Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Циклодекстрины и их использование в фармацевтической промышленности 13
1.1 История циклодекстринов 13
1.2 Строение молекул циклодекстринов 15
1.3. Свойства циклодекстринов 17
1.4. Химически модифицированные производные циклодекстринов 20
1.5 Получение комплексов включения с циклодекстринами 23
1.6 Использование комплексов включения с циклодекстринами в фармацевтической промышленности 30
1.7 Перспективы использования дисульфирама для терапии катаракты 38
1.8 Выводы по обзору литературы 41
Глава 2. Объекты и методы исследования 42
2.1 Объекты исследования 42
2.2 Получение комплекса включения ДСФ с ГПЦД 43
2.2.1 Получение комплекса включения гетерогенным способом 43
2.2.2 Получение комплекса включения методом сорастирания в пасте 43
2.2.3. Получение комплекса включения жидкофазным методом 44
2.2.4 Получение комплекса включения методом сорастворения 44
2.3 Получение смеси ДСФ с ГПЦД 45
2.4 Методы исследования 45
2.5.1 Растворимость 45
2.5.2 ЯМР спектроскопия 46
2.5.3 Метод УФ-спектрофотометрии 48
2.5.4 Рефрактометрия 53
2.5.5 Гель-фильтрационная хроматография 54
2.5.6 Порошковая рентгеновская дифрактометрия 55
2.5.7 Метод дифференциальной сканирующей калориметрии 55
2.5.8 Термогравиметрический анализ с последующей регистрацией ИК-спектров смеси выделяющихся газов 56
2.5.9 Определение размеров ассоциатов молекул 56
2.5.10 Метод газовой хроматографии 57
2.5.11 Хромато-масс-спектрометрическое исследование 59
2.5.12 Стерилизация насыщенным паром 61
Глава 3. Результаты исследования комплекса включения ДСФ с ГПЦД 62
3.1 Выбор марки ГПЦД 62
3.2 Растворимость комплекса включения ДСФ с ГПЦД в воде и константа стабильности полученного продукта 63
3.3 Кинетика реакции комплексообразования ДСФ с ГПЦД 65
3.4 Эффективность образования комплексов включения ДСФ с ГПЦД, полученных различными методами 69
3.5 Состав комплекса включения ДСФ с ГПЦД и его молекулярная масса 72
3.6 Результаты исследования методами термического анализа 85
3.7 Стабильность комплекса включения ДСФ с ГПЦД в условиях стерилизации насыщенным паром под давлением 92
3.8 Физико-химические свойства комплекса включения ДСФ с ГПЦД 101
3.9 Исследование терапевтической активности ДСФ в отношении дистрофических изменений сетчатки и хрусталика глаза на модели крыс линии OXYS 104
4. Разработка норм качества комплекса включения ДСФ с ГПЦД 106
Общие выводы 123
Список сокращений 126
Список литературы 128
Приложения 143
- Получение комплексов включения с циклодекстринами
- Кинетика реакции комплексообразования ДСФ с ГПЦД
- Стабильность комплекса включения ДСФ с ГПЦД в условиях стерилизации насыщенным паром под давлением
- Разработка норм качества комплекса включения ДСФ с ГПЦД
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Одним из самых распространенных заболеваний глаз в настоящее время является катаракта – помутнение хрусталика. Чаще всего она развивается в результате возрастных изменений глаз и приводит к существенному ухудшению зрения, иногда до полной его утраты. Так, частота выявления катаракты у пациентов старше 80 лет составляет практически 100%. Однако в последнее время это заболевание все чаще выявляется и в более раннем возрасте – до 40 лет. По данным ВОЗ, в Ро ссийс ко й Ф едераци и насчиты в ает ся около 10 миллионов больных катарактой, которым необходима соответствующая терапия. Однако лекарственные средства, представленные на фармацевтическом рынке (Офтан-катахром, Квинакс, Витайодурол, Тауфон), и, в более сложных случаях, хирургические операции по замене хрусталика не всегда позволяют достичь полного выздоровления. По этом у поиск новых лекарственных средств для лечения катаракты, несомненно, актуален.
