Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние исследований представителей семейства ивовых (salicaceae) (обзор литературы) 20
1.1. Общая характеристика представителей семейства ивовых (Salicaceae L.) 20
1.1.1. Разнообразие, распространение и сырьевая база растений семейства Salicaceae L 20
1.1.2. Народно-хозяйственное значение представителей семейства Salicaceae L 26
1.1.2.1. Народно-хозяйственное значение видов рода Populus L.. 26
1 Л.2.2. Народно-хозяйственное значение видов ро&г Salix L 29
1.2. Ботаиико-фармакогностическая характеристика видов рода Ива (Salix L.) 31
1.2.1. Характеристика отдельных видов рода Ива 32
1.2.1.1. Ива остролистная (Salix acntifolia Willd.) 32
1.2.1.2. Ива прутовидная (Salix viminalis L.) 33
1.3. Ботанико-фармакогностическая характеристика видов рода Тополь (Populus L.) 34
1.3.1. Характеристика отдельных видов рода Тополь 38
1.3.1.1. Тополь чёрный (Populus nigra L.) 38
1.3.1.2. Тополь канадский (P. deltoides Marsh.) 40
1.3.1.3. Тополь лавролистный (P. laurifolia Ledeb.) 40
1.3.1.4. Тополь душистый (Populus suaveolens Fisch.) 43
1.3.1.5. Тополь бальзамический (Л balsamiferaL.) 43
1.4. Химический состав и фармакологические свойства растений рода Salix L 44
1А1. Химический состав растений рода Salix L 44
1.4.2. Фармакологические свойства растений рола. Salix L 49
1.5. Химический состав и фармакологические свойства растений рода Populus L 51
1.5.1. Химический состав растений рода Populus L 51
1.5.2. Фармакологические свойства растений рода Populus L 59
1.6. Растения рода Populus L. uSalixh, как источник прополиса 64
1.6.1. Химический состав прополиса 65
1.7. Проблемы стандартизации сырья и препаратов представителей семейства Salicaceae 68
Выводы к главе 72
Экспериментальная часть и обсуждение результатов
ГЛАВА 2. Характеристика объектов и методов исследования 74
2.1. Объекты исследования 74
2.2. Методы исследования 77
2.2.1. Методы экстракции 77
2.2.2. Метод хроматографии 79
2.2.2.1. Метод тонкослойной хроматографии 79
2.2.2.2. Метод колоночной хроматографии 81
2.2.2.3. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии 83
2.2.3. Метод спектрометрии в ультрафиолетовой и видимой области спектра 86
2.2.4. Метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса 89
2.2.5. Методы анализа лекарственного растительного сырья 89
2.2.5.1. Метод определения анатомо-морфологических признаков 90
ГЛАВА 3. Морфологическое и микроскопическое исследование некоторых представителей семейства ивовые (saucaceae) 92
3.1. Сравнительное морфологическое исследование коры ивы прутовидной и ивы остролистной 93
3.1.1. Морфологическое исследование и внешние признаки цельного и измельчённого сырья коры ивы прутовидной 93
3.1.2. Морфологическое исследование и внешние признаки цельного и измельчённого сырья коры ивы остролистной 94
3.2. Сравнительное микроскопическое исследование коры ивы прутовидной и ивы остролистной 95
3.2.1. Анатомо-гистологическое исследование коры ивы пруто видной 96
3.2.2. Анатомо-гистологическое исследование измельчённого сырья коры ивы прутовидной 98
3.2.3. Анатомо-гистологическое исследование коры ивы остролистной 99
3.2.4. Анатомо-гистологическое исследование измельчённого сырья коры ивы остролистной 101
3.3. Сравнительное морфологическое исследование почек видов рода Тополь 104
3.4. Сравнительное анатомо-гистологическое исследование почек видов рода Тополь 109
3.4.1. Анатомия и гистология почек тополя лавролистного {Popuhts laurifolia
Ledeb.) 115
Выводы к главе 3 119
ГЛАВА 4. Сравнительное исследование химического состава некоторых представителей семейства ивовые (saucaceae) 122
4.1. Исследование химического состава некоторых видов семейства Salicaceae 123
4.1.1. Выделение и характеристика веществ из видов рода Populus и Salix 124
4.1.2. Изучение строения соединений выделенных из видов семейства Salicaceae 135
4.1.2.1. Флавоноиды Salix acutifolia Willd 135
4.1.2.2. Фенилпропаноиды и простые фенолы видов семейства Salicaceae 138
4.1.2.3. Физико-химические константы и спектральные характеристики выделенных веществ видов рода
Populus 142
4.1.2.4. Изучение спектральных характеристик растворов флавоноидов и водно-спиртовых извлечений сырья видов рода тополь и прополиса 152
Выводы к главе 4 156
ГЛАВА 5. Сравнительное исследование компонентного состава сырья ивы, тополя и прополиса методом ВЭЖХ 159
5.1 Сравнительное физико-химическое исследование флавоноидов и
фенилпропаноидов представителей семейства Salicaceae методом
ВЭЖХ 160
5.2. Сравнительное исследование компонентного состава почек видов рода Тополь методом ВЭЖХ 164
5.3 Сравнительная оценка содержания пиностробина и других флавоноидов в прополисе и почках видов рода Тополь методом ВЭЖХ 169
Выводы к главе 5 172
ГЛАВА 6. Стандартизация сырья и препаратов растений семейства salicaceae и прополиса 174
6.1. Разработка подходов к стандартизации видов рода Тополь 177
6.1.1. Разработка методик количественного определения биологическиактивных соединений в сырье и препаратах представителей семейства Salicaceae L 180
6J. 1Л. Количественное определение суммы флавоноидов и фенилпронаноидов в сырье и препаратах тополя методом спектрофотометрии 180
6.) Л .2. Исследование динамики накопления флавоноидов и фенилпропаноидов в почках тополя 184
6.1Л .3. Количественное определение содержания флавоноидов методом ВЭЖХ 186
6.2. Разработка подходов к стандартизации прополиса 187
6.2.1. Разработка методики качественного анализа сырья прополиса 190
6.2.2. Разработка методики количественного определения для сырья рополиса 192
6.2.2.1. Количественное определение суммы флавоноидов и енилпропаноидов прополиса методом спектрофотометрии.. 193
6.3. Разработка методик качественного анализа сырья и препаратов представителей рода Ива (Salix L.) 198
6.4. Разработка методик количественного анализа сырья и препаратов представителей рода Ива 204
Выводы к главе 6 210
ГЛАВА 7. Разработка нормативной документации на сырьё и препараты представителей рода тополь
7.1. Разработка нормативной документации на сырьё и препараты тополя 213
7.1.1. Разработка нормативной документации на «Тополя почки» 213
7.1.1.1. Включение в нормативную документацию на «Тополя почки» анализа методом ВЭЖХ 219
7.1.2. Разработка нормативной документации на лекарственное средство «Тополя настойка» 222
7-1.3, Разработка разделов нормативной документации на прополис 227
7.2. Разработка нормативной документации на стандартный образец пиностробина 229
7.3. Разработка разделов нормативной документации на сырьё и препараты ивы 235
Выводы к главе 7 237
ГЛАВА 8. Исследования по обоснованию целесообразности создания новых лекарственных средств на основе сырья видов семейства saucaceae 239
8,1. Научное обоснование целесообразности использования в медицинской практике препаратов на основе сырья видов семейства Salicaceae в качестве источника антимикробных, противогрибковых, нсйротропных и
адаптогснных лекарственных средств 240
8.1.1. Исследования по обоснованию разработки препаратов, на основе сырья видов рода Popalus L 241
8.1 Л Л.Исследование лекарственных препаратов на основе почек тополя 241
8 Л Л .2.Исследования лекарственных препаратов на основе сырья осины 247
8 Л Л .3.Разработка способа получения лекарственного препарата «Тополя настойка» 249
8.1 Л .4.Разработка способа получения лекарственной фитопленки «Топоплен» 252
8.1.2. Исследования по обоснованию разработки препаратов на основе коры ивы остролистной и ивы прутовидной 259
8.1.2.1. Исследования актопротекторной активности препаратов на основе сырья видов рода Salix 260
8Л.2.2. Исследование нейротропной активности препаратов на основе сырья видов рода Salix 264
Общие выводы 273
Список литературы
- Ботаиико-фармакогностическая характеристика видов рода Ива (Salix L.)
- Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
- Морфологическое исследование и внешние признаки цельного и измельчённого сырья коры ивы прутовидной
- Изучение строения соединений выделенных из видов семейства Salicaceae
Введение к работе
Актуальность темы. В данное время на фоне неблагоприятной экологической ситуации ведётся интенсивный целенаправленный поиск сырьевых источников флавоноидов и фенилпропаноидов для создания на их основе лекарственных препаратов, обладающих антимикробным, противовоспалительным, нейротропным и другим действием (Самылина И.А., 1994; Дубищев А.В., Кулагин О.Л., 2003; Киселёва Т.Л., 2009; Куркин В.А., 2009). Поэтому в последнее время в фармации и медицине всё большую популярность приобретают лекарственные средства и сырьё растительного и животного происхождения, содержащие в качестве ведущих групп биологически активных соединений (БАС) флавоноиды и фенилпропаноиды, которые относятся по современной классификации к фенольным соединениям (Куркин В.А., 1992; 2007).
Богатым и перспективным источником флавоноидов, фенилпропаноидов являются растения рода Ива (Salix L.) и Тополь (Populus L.) семейства Ивовых (Salicaceae), а также продукт совместного труда пчёл и растений - прополис (рег. № 95/335/910, ВФС 42-1084-81) (Wollenweber E., 1987; Bankova V., 1989; Поправко С.А., Соколов И.В., 1990; Куркин В.А. и др., 1991; 2009). В связи с этим, весьма актуальным является комплексное фармакогностическое исследование сырьевых источников и физико-химическое исследование флавоноидов и фенилпропаноидов сырья представителей семейства Ивовых, а также обоснование целесообразности разработки лекарственных средств на их основе.
Ярким примером перспективности данного направления являются уже созданные отечественные препараты прополиса с выраженной антибактериальной активностью: настойка (рег. № 90/111/3, ФС 42-3736-99), «Пропосол» (рег. № 72/425/9, ФС 42-3463-97), «Пропоцеум» (рег. № 76/788/4, ФС 42-2354-92).
Научные исследования последних лет вновь подтвердили эффективность популярного в народной медицине лекарственного растительного сырья (ЛРС): почек некоторых видов рода Тополь и коры представителей рода Ива. Почки тополя чёрного (Populus nigra L.) включены в Государственный реестр лекарственных средств (ГРЛС), разрешённых к применению в медицинской практике в качестве антисептического средства (рег. № 74/684/6). Однако к началу наших исследований нормативная документация (НД) на данное сырьё отсутствовала, так как имеющийся в своё время (1932 г.) ОСТ 4286 на почки тополя чёрного утратил юридическую силу. Кроме тополя чёрного в ГРЛС имеются также гомеопатические препараты: тополь бальзамический (Populus candicans) (рег. № 95/335/899), тополь осинообразный (Populus tremuloides) (рег. № 95/335/900). Также о целесообразности внедрения в научную медицину почек тополя и коры ивы свидетельствует положительный опыт использования в зарубежных странах: почек тополя чёрного в Германии и Болгарии, а коры ивы - в Британской, Европейской и немецкой Фармакопеях. Наряду с этим введение коры ивы остролистной в отечественную медицину позволит использовать данное растение комплексно, т.к. листья ивы остролистной (Salix acutifolia Willd.) являются фармакопейным сырьём (рег. № 87/637/2; ВФС 42-1697-87) для получения лютеолин-7-глюкозида-стандарта и противовирусного препарата «Салифозид».
Кроме того, опыт отечественных (Куркин В.А., 1989) и зарубежных ученых (Thieme H., 1970; Greenaway W., 1989) свидетельствует о том, что перспективным источником получения противовоспалительных препаратов является кора осины (Populus tremula L.) и ивы прутовидной (Salix viminalis L.) – источник получения Государственного стандартного образца (ГСО) триандрина.
Немаловажным фактором целесообразности расширения сырьевой базы является то обстоятельство, что почки тополя представляют собой доступное и легко воспроизводимое ЛРС, а запасы коры ивы во много раз превышают сырьевые запасы листьев растений данного рода.
Растения семейства Ивовых широко используются в народном хозяйстве, строительстве, промышленности и др. При рубке леса, заготовках древесины кора и почки являются отходами производства и на сегодняшний день практически не используются. В то же время кора, побеги, почки растений могут рассматриваться как перспективные сырьевые источники новых эффективных лекарственных средств и рационально использоваться в комплексной безотходной технологии при заготовках и рубке леса как вторичное сырье.
Таким образом, представляется актуальным проведение комплексного фармакогностического исследования почек различных видов рода Тополь и коры некоторых растений рода Ива, направленного на расширение сырьевой базы и внедрение данного ЛРС в медицинскую практику. Кроме того, актуальным является физико-химическое исследование флавоноидов и фенилпропаноидов данных видов сырья, разработка подходов к современной стандартизации сырья и препаратов тополя и ивы, а также сырья прополиса.
Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является комплексное фармакогностическое и физико-химическое исследование сырья, флавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства Ивовых в плане экспериментально-теоретического обоснования новых подходов к стандартизации и созданию на их основе лекарственных средств.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
комплексное морфологическое и микроскопическое исследование и выявление диагностических признаков ЛРС представителей семейства Ивовых;
-
сравнительное исследование химического состава ЛРС следующих представителей семейства Ивовых: почек тополя чёрного (Populus nigra L.), т. бальзамического (P. balsamifera L.), т. душистого (P. suaveolens Fisch.), т. лавролистного (P. laurifolia Ledeb.), т. канадского (P. deltoides Marsh.); коры осины (P. tremula L.), ивы остролистной (Salix acutifolia Willd.), ивы прутовидной (S. viminalis L.); сырья прополиса с помощью современных методов анализа;
-
выделение из ЛРС индивидуальных биологически активных соединений, идентификация, установление структуры выделенных веществ;
-
сравнительное исследование спектральных, физико-химических и фармакологических свойств флавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства Ивовых;
-
разработка и научное обоснование новых подходов к стандартизации сырья и препаратов тополя и сырья прополиса;
-
исследование динамики накопления биологически активных соединений - флавоноидов и фенилпропаноидов в почках тополя;
-
разработка показателей качества и объективных методик анализа для изучаемых видов ЛРС, лекарственных препаратов и ГСО пиностробина;
-
разработка нормативной и технологической документации на изучаемые виды ЛРС, стандартный образец пиностробина и лекарственные препараты;
-
научное обоснование целесообразности использования в медицинской практике сырья представителей семейства Salicaceae (роды Populus L., Salix L.) в качестве источника антимикробных и адаптогенных лекарственных средств.
Научная новизна. Впервые проведены сравнительные комплексные фармакогностические исследования ЛРС представителей семейства Salicaceae.
В результате сравнительного анатомо-морфологического исследования, в том числе с использованием методов цифровой макро- и микроскопии, почек тополя бальзамического, т. дельтовидного, т. душистого, т. лавролистного и т. чёрного, а также коры ивы остролистной и ивы прутовидной, были выявлены особенности анатомо-морфологического строения, и установлены внешние и микроскопические диагностические признаки для данных видов сырья.
В сравнительном плане изучен химический состав ЛРС с использованием методов колоночной хроматографии (КХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Проведены сравнительные исследования физико-химических и спектральных свойств основных компонентов сырья – флавоноидов и фенилпропаноидов с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, УФ-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.
В результате химического изучения почек Populus suaveolens Fisch. и P. laurifolia Ledeb., с использованием жидкостной адсорбционной колоночной хроматографии, впервые выделены 3 фенилпропаноида и 15 флавоноидов - новых для этих видов, причем 7,4’-диметилкемпферол и рамназин ранее не были описаны для растений рода Populus L., пинобанксин впервые выделен из данного рода и семейства Salicaceae, а популигенин (5-гидрокси-3,7-O-диацетилфлаванон) является новым природным соединением.
Впервые проведено сравнительное изучение компонентного состава 5 видов тополя, разрешённых для получения ЛРС «Тополя почки». Установлено, что особенностью подавляющего большинства известных флавоноидов почек тополя является агликоновая природа флавоноидов и отсутствие у большинства флавоноидов рода Populus L. заместителей в боковом бензольном кольце B.
Впервые детально сравнительно изучен компонентный состав почек различных видов тополя, а также гибридных и полиплоидных форм растений, произрастающих в различных регионах РФ, в результате чего были установлены критерии предварительной оценки перспективности использования вида в качестве источника сырья для получения препаратов антимикробного действия.
Из коры Salix acutifolia Willd. нами впервые выделено 9 фенольных веществ: нарингенин, прунин, изосалипурпол, катехин (флавоноиды); сирингин, триандрин (фенилпропаноиды); ацил-салигенин, саликортин и тремулацин.
В результате сравнительного исследования химического состава было установлено, что доминирующими компонентами в коре ивы прутовидной являются фенилпропаноиды, а в коре ивы остролистной - флавоноиды.
Впервые с использованием методов ТСХ, КХ, ВЭЖХ, УФ-, ЯМР-спектроскопии и других в сравнительном плане изучены зависимости в ряду: «химическая структура - физико-химические свойства» флавоноидов и фенилпропаноидов, выделенных из представителей семейства Salicaceae. Установлено влияние заместителей при бензольных кольцах A и B флавоноидов тополя на их растворимость в различных растворителях, на хроматографическую подвижность в условиях ТСХ, КХ, ВЭЖХ и на характер электронных спектров как исходных, так и с химическими добавками комплексообразователей.
Впервые установлены зависимости для флавоноидов тополя в ряду «химическая структура - биологическая активность», показанная на примере пиностробина и пиноцембрина. Так, свободный фенольный гидроксил флавоноидов в положении C-7 (пиноцембрин) проявляет более выраженную антимикробную активность на широкий спектр микроорганизмов по сравнению со свободным фенольным гидроксилом в положении C-5 (пиностробин и пиноцембрин). При этом пиностробин проявляет слабовыраженную, но избирательную активность в отношении грамотрицательных микроорганизмов из-за метилированного гидроксила при C-7, что повышает его сродство к липофильной мембране.
Приоритет проведённых исследований защищён 2 патентами РФ на изобретение: «Способ получения настойки тополя для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей» (Патент № 2135201) и «Способ получения лекарственной фитопленки» (Патент № 2155071).
Практическая значимость. В результате проведения комплекса научных исследований созданы объективные предпосылки для расширения ассортимента ЛРС, эффективных отечественных лекарственных фитопрепаратов представителей семейства Salicaceae, разработаны современные объективные методики стандартизации сырья и лекарственных средств с использованием ГСО.
На основе полученных данных по химическому составу разработаны методологические подходы определения действующих веществ в ЛРС и препаратах с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопии.
Для препаратов почек тополя и сырья прополиса разработана качественная реакция методом ТСХ с использованием ГСО пиностробина по двум ведущим флаванонам - пиностробину (Rf ~ 0,8) и пиноцембрину (с Rs около 0,7 относительно ГСО пиностробина), имеющим диагностическое значение.
Для определения подлинности и доброкачественности ГСО пиностробина предложены методы ТСХ, ЯМР-, УФ-спектроскопии и показатели качества.
