинтетического аппарата. Известно, что процесс обновления хлорофиллов и каротиноидов обусловлен как наследственными, генетическими факторами, так и изменяющимися внешним условиям [137]. О степени сформированности фотосинтетического аппарата и его адаптационной способности судят по следующим показателям: отношение хлорофилла а к хлорофиллу Ь (С а/С Ъ) и отношение суммы хлорофиллов к каротиноидам (С а+Ь/Саг).
Отношению С а/С b связано с активностью «главного» хлорофилла а, чем оно больше, тем интенсивнее фотосинтез. В норме для высших растений этот показатель должен соответствовать от 2,2 до 3,0 и может изменяться под влиянием светового режима. Отношение суммы хлорофиллов к каротиноидам (С а+Ь/Саг) играет не менее важную роль при характеристике работы фотосинтетического аппарата. Это отношение в норме стабильно и очень чутко реагирует на изменения различных факторов среды, для высших растений составляет от 3 до 8 [136, 311, 312].
Полученные результаты свидетельствуют о том, что показатели отношения основных фотосинтезирующих пигментов в растениях рода Euphrasia, характеризующихся полупаразитическим способом существования, не зависят от их систематического положения и совпадают с порядком их накопления и распределения у высших растений с автотрофным типом питания (табл. 37). Установлена зависимость между анализируемыми показателями отношений, так например для травы Е. parviflora найдено максимальное значение показателя С а/С b и минимальное С а+Ь/Саг, тогда как для травы Е. х reuteri обнаружено минимальное значение С а/С b и максимальное С а+Ь/Саг. Соотношение С а/С b для исследованных видов колеблется от 2,0 до 2,9 и в среднем составляет 2,5; отношение С а+Ь/Саг варьирует от 5,2 до 7,0, в среднем равно 6,2. Таким образом, фотосинтетический аппарат полупаразитических видов рода Euphrasia является сформированным и прошел успешную адаптацию к природным условиям.
Из литературы известно, что скорость обновления хлорофилла а примерно в три раза выше, чем хлорофилла b [137]. Анализируя показатели отношений у Е. brevipila по органам растения, установлено, что количество хлорофилла а в листьях в 2,5 раза больше чем хлорофилла Ъ и совпадает с характером их накопления в траве Е. brevipila. В остальных органах соотношение С а/С b варьирует от 1,4 до 2,2.
Соотношение суммы хлорофиллов к каротиноидам (С а+Ь/Саг) в надземных органах варьирует от 5,9 до 7,3 и так же совпадает с характером их накопления в траве. Минимальное отношение показателей С а/С b и С а+Ь/Саг установлено в корнях Е. brevipila и свидетельствует об отсутствии их светособирающей функции. Возрастание относительного содержания каротиноидов в ряду листья цветки плоды стебли отражает устойчивость желтых пигментов к повреждающим условиям среды и их защитную функцию [183].
Лекарственные растения и препараты растительного происхождения являются ценным источником микроэлементов [92]. В последнее время появилось много работ, посвященных изучению элементного состава растений [23, 79, 90, 91, 123, 164, 258, 266].
Микроэлементы, являясь составной частью лекарственных растений, играют значительную роль в процессе вегетационного периода, положительно влияют на накопление веществ первичного и вторичного обмена, способствуя тем самым повышению их терапевтического действия [160]. В фармакологическом эффекте растительных средств большая роль отводится макро- и микроэлементам, так как в растениях они находятся в оптимальных для организма соединениях и лучше усваиваются [141].
Одним из показателей, характеризующих общий уровень минеральных элементов в растениях, является их зольность. Нами проанализировано содержание золы в пяти видах рода Euphrasia, а так же по органам Е. brevipila. Результаты представлены в таблице 38.
Содержание золы у исследованных видов варьирует от 6,13 до 11,54%, среднее значение у исследованных видов составляет 8,79%. Повышенное содержание минеральных веществ отмечается в органах осуществляющих активную фотосинтетическую деятельность (листья), а также принимающих участие в процессах размножения (цветки, плоды, семена). В корнях, несмотря на, плотный контакт с минеральными веществами почвы, содержится наименьшее количество зольных элементов.