Одним из перспективных средств для профилактики и лечения катаракты является дисульфирам, используемый в настоящее время для лечения алкоголизма. Дисульфирам активирует антиоксидантную защиту, подавляя действие гидроксильных радикалов, супероксидов, пероксинитритов и хелатов ионов металлов, которые приводят к разрушению белков хрусталика и, в конечном итоге, к его помутнению. Однако возможность использования дисульфирама в офтальмологии ограничена из-за его низкой растворимости в воде. В фармацевтической практике, для увеличения растворимости в воде лекарственных веществ используют циклодекстрины. Б лаго даря сво ем у стро ению, циклодекстрины с лекарственными веществами о б р аз ую т растворимые в воде комплексы включения, что делает возможным разработку новых лекарственных форм на их основе.
Степень разработанности темы исследования
С 2007 по 2012 годы с целью повышения растворимости дисульфирама N. Nagai и соавт. (Biol. Pharm. Bull., 2007) предлагают использовать гидроксипропил--циклодекстрин. Получение водорастворимой формы дисульфирама сделало его перспективным для терапии катаракты, в том числе, в виде глазных капель. Так, N. Nagai и Y. Ito исследовали фармакокинетику и фармакодинамику глазных капель с дисульфирамом на различных биологических моделях (Biol. Pharm. Bull., 2012), причем авторами был предложен механизм действия дисульфирама на развитие катаракты (Biol. Pharm. Bull., 2008). Однако, авторы не приводят данных о строении комплекса включения и его физико-химических свойствах, не проводят стандартизацию и изучение стабильности полученного продукта в водном растворе.
С другой стороны, в работе С.А. Кедика (патент RU 2485939) предложен состав глазных капель, содержащих дисульфирам, гидроксипропил--циклодекстрин, а также таурин. Указанные глазные капли получены путем смешения исходных компонентов без выделения комплекса включения в виде стабильного промежуточного продукта. Физико-химические свойства и состав комплекса включения также не были изучены. Тем не менее, информация о таких характеристиках является необходимой для лекарственных средств.
Актуальным направлением исследований является получение комплекса включения ДСФ с ГПЦД в виде стабильного промежуточного продукта для получения лекарственной формы для терапии катаракты.
Таким образом, целью работы является получение и исследование комплекса включения ДСФ с ГПЦД для разработки лекарственной формы на его основе. Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
Получить комплекс включения ДСФ с ГПЦД;
Выявить связь между строением и свойствами полученного продукта для подтверждения образования комплекса включения;
Исследовать физико-химические характеристики комплекса включения ДСФ с ГПЦД;
Разработать и провести валидацию аналитической методики определения количественного содержания ДСФ в комплексе включения;
Разработать проект спецификации к протоколу для внутрипроизводственного контроля качества комплекса включения ДСФ с ГПЦД;
Изучить стабильность в процессе хранения комплекса включения ДСФ с ГПЦД;
Исследовать терапевтическую активность комплекса включения ДСФ с ГПЦД в отношении дистрофических изменений сетчатки и хрусталика глаза на модели крыс линии OXYS
Решение поставленных задач осуществлялось путем обобщения литературных данных и выполнения экспериментальных исследований.
Научная новизна исследования
Разработан новый метод получения комплекса включения ДСФ с ГПЦД и проведена количественная оценка изменения растворимости ДСФ в результате образования комплекса включения. Графическим методом определена константа стабильности полученного комплекса включения и рассчитана энергия активации реакции комплексообразования. Получены параметры уравнения Аррениуса, которые позволяют определить константу скорости реакции образования комплекса включения ДСФ с ГПЦД при любой температуре в рабочем интервале от 20 0С до 60 0С. Впервые установлены мольное соотношение компонентов комплекса включения в полученном продукте и его физико-химические характеристики (растворимость, фазовое состояние, температура термодеструкции). Предложены методы качественного и количественного анализа полученного продукта. Впервые установлены нормы качества комплекса включения ДСФ с ГПЦД. Разработана и проведена валидация методики определения количественного содержания ДСФ в комплексе включения. Обоснован срок годности комплекса включения ДСФ с ГПЦД на основании изучения стабильности в процессе хранения.
Теоретическая значимость диссертационного исследования определяется тем, что представленные экспериментальные данные анализа фазового состояния ДСФ обосновывают связь между строением и свойствами включаемого в комплекс с ГПЦД вещества. Представлена классификация известных способов получения комплексов включения. Отраженный в работе экспериментальный материал может служить теоретической базой для исследования и создания новых комплексов включения, ограниченно растворимых в воде лекарственных веществ с ГПЦД. Материал диссертационного исследования может быть полезным для использования в курсе лекций по дисциплине «Основы бионанотехнологии», «Физико-химические методы исследования в биотехнологии».