Результаты исследования химического состава различных видов, а также особенностей их внешних признаков и анатомо-морфологического строения ЛРС включены в проекты соответствующей нормативной документации (НД):
показатели качества 5 видов ЛРС включены в ФСП 42-0329168201 «Тополя почки, «ангро», рекомендованы для включения в ФС «Ивы остролистной кора» Государственной Фармакопеи РФ XII издания (письма в Фармакопейный государственный комитет Минздравсоцразвития РФ № 126 и № 133 от 27.01.05 г., приняты 01.02.05 г. – приложения 12, 14);
полученные в результате исследований цифровые микрофотографии препаратов коры ивы корзиночной, ивы остролистной, почек тополя предложены для включения в разделы «Внешние признаки» и «Микроскопия» соответствующих ФС, ФСП 42-0329168201 «Тополя почки «ангро»», а также в плане методологии разработки общей фармакопейной статьи (ОФС) – «Почки».
показатели качества лекарственного средства «Тополя настойка» (ФСП 42-0329174701) и «Пиностробин–стандартный образец» (ФС 42-0073-01),
методики качественного анализа и количественного определения суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в препаратах тополя, а также в сырье прополиса (письма в Фармакопейный государственный комитет Минздравсоцразвития РФ № 126, 127 от 27.01.05 г. и № 159 от 31.01.05 г., приняты 01.02.05 г. – приложения 12, 13, 15);
с использованием современных методов анализа на основе сравнительного исследования физико-химических, спектральных и фармакологических свойств выявлены закономерности в ряду: «структура-свойства» флавоноидов и фенилпропаноидов сырья представителей семейства Salicaceae;
разработаны и запатентованы способы получения лекарственных фитопрепаратов настойки тополя (патент РФ № 2135201) и лекарственной фитоплёнки «Топоплен» (патент РФ № 2155071, ТУ 9362-003-01963143-98).
На основе полученных результатов исследований разработана НД на изученные виды ЛРС, стандартные образцы веществ и лекарственные препараты (ФСП 42-0329168201 «Тополя почки, «ангро», проект ФС «Ивы остролистной кора», ФС 42-0073-01 «Пиностробин–стандартный образец», рег. № 001373/01-2002; ФСП 42-0329174701 «Тополя настойка», лабораторно-технологический регламент на получение ГСО пиностробина) (приложения 16-21).
Практическая значимость результатов проведённых исследований подтверждена актами о внедрении (приложения 5-11): ЗАО «Самаралектравы» (от 16.02.12 г.), Средне-Волжский филиал ГНУ «ВИЛАР» РАСХН (от 20.02.12 г.), ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области» и на кафедрах ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (от 21.02.12 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (№ государственной регистрации 01200202298) по темам «Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения» (№ 01200900658) и «Фармакогностическое и химико-фармацевтическое исследование лекарственных растений и фитопрепаратов» (№ 01200405620), а также Республиканских программ Минздравсоцразвития РФ «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ 01990005277) и «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ государственной регистрации 01990007536).
Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Результаты сравнительного анатомо-морфологического исследования сырья представителей семейства Ивовые (почек тополя, коры ивы).
-
Результаты химического исследования почек Populus suaveolens Fisch., Populus laurifolia Ledeb., коры Salix acutifolia Willd.
-
Результаты сравнительного изучения химического состава прополиса, почек некоторых видов рода Populus L. и коры видов рода Salix L.
-
Методологические подходы к стандартизации сырья прополиса, растительного сырья и препаратов на основе видов рода Populus L.
-
Научное обоснование взаимосвязи структуры и некоторых физико-химических и фармакологических свойств флавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства Salicaceae;
-
Экспериментально-теоретическое обоснование целесообразности разработки лекарственных средств на основе представителей семейства Ивовых.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международных научных конференциях: «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 1995; 1999), «Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений» (Новосибирск, 1998), IV Съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999), «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000), на V-XVIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1998 – 2011), Всероссийских научно-практических конференциях «Экология и здоровье человека» (Самара, 1995, 1997, 1998; 2002, 2005 - 2008; 2011). Результаты диссертационного исследования обсуждались также на международных конференциях по полифенолам: Polyphenols Communications, International Conference on Polyphenols (XXI - Marrakech-Morocco, 2002; XXII - Helsinki-Finland, 2004; XXIII - Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006; XXIV - Salamanca, 2008), а также на VI Международном Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 61 научной работе, из них 23 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2-х патентах РФ на изобретение, монографии «Ива, тополь и прополис в медицине и фармации», в лабораторном технологическом регламенте на получение ГСО пиностробина, ФСП 42-0329168201 «Тополя почки «ангро», ФСП 42-0329174701 «Тополя настойка», ФС 42-0073-01 «Пиностробин–стандартный образец».
Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 310 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 80 рисунков, список литературы, включающий 286 ссылок, в том числе 66 иностранных, 24 – интернет ресурсов. Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов и приложений.
Во введении обосновывается актуальность темы, формулируются цель и задачи исследований, отмечены научная новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены основные положения, выносимые на защиту. Первая глава посвящена обзору литературы по современному состоянию исследований видов родов Populus L., Salix L. и прополиса, в котором обобщены и систематизированы сведения по химическому составу, фармакологическим свойствам и применению представителей сем. Salicaceae и прополиса в медицине. Кроме того, рассматриваются вопросы по проблемам стандартизации сырья представителей данного семейства и препаратов. В главах 2-8 представлены экспериментальные данные и обсуждены результаты собственных исследований. В главе 2 дана характеристика объектов и методов исследования. В главе 3 даны результаты анатомо-гистологических и морфологических исследований, диагностические признаки коры ивы прутовидной, ивы остролистной, почек тополя. Глава 4 посвящена обсуждению результатов исследования химического состава представителей семейства Salicaceae, вопросам изучения физико-химических показателей, установлению строения и идентификации выделенных веществ. В главе 5 приведены разделы сравнительного исследования компонентного состава коры видов ивы, почек тополя и сырья прополиса. В 6 главе обсуждаются проблемы стандартизации сырья и препаратов представителей семейства Salicaceae и сырья прополиса, а также предложенные методологические подходы к стандартизации ЛРС и препаратов. Глава 7 посвящена разработке и совершенствованию НД на сырьё и препараты тополя, ивы и сырьё прополиса, а также на ГСО пиностробина. Глава 8 представляет результаты исследований по научному обоснованию целесообразности создания лекарственных средств и стандартных веществ на основе сырья ивы и тополя.
В приложения вынесены акты внедрения, письма в Фармакопейный государственный комитет Минздравсоцразвития РФ, ФС, ФСП, патенты, протоколы исследований.