Практическая значимость диссертационного исследования заключается в получении комплекса включения ДСФ с ГПЦД (защищен патентом РФ на изобретение № 2592625), исследована кинетика комплексообразования при различных температурах и подобраны
оптимальные условия для получения комплекса включения. Разработан проект спецификации к протоколу для внутрипроизводственного контроля качества комплекса включения ДСФ с ГПЦД. Способ получения комплекса включения ДСФ с ГПЦД защищен патентом РФ на изобретение № 2580567.
Основные положения и результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры Биотехнологии и промышленной фармации Московского технологического университета Института тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (акт внедрения от 14.05.2018)
Методология и методы исследования
Методологическую основу исследования составили труды зарубежных и российских учёных по получению и исследованию комплексов включения ограниченно растворимых в воде веществ с циклодекстринами.
Для установления состава и подлинности образования комплекса включения в диссертационном исследовании использованы современные физико-химические методы: 1Н ЯМР спектроскопия, Масс-спектрометрия, рефрактометрия, гель-проникающая хроматография, порошковая рентгеновская дифрактометрия, дифференциальная сканирующая калориметрия, термогравиметрический анализ, метод газовой хроматографии, метод лазерного светорассеяния. Методом УФ-спектрофотометрии установлено количественное содержание ДСФ в фармацевтической субстанции.
Положения, выносимые на защиту
Обоснование выбора ГПЦД для получения комплекса включения;
Кинетические параметры исследования комплекса включения;
Количественная оценка изменения растворимости ДСФ в воде в результате образования комплекса включения;
Способ получения комплекса включения ДСФ с ГПЦД;
Молекулярная масса комплекса включения ДСФ с ГПЦД;
Результаты исследования физико-химических характеристик полученного продукта;
Установление норм качества полученного комплекса включения;
Данные исследования стабильности при хранении комплекса включения ДСФ с ГПЦД;
Результаты исследования терапевтической активности комплекса включения ДСФ с ГПЦД в отношении дистрофических изменений сетчатки и хрусталика глаза на модели крыс линии OXYS.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 21 работа, в том числе 7 статей, 4 из которых опубликованы в научных изданиях, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов», рекомендуемых ВАК РФ. Получено два патента на изобретение «Способ получения комплекса включения дисульфирама с циклодекстрином» №2015103464, «Комплекс включения дисульфирама с циклодекстрином» №2592625.
Степень достоверности результатов
В диссертационной работе для проведения комплекса современных физико-химических методов исследования использовано современное сертифицированное оборудование. Для получения статистически достоверных результатов соблюдены правила повторности экспериментов. Методами статистической обработки установлена воспроизводимость и
правильность результатов исследований. Сравнение полученных результатов с применением методов статистической обработки позволяет считать их достоверными. Результаты, полученные различными независимыми методами, хорошо согласуются между собой и взаимно дополняют друг друга.
Апробация результатов
Основные материалы диссертационной работы доложены на: ХIV и ХV ежегодных международных молодежных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая физика", Москва, 2014 г. и 2015 г.; XIV международной научно-практической конференции «Теоретические и практические аспекты развития современной науки» Москва, 2014 г.; Международной конференции «Nanotechnologies and nanomaterials in the contemporary world», Moscow, 2014 г; VIII и XIV международных научно-практических конференциях: «Современные концепции научных исследований», Москва, 2014 г и 2015 г; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины в России и за рубежом», Новосибирск, 2015 г; VI ежегодной Международной научной Интернет -конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы», 2015 г; Х Всероссийской конференции «Химия и медицина» Уфа, 2015; 10th International scientific conference, Munich 2015; The Seventh European Conference on Biology and Medical Sciences, Vienna, 2015; V международной научно-практической конференции, Москва, 2015 г.; Всероссийской молодежной конференции с международным участием, Москва, 2015 г.; II-й Международном молодежном конкурсе, Липецк, 2015.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют паспорту научной специальности 14.04.02 – «фармацевтическая химия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 2 и 3 паспорта специальности «фармацевтическая химия, фармакогнозия».