Ботаиико-фармакогностическая характеристика видов рода Ива (Salix L.)
Все растения семейства Ивовые представляют собой светолюбивые и влаголюбивые растения [1, 4, 6, 9, 10, 14, 51, 52, 60, 68, 71, 81, 124, 133, 134, 165, 175, 189, 191, 193, 195,209,226,236].
Подавляющее большинство видов семейства Salicaceae L. произрастает в умеренном климате [6, 9, 60, 195, 226]. В тропики проникли лишь единичные экземпляры ив и тополей. Преимущественно семейство Ивовые приурочено к северному полушарию. Наиболее богата видами ив и тополей Азия, за ней идет Северная Америка, в Европе видов меньше, а в Африке - единичные виды [6, 9, 60, 195, 226]. Известный ботаник XX в. А.И. Шретер констатировал, что флора Советского Дальнего Востока насчитывает 73 вида из 3 родов данного семейства [236]. Род Чозения (Chosenia Naka) семейства Ивовых представлен единственным видом - Чозения крупночешуйчатая Chosenia macrolepis (Turcz.) Кот., которая похожа на некоторые виды ив, но отличается от них строением цветков (имеет 2 свободных пестика и 5 тычинок) [226, 236]. Почки когтеобразные, сплюснутые, блестящие. Чозения широко распространена на Дальнем Востоке, начиная с Крайнего Севера и заканчивая Приморьем, а также в Японии, Корее и Китае [226, 236].
Род Ива (Salix L.) объединяет 350-400 видов деревьев, кустарников и кустарничков, распространённых на большей части суши Земли [195]. В книге «Растительные ресурсы СССР...» представлен обзор данных литературы об ареале, экологии, химическом составе и полезных свойствах 47 дикорастущих видов рода Ива [195]. В издании «Ареалы деревьев и кустарников СССР» описано 120 видов ив [6].
Во «Флоре СССР» описано 163 определённых видов рода Ива [226]. Кроме того, представлено 9 «видов сомнительных» и 90 гибридов ив, известных под самостоятельным названием. Среди ив есть мелкие и крупные кустарники, реже деревья, достигающие 25-30 м высоты и до 1,5-3 м в диаметре ствола (S. alba L.) [226].
Среди ив, главным образом, встречаются деревья и кустарники, произрастающие во всех физико-географических регионах России и стран бывшего СССР, предпочитающие хорошо увлажняемые территории (долины и поймы рек, заболоченные участки местности) [6, 14, 51, 52, 60, 71, 124, 133, 134, 141, 189, 193, 195, 226]. В условиях сухого и жаркого климата ивы растут на влажных территориях, а также в лесном, субальпийском и альпийском поясе гор. Примечательно, что в равнинных условиях флора, образуемая ивами, достаточно однообразна [6, 14, 51, 52, 60, 71, 189, 195, 226].
Виды тополя, в свою очередь, представлены быстрорастущими древесными формами, широко распространёнными во всей Европейской части России, Украины, Белоруссии и других стран, бывших в составе СССР, а также в Западной Сибири, Средней Азии, на Кавказе и достаточно широко распространенными за рубежом [1, 4, 6, 9, 10, 14, 51, 60, 71, 195, 226]. В определителе растений Среднего Поволжья из рода Тополь описаны: т. чёрный, т. белый и осина [175]. Из рода Ива описано 17 видов, в том числе ива остролистная и ива корзиночная [175]. Одной из доминирующих пород древесного яруса Самарских лиственных лесов с давних времен по настоящее время является осина [145, 189]. Тополь чёрный, виды ивы произрастают в поймах, долинах, по берегам рек [175, 189].
В природе большинство тополей растёт в долинах рек, только осина (Popuhis tremula L.) чаще встречается в лесах вместе с хвойными (сосной, лиственницей, елью) и в дубравах вместе с лиственными (берёзой, ольхой, дубом) деревьями или образует чисто осиновые рощи - осинники [9, 189, 191, 209, 226].
Осина - одна из самых распространённых древесных светолюбивых пород в северном полушарии Земли [6, 9, 51, 60, 195, 226]. На Севере встречается у границы леса и тундры на 40-й параллели. Растёт осина в лесной и лесостепной зонах, встречается почти на всей территории нашей страны и стран бывшего СССР [6, 9, 51, 60, 195, 226]. В Сибири осина распространена почти по всей территории тайги и лесостепи. Площадь осиновых лесов Сибири занимает около 7 млн. га, что составляет около 48% всех осинников стран бывшего СССР [9].
Осина растёт по берегам водоёмов (преимущественно во впепойменных условиях), в лесах всех типов и рощах, чаще по опушкам, прогалинам и буреломам, изредка на сухих песках; рощами, особенно на месте вырубок и пожарищ, как начало лесовозобновления; а также, как примесь к другим породам, по оврагам, окраинам болот [6, 51, 60, 195, 226].
Тополь светолюбив, приверженцы топлей называют их «эвкалиптами Севера» [60, 191, 209, 226]. Скорость их роста такова, что к 20 годам на 1 гектаре они могут дать такой прирост древесины, какой дубовые или сосновые насаждения дадут только к 100 годам. Тополевые массивы уже в возрасте 25-30 лет дают пригодную для производственных нужд древесину. Тополь - это «фабрика» кислорода: одно дерево выделяет столько кислорода, сколько 7 елей, 4 сосны или 3 липы [9, 191, 193, 209]. К тому же тополь ещё и великолепный фильтр: один взрослый тополь за вегетативный сезон освобождает атмосферу от 20-30 кг сажи и пыли [124, 191, 193, 209]. Интересно, что древние греки, не обладая научными данными об исключительной способности тополей очищать воздух, обсаживали ими места вокруг народных собраний и центральные улицы. То есть, тополь всегда там, где люди. Поэтому ботаники дали роду тополей название «Papains» от латинского «народ» [14, 133, 191, 193, 209]. Тополь лучше всех других деревьев задерживает пыль, кроме того, он является чемпионом по интенсивности поглощения углекислого газа из воздуха, поэтому незаменим в пригородных хозяйствах, а также в санитарных насаждениях и при посадке лесных полос, граничащих с промышленными предприятиями и населенными пунктами [14, 119, 124, 134, 141, 191, 193,209].