Связь задач исследования с планом НИР учреждения, где выполнялась диссертационная работа: Диссертационная работа выполнена в рамках инициативной НИР кафедры Биотехнологии и промышленной фармации Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования Московский Технологический Университет (ИТХТ имени М.В.Ломоносова).
Личный вклад автора
Автор принимала непосредственное участие в разработке и обсуждении основных идей диссертации, а также анализе экспериментальных результатов. Самостоятельно выполнен обзор и анализ литературы (в том числе, анализ требований нормативной документации, регламентирующей критерии, предъявляемые к разработке методов контроля качества фармацевтических субстанций), а также выполнен основной объем экспериментальных исследований, включая разработку методик контроля качества комплекса включения ДСФ с ГПЦД. Диссертантом полностью выполнено оформление результатов диссертации в виде публикаций, научных докладов и рукописи диссертации. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
Объём и структура диссертационной работы
Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 24 таблицы и 51 рисунок. Список литературы включает 126 источников, из них 99 на иностранных языках.
Во введении изложены актуальность темы исследования, степень ее разработанности, цель и задачи исследования, научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы, методология и методы исследования, положения, выносимые на защиту, степень достоверности и апробация результатов.
В первой главе представлен обзор литературы, включающий сведения о применении циклодекстринов и ДСФ в фармацевтической промышленности. Показаны перспективы использования циклодекстринов для получения водорастворимых лекарственных форм. Обобщены литературные данные касательно способов получения комплексов включения циклодекстринов с лекарственными веществами.
Во второй главе дана характеристика объектов исследования, описаны методики, применяемые для получения комплекса включения ДСФ с ГПЦД, методы исследования физико-химических свойств и состава комплекса включения ДСФ с ГПЦД.
В третьей главе приводятся результаты экспериментальных данных по получению и исследованию комплекса включения ДСФ с ГПЦД, изучению его состава и физико-химических свойств, результаты исследования терапевтической активности лекарственной формы в отношении дистрофических изменений сетчатки и хрусталика глаза на модели крыс линии OXYS.
В четвертой главе приведены методы оценки качества комплекса включения, представлены результаты определения норм качества полученного комплекса включения, параметры и критерии валидации разработанной методики определения количественного содержания ДСФ в комплексе включения и спецификация к НД на комплекс включения.
Получение комплексов включения с циклодекстринами
На данный момент известно множество методов получения комплексов включения с ЦД. Причем нет четкой классификации этих методов, в различных источниках методы могут называться по-разному, но при этом практически не отличаются по технологии. Достаточно часто в литературе встречается так называемый метод смешивания [9], который заключается в том, что во фрикционной мельнице, защищенной по возможности от света, смешивают ЦД и активное вещество. Добавляют небольшое количество 50%-ного этилового спирта и перемешивают тяжелую суспензию еще в течение 30 мин; полученный продукт, отличающийся тяжелой маслянистостью и пастообразной консистенцией, распределяют на предметном стекле, высушивают до постоянного веса в эксикаторе в присутствии оксида фосфора (V). Далее полученный продукт растирали в порошок. Примером метода смешивания является комплекс включения N-этоксикарбонил-3-морфолинсиднонимина (молзидомин) или его соли с ЦД или производными ЦД. Этот комплекс предназначен для задерживания высвобождения молзидомина в поток крови, что снижает отрицательное воздействие на пациента токсичности вводимого лекарства [3].
Метод соосаждения, описанный в работе [24] практически не имеет принципиальных отличий от метода смешивания. Так, смесь гостя и -ЦД смачивали небольшим количеством воды очищенной и растирали в течение 2-3 часов с последующим высушиванием продукта в вакуумном сушильном шкафу при t=45±2С. Образование комплекса этим методом рассмотрено на примере витамина Е. Процесс комплексообразования при этом контролируют, используя метод микроскопирования комплексов. Полноту комплексообразования определяют по отсутствию масляных включений -свободного витамина Е, и по исчезновению кристаллов -ЦД. Использование ЦД при обогащении пищевых продуктов витаминами и другими биологически активными веществами направлено в первую очередь на повышение качества получаемых продуктов и их функциональности. При образовании комплексов с ЦД уменьшается окисление витаминов, эфирных масел. Ряд витаминов в виде комплексов с ЦД становятся более стабильными, устойчивыми, проявляют лучшую биодоступность. Схожая технология в процессе получения комплекса используется в так называемом твёрдофазном методе [17]. Навески ЦД и гостя подвергают перемалыванию со скоростью от 400 об/мин до 800 об/мин в период времени от 10 до 60 мин при температуре 30-60С, как правило, на планетарной шаровой мельнице, в режимах от ударно-сдвигового до ударного, при мольном соотношении производное от 1:1 до 1:5 с выделением полученного клатратного комплекса, при необходимости, в виде наночастиц с размером частиц менее 100 нм.
Твердофазный метод подробно описан в работе [6] и рассмотрен на примере комплекса -ЦД с 5-гидрокси-4-аминометил-1-циклогексил, циклогептил-3-алкоксикарбо-нилиндола их соли. Как утверждают авторы изобретения, полученный клатратный комплекс, по сравнению с ранее известным близким по структуре и применяемым в промышленности противовирусным соединением - арбидолом, обладает не только повышенной растворимостью и биодоступностью, но и повышенной активностью.
В процессе комплексообразования широко используется так называемый жидкофазный метод, при этом смешивают водный раствор ЦД и раствор гостя в органическом растворителе при перемешивании и нагревании до получения однородного раствора, последующем охлаждении и выделении полученного кристаллического клатратного комплекса [23].
Жидкофазным методом были получены комплексы включения -ЦД с производным 5-гидрокси-4-аминометил-1-циклогексил и циклогептил-3-алкоксикарбонилиндола [6]. Данные комплексы обладают противовирусным действием и проявляют высокую активность против вирусов гриппа
В работе [11] исследовали комплекс включения -ЦД с диметилфталатом, при этом технология его получения несущественно отличается от жидкофазного метода. Авторы готовили водный раствор -ЦД и термостатировали его при 60C. Необходимое количество диметилфталата растворяли в 96% этиловом спирте и приливали к водному раствору -ЦД при перемешивании. Перемешивание реакционной смеси осуществлялось при постоянной температуре в течение 12 часов. После реакционную массу упаривали для удаления органического растворителя, раствор приобретал молочный цвет, вследствие образования осадка комплекса-включения. Раствор переливали в фарфоровую чашку и помещали в холодильник, для выпадения осадка. Образовавшиеся клатраты высушивали в эксикаторе, и осуществляли промывку, сушку и растирание в порошок комплекса включения.
Схожую технология использовали для получения комплекса включения -ЦД с натриевой солью нимезулида [8, 123]. Для этого смешивали водный раствор -ЦД и раствор нимезулида в 0,5 N водном растворе гидроксида натрия. После получения гомогенного раствора с pH= 8,2 - 8,6 (его контролировали при помощи 0,5 M H3PO4), желтый раствор сушили вымораживанием для выделения комплекса включения в виде порошка. Авторы изобретения поставили своей целью разработку лекарственного препарата для лечения пациентов, нуждающихся в лечении воспалительных заболеваний. При введении пациентам терапевтического количества комплекса включения -ЦД с натриевой солью нимезулида и попадании в ЖКТ, в результате чего в желудочном соке образуется молекулярно-диспергированный нимезулид, благодаря чему ускоряется и усиливается абсорбция и действие этого лекарственного средства [8].
Наиболее часто для получения комплексов включения используется метод, который имеет различные названия и заключается в постепенном растворении навески гостя в водном растворе ЦД, при перемешивании, допускается нагревание смеси. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и упаривают досуха, либо используют распылительную или лиофильную сушки. Пример комплекса, полученного этим методом, описан в работе [21] при исследовании комплекса включения -ЦД с уксусной кислотой, который, как утверждают авторы, обладает рядом технологических преимуществ по сравнению с жидкой формой. Уксусная кислота включается во внутреннюю полость ЦД, молекулы которого, являясь молекулярными ловушками, удерживают кислоту в кристаллах комплекса до момента их растворения в воде. Смеси, например, пищевых концентратов, консервантов, подкислителей и вкусовых добавок, содержащие в своем составе кристаллический комплекс -ЦД с уксусной кислотой, могут храниться в порошкообразном или таблетированном виде длительное время и по мере необходимости использоваться [21].
Для удобства классификации и обобщения всех известных методов предложено их поделить на три группы: метод сорастирания в пасте, гетерогенный метод и жидкофазный метод. Примеры и описание методов сведены в таблицу 2.