Кроме кислорода тополь выделяет в атмосферу большие количества всевозможных летучих соединений, до 3 г в час с каждого квадратного метра листьев [209]. Эти летучие вещества - фитонциды - защищают растение-хозяина от вредных микроорганизмов и грибов. Люди уже научились использовать фитонциды тополя и для своих нужд: например, их применяли в борьбе с ящуром скота [209]. Некоторые из летучих веществ, выделяемых тополем, могут влиять на рост других растений [209]. Листья и почки тополя в природных условиях продуцируют большое количество летучих фитонцидов с бактерицидными и протистоцидными свойствами [1, 11, 51, 60, 193, 195]; плоды яблони и груши, обработанные фитонцидами из листьев тополя, более устойчивы к заболеваниям, как в период вегетации, так и при хранении [195].
Эфирное масло почек тополя обладает антибактериальной активностью и пригодно как отдушка в парфюмерном, мыловаренном производстве и как фиксатор запаха [11, 14,51,71, ПО, 124, 133, 134, 141, 195].
Сырьевая база видов рода Populus L. огромна [9]. Площадь тополевых лесов в мире на конец XX века составляла около 20 млн. га. На территории стран бывшего СССР имеющиеся естественные насаждения с преобладанием осины и других видов тополя занимают около 16 млн. га [9].
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
Обширный набор БАС придаёт мазям, отварам и настойкам из почек противовоспалительные, смягчающие, болеутоляющие, антимикробные свойства. Область применения препаратов тополя в научной и народной медицине совпадает: лечение ран, порезов, ушибов, ожогов [209].
По данным литературных источников для препаратов почек тополя характерно антимикробное, противовоспалительное и ранозаживляющес действие [22, 25, 32, 40, 43, 47, 90, 97, 98, 108, 124, 133, 134, 141, 195]. Немецкие авторы акцентируют внимание на дезинфицирующем и вяжущем действии почек тополя. Так, «Тополевая мазь» рекомендуется при лечении геморроя и ожогов [36, 90]. «Тополевая мазь» также рекомендуется в качестве отвлекающего и дезинфицирующего средства при заболеваниях суставов и как антимикробное средство при лечении ряда грибковых и стафилококковых заболеваний кожи [35, 36, 77, 92, 97]. Кроме того, настой почек тополя рекомендован для лечения мочевыводящих путей и предстательной железы. Гомеопатические препараты «Популюс композитум СП» {«Populus composition SP»), «Гентос» («Gentos») и др. представляют собой капли для приема внутрь и среди прочих ингредиентов содержат Populus iremuloides. Данный препарат рекомендуется при лечении мочевыводящих путей [36, 92]. Почки тополя входят в «Бальзам Маурера» («Maurers Balsam»), рекомендуемый как общеукрепляющее и тонизирующее средство при лечении ряда заболеваний. В болгарской медицине применяются почки тополя в виде настоя для лечения мочевыводящих путей, а также бронхитов и других болезней верхних дыхательных путей [36, 92]. Отмечается отхаркивающее действие почек тополя [91,92].
Отечественные учёные также отмечают выраженные антимикробные свойства почек тополя [5, 9, 21, 22, 37, 41, 43]. Например, настойка почек тополя дельтовидного, применяемая в виде ингаляций, способствует скорейшему заживлению ран и значительному снижению послеоперационных осложнений после тонзилэктомии. Данный препарат может успешно применяться при лечении эпидермофитии стоп [5, 9, 21, 22, 37, 41, 43]. Экстракт почек тополя входит в состав «Рижского бальзама» [5, 9, 21, 22, 37, 41,43].
Исследователи (Van Hoof L. et al., 1989) хроматографически определили в спиртовом экстракте листьев тополя 4 известных фенольных гликозида, два из которых - салицин и салирепозид, как было показано отвечают за противовирусную активность экстракта тополя против вирусов полиомиелита и Семлики [300].
Кроме того, почки тополя могут применяться при лечении ожогов, ран, фурункулах, подагре, ревматизме, геморрое [5, 9, 34, 35, 36]. Мазью почек тополя рекомендуется лечить ревматизм, а настойку применять внутрь по 25-30 капель при простуде. Мазь из почек тополя рекомендуется также для улучшения роста волос [5, 9, 34, 35, 36]. Есть данные о применении мази при лечении алопеции и трещинах сосков груди. Используются эти препараты для лечения ран, язв, дерматитов, в гинекологической практике - при трихомонадном кольпите [36, 92, 195].
Поданным народной медицины, осины коры настой находит применение при циститах, гипертрофии и раке предстательной железы, подагре и ревматизме [153].
На кафедре фармакологии СамГМУ (проф. Дубищев А.В. и аспирант Кодакова М.Н.) в опытах на крысах установлено, что, выделенный нами из коры осины тремулоидин [14], введенный одновременно с гентамицином, предупреждает развитие гентамициновой олигурии, увеличивает почечную экскрецию воды и натрия [57]. Разрабатываемый в СамГМУ препарат тимпол с выраженным противогрибковым действием перспективен в области оториноларингологии [188].
Амосовой Е.Н. (2000 г.) обнаружена высокая гастрозащитная активность флавоноидов и фенолгликозидов, выделенных из коры осины [3].
Крыловой С.Г. и др. (2000 г.) доказаны выраженные антиульцерогенные свойства сухого экстракта коры осины в эксперименте, причем показано, что гастрозащитная активность сухого экстракта коры осины сопоставима с таковой препаратов сравнения — алантона и гастроцепина [94].
Известно, что кроме растений семейства ивовые, обладающих широким спектром выраженной фармакологической активности, также богатым природным источником флавоноидов и фенилпропаноидов является продукт животного происхождения, собираемый пчёлами с почек деревьев и кустарников, близкий к ним по составу веществ - прополис [14].
Перспективно использование почек тополя (Gemmae Populi)., Проведенные исследования показывают высокую эффективность извлечений из почек тополя при различных заболеваниях [4, 11, 20, 21, 26, 27, 29-33, 35, 36, 49,58,76, 101, 105, ПО, 115, 117, 124, 133, 134, 141, 157, 158, 160, 163, 165, 169, 180, 181, 191-193, 195, 209, 211, 229, 240, 242, 243, 248, 303]. Это обстоятельство очень важно с позиций современной доказательной медицины [92, 124, 133, 134, 141]. Описано применение почек тополя черного Popuhis nigra L. (сем. Ивовые - Salicaceae) в качестве антимикробного, раиозаживляюшего и противовоспалительного средства [1, 4, 11, 153, 195, 211]. Так, в народной медицине многих стран почки тополя черного применяются при заболеваниях мочевых путей, при лечении туберкулеза, ревматизма, подагры, различных видах невралгий, артритов, а также при простудных заболеваниях в виде 10% настойки. Кроме того, применяется тополиная мазь на основе настойки (JJnguentum Рориїї), для лечения ран, ожогов, язв и геморроя [4, 76, 153, 195, 211]. Имеются данные о применении почек тополя черного в гомеопатии и косметике, как вяжущего средства и для усиления роста волос [195].