Кинетика реакции комплексообразования ДСФ с ГПЦД
Для определения порядка реакции и константы скорости реакции комплексообразования ДСФ с ГПЦД марки Cavitron hp5 при разных температурах использовали графический метод. Для этого строили зависимости, в которых по оси абсцисс откладывали время, а по оси ординат - некоторую функцию концентрации. Порядок реакции выбирали таковым чтобы графическая зависимость была линейной в соответствующей системе координат Так для реакции нулевого порядка линейная зависимость наблюдается в системе координат С - т, реакции первого порядка In С- т, реакции второго порядка 1/С - т, соответствующие зависимости функцию концентрации ДСФ от времени представлены на рисунке 10.
Представленные на рисунке 10 зависимости демонстрируют закономерный рост концентрации ДСФ в водном растворе комплекса включения со временем. При этом концентрация ДСФ достигает своего максимального значения и выходит на плато в течение 60 минут. Поскольку кинетические зависимости концентрации ДСФ в водном растворе комплекса включения с ГПЦД при температурах 500С (рис.10 ()) и 600С (рис.10 (Х)) практически совпадают, можно отметить, что получать комплекс включения при температуре выше 500С не имеет смысла, так как это не приведет к большей степени включения ДСФ в ГПЦД.
Как видно из рисунка 10 (б) кинетическая зависимость логарифма концентрации ДСФ в водном растворе комплекса включения от времени является линейной, следовательно, реакция образования комплекса включения ДСФ с ГПЦД имеет частичный первый порядок по ДСФ. Константы скорости реакции при различных температурах определены через угловой коэффициент линейных кинетических зависимостей в координатах уравнения реакции первого порядка и представлены в таблице 8.
По полученным значениям констант скоростей реакции образования комплекса включения ДСФ с ГПЦД при различных температурах для определения энергии активации (Еа) строили графическую зависимость в координатах уравнения Аррениуса: логарифм константы скорости реакции комплексообразования от обратной температуры, представленной на рисунке 11. Через угловой коэффициент полученной зависимости найдено значение выражения Eа/R логарифмической формы уравнения Аррениуса, таким образом значение Еа – энергии активации составило 40 кДж/моль что может предполагать образование водородных связей в процессе формирования комплекса включения [48]. 1 н
Для расчета предэкспоненциального множителя (В) использовали значение lnk при 200С. Данные, необходимые для расчета В представлены в таблице 9.
Определить константу скорости реакции образования комплекса включения ДСФ с ГПЦД при любой температуре в рабочем интервале от 20 0С до 60 0С, что позволяет подобрать наиболее выгодные условия получения готового продукта на производстве.
Стабильность комплекса включения ДСФ с ГПЦД в условиях стерилизации насыщенным паром под давлением
Не смотря на то, что по данным термического анализа комплекс включения ДСФ с ГПЦД является стабильным при нагревании со скоростью 1 С в мин до температуры свыше 200 С, необходимо провести исследование стабильности как самого комплекса включения, так и его водного раствора в условиях стерилизации насыщенным паром под давлением. В качестве образца сравнения был исследован также и ДСФ.
После стерилизации в условиях насыщенного пара под давлением образец ДСФ в виде сухого порошка переходит в форму расплава и приобретает неприятный запах, образец сухого порошка комплекса включения ДСФ с ГПЦД визуально не меняет своей окраски, а водный раствор комплекса включения ДСФ с ГПЦД также желтеет и приобретает такой же запах, что и образец ДСФ.
Результаты исследования образцов методом 1Н ЯМР спектроскопии (рисунок 29) показали наличие некоторых продуктов разложения в образцах ДСФ и водного раствора комплекса включения ДСФ с ГПЦД. Так на 1Н ЯМР спектре ДСФ наблюдаются сигналы, характерные для диэтиламина. При этом, на 1Н ЯМР спектре комплекса включения никаких дополнительных сигналов, характеризующих наличие примесей не наблюдается.
Образцы комплекса включения и его водного раствора после автоклавирования были исследованы методом газовой хроматографии с использованием масс-спектрометрического детектора.
Исследование автоклавированного порошка комплекса включения не показал наличия летучих органических продуктов. Фильтрация хроматограмм по ионам, характерным для аминов (этил- и диэтиламина), которые предположительно являются продуктами разложения ДСФ, не дала положительного результата.
На рисунке 35 приведён интегральный масс-спектр экстракта в метиленхлориде автоклавированного образца комплекса включения (увеличенный по оси ординат). В нём отсутствовали группы ионов, характерные для этил- и диэтиламинов (рисунок 35-36).
На рисунке 38 и 39 приведены хроматограммы равновесной паровой фазы автоклавированного водного раствора комплекса включения. Были однозначно идентифицированы пики сероуглерода (рис. 40), сероокиси углерода (рис. 41) и углекислого газ с аргоном (из воздуха). Количество сероуглерода во вводимом объёме очень велико и практически соответствует максимально допустимой величине сигнала детектора. Его содержание в пробе составляет не менее нескольких миллиграммов.
Использование метода стерилизации в условиях насыщенного пара под давлением не может быть рекомендовано для получения стерильного водного раствора комплекса включения. Исследования методами 1Н ЯМР спектроскопии и газовой хроматографии с использованием масс-спектрометрического детектора позволили идентифицировать продукты разложения ДСФ, что может сигнализировать о нестабильности водного раствора комплекса включения в условиях стерилизации насыщенным паром.
Тем не менее, для получения стерильного продукта в виде сухого порошка, содержащего комплекс включения ДСФ с ГПЦД, может быть использован метода стерилизации в условиях насыщенного пара под давлением. Исследование методами 1Н ЯМР спектроскопии и газовой хроматографии с использованием масс-спектрометрического детектора не показали наличие каких-либо продуктов разложения, что может подразумевать его стабильность.
Разработка норм качества комплекса включения ДСФ с ГПЦД
Комплекс включения ДСФ с ГПЦД представляет собой аморфный порошок от белого с желтоватым оттенком до светло-желтого цвета.
Для определения растворимости согласно ОФС.1.2.1.0005.15 использовали растворители широкой шкалы полярности, например: гексан, ацетон, 96% спирт этиловый, вода.
Комплекс включения ДСФ с ГПЦД легко растворим в воде, растворим в 96% спирте этиловом, практически не растворим в ацетоне и гексане.
Для подтверждения подлинности образования комплекса включения предлагается использовать метод 1Н ЯМР спектроскопии (ОФС.1.2.1.1.0007.15). Методика анализа описана в разделе 2.5.6.
На 1Н ЯМР спектре раствора испытуемого образца должны наблюдаться характерные сигналы положения, интегральные интенсивности и мультиплетности которых должны соответствовать таковым на 1Н ЯМР типичном спектре комплекса включения ДСФ с ГПЦД (включая отклонения значений химического сдвига в пределах ± 0,1 м.д.).
1Н ЯМР типичный спектр комплекса включения ДСФ с ГПЦД представлен на рис. 15 расшифровка и отнесение сигналов в спектре представлены в табл. 11.
Подтвердить подлинность образования комплекса включения можно методом УФ-спектрофотометрии по методу, описанному в разделе 2.5.3 по наличию максимума поглощения при длине волны 216 ± 2 нм на УФ-спектре поглощения раствора комплекса включения в воде (рис. 44 (1) раздел 3.8).
Способ получения комплекса включения не подразумевает появление технологических примесей, кроме того методом ТГА с последующей регистрацией ИК-спектров смеси выделяющихся газов было установлено, что термодеструкция комплекса включения начинается при температуре выше 190 С. Таким образом, появления продуктов деструкции не наблюдается при хранении субстанции в естественных условиях. Исходя из этого, предлагается контролировать содержание родственных примесей, которые могут находиться в исходных компонентах ДСФ и ГПЦД. Поскольку, исходя из загрузки, содержание ДСФ в комплексе включения в мольном соотношении в два раза меньше, а содержание его примесей, согласно нормативному документу, регламентируется не превышающим 0,5 %, то родственными примесями ДСФ можно пренебречь. Содержание родственных примесей в комплексе включения предлагается контролировать согласно стандартной методике предложенной EP 8 для ГПЦД (07/2013:1804). На рис. 46 представлена хроматограмма примеси А: ЦД, полученная по методу ВЭЖХ, описанному в ЕР с использованием испарительного детектора светорассеяния, при температуре испарения 70 С, скорости потока 1.5 мл/мин, на колонке длиной 0.25 м, диаметром – 4.0 мм с наполнителем - силикагель 4-нитрофенил-карбамидсилильный в
На рисунке 47 представлена хроматограмма примеси В: пропиленгликоля, получена методом ГЖХ, описанным в ЕР с использованием пламенно-ионизационного детектора (ПИД) на колонке длиной 30 м, диаметром – 0.32 мм, с наполнителем: макрогол 20 000 (толщина пленки 1 мкм).