Спиртовая настойка почек тополя дельтовидного Populus deltoides Marsh. (1:50) применяется при лечении эпидермофитии стоп в качестве примочек, а также в послеоперационном периоде после тонзилэктомии в виде ингаляций спиртового экстракта из весенних почек тополя [195, 240].
Такое широкое применение почек тополя обусловлено их высокой активностью в отношении ряда простейших (инфузории и др.), патогенных микроорганизмов (стафилококк и др.), патогенных грибов рода Candida [11,21, 27, 195,240].
Морфологическое исследование и внешние признаки цельного и измельчённого сырья коры ивы прутовидной
Полости клеток имеют пигментированный протопласт с гранулярной зернистой структурой (рис. 38А). Клетки слегка вытянутые (относительной продольной оси чешуи), с чётковидно-утолщёнными стенками (рис. 38А); на поперечном срезе имеют округлую (часто шлемовидную) форму (рис. 39). Эпидермис по краю чешуйки истончается. Клетки становятся более вытянутыми, округлыми. Здесь стенки клеток менее утолщённые, поровые каналы в них на этом же увеличении практически не видны. Протопласт в клетках края чешуи, как правило, не окрашен (рис. 38Б). Клетки наружного эпидермиса продуцируют мощный слой кутикулы (рис. 39), имеющей сложное строение (рис. 39). Клетки эпидермиса на поперечном сечении мелкие с сильно утолщенными стенками. Просвет полости эпидермальпых клеток почти округлый часто оттянутый к поверхности (рис. 39). При рассмотрении эпидермиса на поперечном срезе легко диагностируется толстый слой кутикулы, причём у чешуи внешнего круга кутикула обычно в 1,5 раза толще. Особенностью наружного эпидермиса чешуи почек тополя чёрного является отсутствие опушения. Кутин идентифицируется Суданом III (ярко-красное окрашивание). Часто, особенно на верхушке и по краям чешуи, клетки наружного эпидермиса образуют простые одноклеточные толстостенные кутинизированные, изредка обламывающиеся, волоски с гладкой поверхностью (рис. 49) [14].
Внутренний эпидермис чешуи представлен мелкими округлыми на поперечном сечении клетками с незначительно утолщёнными стенками (рис. 39). Внутренний эпидермис нижней чешуи однослойный из тонкостенных продольно столбчатых клеток (рис. 39). Часть клеток внутреннего эпидермиса имеют блестящее желтоватое содержимое и, часто, большие размеры (предположительно - клетки продуцирующие и (или) накапливающие эфирное масло и смолы) (рис. 38, 39, 45-49). Они окрашиваются Суданом III и индифферентны к раствору метиленового синего. К краю чешуи клетки внутреннего эпидермиса одревесневают, размеры и форма клеток изменяются
Внутренняя поверхность чешуи покрыта заметно более тонким слоем кутикулы (рис. 46, 47, 48). Как под наружным, так и под внутренним эпидермисом располагается пробка (рис. 46). Наибольшего своего развития проока достигает в нижних чешуях, а также в верхушках и центральной наружной части средних и верхних чешуи (рис. 46). У верхних чешуи часто отсутствует внутренняя и крайне слабо развита (1-2 ряда клеток) наружняя пробка, которая окрашивается Суданом III в красный цвет. Основная ткань чешуи - рыхлая паренхима, отличающаяся полиформизмом клеток, имеющих содержимое бурого цвета (рис. 39, 46). В нижних чешуях разрывы паренхимы -воздушные полости, наподибие аэренхимы (рис. 47). В верхушках чешуи клетки паренхимы одревесневают (рис. 39, 46). В верхних чешуях иногда встречаются крупные округлые клетки паренхимы с блестящим содержимым (рис. 39, 46). В основной паренхиме чешуи встречаются группы склереид (рис. 46, 47) и друзы оксалата кальция (рис. 40, 43) [14].
Проводящая система чешуи представлена неполными редуцированными проводящими пучками (рис. 39, 40, 46, 47). Элементы ксилемы, в свою очередь, представлены трахеидами кольчато-спирального типа (рис. 43). В нижних чешуях присутствует один центральный проводящий пучок, в котором 2-3 ксилемных элемента. В верхних чешуях - около 8-ми проводящих пучков, в каждом из которых 7-12 ксилемных элементов (рис. 39, 40). Вокруг проводящего пучка выделяется обкладочная паренхима, в которой нередко встречаются монокристаллы оксалата кальция (рис. 40). Ксилемные элементы (на поперечном срезе) идентифицируется сернокислым анилином (жёлтое окрашивание) [14].
Интересно, что аналогичное анатомическое строение установлено у чешуи терминальных почек т. чёрного, т. лавролистного, т. дельтовидного, т. душистого и т. бальзамического [14].
Не выявлено также принципиальных отличий и при исследовании анатомического строения чешуи боковых (пазушных) почек вышеназванных видов тополя, что позволяет выделить три достаточно легко определяемых признака, пригодных для диагностики (форма утолщений клеточных стенок наружного эпидермиса, его опушения и строение клеток внутреннего эпидермиса) [14].
Непосредственно как под абаксиальным (наружным), так и под адаксиальным (внутренним) эпидермисом распологается гиподермальный слой клеток с пигментированным протопластом. Пигмент протопласта имеет ярко-оранжевую окраску, который растворим в 96% спирте этиловом. Размеры клеток гиподермалыюго слоя относительно эпидермальных в два раза крупнее. Клетки равномерно тонкостенны: стенки клеток утолщены слабо (рис. 39) [14].
Гиподермальный слой особенно заметно выражен у наружных почечных чешуи, причем в основном с абаксиальной стороны: иногда клетки расположены в 2 слоя. Во внутренних чешуях он однослойный или отсутствует полностью [14].
Ниже гиподермы расположена основная паренхима чешуи. Клетки паренхимы неоднородные по размеру со слабо утолщенными стенками обычно одревесневающие, что особенно заметно в верхней части чешуи (рис. 39, 46-48) [14].
В основной паренхиме чешуи встречаются группы склереид (окраска раствором сернокислого анилина) и друз оксалата кальция. Кроме того, изредка встречаются проводящие элементы (рис. 39, 40) [14].
Изучение строения соединений выделенных из видов семейства Salicaceae
Перспективным источником эффективных и безопасных природных антимикробных, противовоспалительных и ранозаживляющих лекарственных средств, наряду с представителями рода Тополь, является продукт пчеловодства совместного производства пчёл и растений - прополис [182, 183-185, 190, 212-214, 218-220, 228, 242-245, 248, 288, 304]. Химический состав прополиса, как по литературным данным [45, 51, 183-185, 212-214, 218-220, 228, 242-244, 254, 287, 304], так и по результатам собственных исследований близок к таковому почек тополя, но вариабелен и определяется компонентным составом преобладающих растительных источников (тополь, ива, береза и др.).
На сегодняшний день стандартизация сырья прополиса проводится по нормативной документации без использования стандартных образцов, а методики не отвечают параметрам валидации [7, 8, 200, 297, 298]. Актуальна эта проблема (совершенствования фармакопейного анализа на современном этапе) и для сырья и лекарственных средств на основе прополиса, в случае которых стандартизация осуществляется без использования какого-либо стандарта, а методики не отвечают параметрам валидации [7, 8]. Так, определение подлинности прополиса проводят реакцией с хлорным железом, которая не является специфичной. Кроме того, для специфического лекарственного сырья прополиса, в отличие от видов лекарственного растительного сырья в нормативной документации отсутствуют разделы подлинности: «Внешние признаки» и «Микросколия», что усложняет борьбу с фальсификацией продукции. Использование в методиках качественного и количественного анализа стандартного образца пиностробина позволит повысить уровень подлинности и качества этого ценного и уникального природного лекарственного сырья с достаточной сырьевой базой.
Схожесть химического состава почек тополя и сырья прополиса учтена нами при решении проблем их стандартизации.
В ходе исследования было установлено, что образцы прополиса, собранные в Самарской, Ульяновской, Пензенской, Нижегородской, Московской, Саратовской, Оренбургской области, Республике Башкортостан преимущественно типичного «смешанного» или «тополиного» типа с преобладанием поглощения в области 290 нм (рис. 78). Образцы же прополиса из Краснодарского края (Туапсинский район) явно отличаются, представляя собой «осиновый тип» с преобладанием поглощения в области 310-330 нм (рис. 80). Для исследованных образцов прополиса в УФ-спектрах характерен батахромный сдвиг, аналогичный пииостробииу (рис. 79), одного из основных максимумов поглощения из области 285-295 нм в область 305-315 нм после добавления трёххлористого алюминия и образования батахромного комплекса с флаванонами, что рекомендуется использовать в реакции подлинности на прополис (рис. 78 и 80).
Изучение спектров поглощения водно-спиртовых растворов сырья прополиса и препаратов тополя, а также доминирующих индивидуальных флавоноидов и фенилпропаноидов позволило сделать вывод о том, что характер суммарных кривых поглощения УФ-спектров определяется в основном веществами флаваноновой природы (пиностробина и пиноцембрина). Для качественного и количественного изучения компонентного состава почек различных видов рода тополь и сырья прополиса был использован метод ВЭЖХ. Результаты данных исследований позволили разработать методологию ВЭЖХ-анализа для стандартизации сырья прополиса и почек тополя, с использованием ГСО пиностробина.
Пиностробин в данной системе растворителей наиболее подвижен и четко определяется на хроматограммах в виде пятна ярко-желтого цвета после проявления диазобензолсульфокислотой в насыщенном растворе карбоната натрия. При этом на хроматофамме обнаруживаются и другие вещества фенилпропаиоидпой и флавоноидной природы с меньшими значениями Rf9 однако они не имеют диагностического значения, так как их содержание сильно варьирует в зависимости от происхождения прополиса, но которые имеют значение в плане установления происхождения (или типа) прополиса. На основании данных исследований разработана ТСХ-методика качественного определения подлинности прополиса с использованием ГСО пиностробина.
Разработаны показатели качества и объективные методики анализа для изучаемых видов ЛРС, стандартного образца пиностробина и препаратов с учетом принципа системного подхода и унификации методик анализа с ГСО.
Для экстрагирования флавоноидов нами был использован 95 % спирт этиловый. Проведенные исследования показали, что экстракция прополиса водными спиртами с концентрацией спирта этилового менее 95 % приводит к снижению результатов анализа по содержанию БАС. Оптимальное извлечение флавоноидов, гидроксикоричных кислот и других фенилпропаиоидов (/7-кумаровый и транс-конифериловый альдегиды, конъюгаты транс-кониферилового спирта) достигается в условиях кипения экстрагента в течение 30 минут при соотношении сырье-экстрагент 1:40. Увеличение и уменьшение времени извлечения приводит к некоторому снижению результатов. При уменьшении количества экстрагента получали густые растворы, затрудняющие работу на стадии фильтрации.
Методика качественного анализа прополиса. На линию старта пластинки "Sihtfol UV-254" или «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» или «Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФ» наносят микропипеткой 0,03 мл профильтрованного извлечения - раствора А (см. Раздел «Количественное определение») в одну точку в виде пятна или полосы шириной до 1 см, рядом наносят 0,02 мл (4 мкг) 0,02 % раствора Государственного стандартного образца (ГСО) пиностробина в 95 % спирте. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 5 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение 1 ч смесью растворителей хлороформ - этиловый спирт 95 % (9:1), и хроматографируют восходящим способом до прохождения фронта растворителя около 10-13 см. Пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин и просматривают в УФ-свсте при длине волны 254 нм. На хроматограмме на светлом флуоресцирующем фоне должно обнаруживаться фиолетовое пятно на уровне пятна ГСО пиностробипа с Rf около 0,8 (пиностробии).
Хроматограмму опрыскивают раствором диазобензолсульфокислоты, помещают в сушильный шкаф и выдерживают при температуре 100-105 С в течение 2 мин. На хроматограмме препарата должно появиться отчетливое пятно ярко-желтого цвета с Rf около 0,8 (пиностробин) и оранжевое пятно с величиной Rs (относительно ГСО пиностробина) около 0,7 (пиноцембрин). Допускается наличие других пятен флавоноидов и фенилпропаноидов с меньшими значениями / (Приложение, рис. 86).
Примечания. 1. Приготовление раствора ГСО пиностробина. См. раствор А в разделе «Количественное определение».
Подготовка пластинок. Пластинки "Silnfol UV-254" 15x15 см или «Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФ» разрезают поперек линий накатки на 3 части размером 15x5 см и перед использованием активируют в сушильном шкафу при 100-105 С в течение 1 ч, или пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» (ТУ 26-11-17-89) разрезают поперек линий накатки на 2 части 10x5 см, используют без активации.