Несмотря на то, что потеря в массе при высушивании для исходного компонента ГПЦД, согласно входному контролю, составляет 2.52%, а нормируется EP 8 как не более 10.0%, то нормирование показателя потеря в массе при высушивании комплекса включения ДСФ с ГПЦД должна соответствовать норме для исходного компонента ГПЦД, т.е. не более 10.0%. Испытание проводят методом «Потеря в массе при высушивании», описанным в ОФС.1.2.1.0010.15.
Для получения комплекса включения ДСФ и ГПЦД используется органический растворитель – этиловый спирт, который относится к 3 классу токсичности, его остаточное содержание должно контролироваться.
Для определения остаточного содержания этанола предлагается использовать метод газовой хроматографии, описанный в разделе 2.5.13.
На рисунке 48 представлена хроматограмма водного раствора комплекса включения, зарегистрированная в условиях хроматографирования.
Количественное определение ДСФ в комплексе включения предлагается определять методом УФ-спектрофотометрии, описанным в разделе 2.5.8. На рис 49 представлен спектр поглощения раствора комплекса включения в спирте этиловом.
На рисунке 50 представлена зависимость оптической плотности растворов ДСФ в спирте этиловом от концентрации ДСФ, используемая в качестве градуировочного графика.
Результаты количественного определения ДСФ для трех образцов продукта, полученного по оригинальной методике, приведены в таблице 17. Дополнительно там же представлены данные о загрузке компонентов для получения комплекса включения и остатке кристаллического (нерастворенного) ДСФ на фильтре. Видно, что между результатами УФ-спектрофотометрической методики количественного определения ДСФ для трех серий образцов комплекса включения наблюдается хорошее соответствие, что позволяет рекомендовать ее для дальнейшей стандартизации и валидации.
Линейность
Количественное определение ДСФ проводилось методом УФ-спектрофотометрии, описанному в разделе 2.5.8. Закон Бугера Ламберта Бера выполняется при концентрации ДСФ от 0,04 до 0,012 мг/мл, и наблюдается поглощение при длине волны 216 нм. Коэффициент корреляции оказался равным 0,99948, уравнение прямой: у = 70,78151 х. Зависимость оптической плотности растворов ДСФ в спирте этиловом от концентрации ДСФ, представленная на рис. 27 показывает, что методика линейна.
Специфичность
Максимум поглощения испытуемого раствора образца комплекса включения ДСФ с ГПЦД соответствует максимуму поглощения раствора стандартного образца ДСФ (рис. 51 - 52) Следовательно, методика обеспечивает четкую идентификацию ДСФ в комплексе включения и его отделение от компонентов комплекса включения. Специфичность методики подтверждена с помощью метода УФ-спектрофотометрии.
Максимум поглощения испытуемого раствора образца соответствует максимуму поглощения раствора стандартного образца ДСФ. Следовательно, методика обеспечивает четкую идентификацию ДСФ в испытуемом растворе образца комплекса включения.
Точность
Процент восстановления находится в пределах 98-102%, следовательно, точность методики подтверждена (табл. 19).
Повторяемость
Для определения повторяемости рассчитывали относительное стандартное отклонение по результатам количественного определения ДСФ (п=6) в образце фармацевтической субстанции.
Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов количественного определения ДСФ в образце фармацевтической субстанции (n=6), не превышает 4,0 %, как и требуется по критериям оценки.
Воспроизводимость
Относительное стандартное отклонение внутри серии не превышает 5%. При сравнении дисперсии двух серий измерений с помощью значения критерия Фишера значение превысило 5.05.
Диапазон измерений
Диапазон был валидирован вместе с точностью и линейностью метода от 80 до 120%.
В таблице 17 представлены параметры валидации и критерии приемлимости [98,101], применимые к разрабатываемым методам контроля качества.
Аналитическая методика количественного определения ДСФ в комплексе включения ДСФ с ГПЦД обеспечивает получение достоверных результатов, поскольку критерии приемлемости полностью выполняются.