Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современное состояние и перспективы исследований лекарственных растений, содержащихнафтохиноны (обзор литературы) 21
1.1 Биологическая роль и распространение нафтохинонов в природе 21
1.2 Лекарственные растительные препараты, содержащие нафтохиноны, их фармакологические свойства 27
1.3 Сведения о химическом составе и фармакологических свойствах некоторых шиконинсодержащих представителей флоры Кавказа
1.3.1 Фармакогностическая характеристика семейства Boraginaceae 33
1.3.2 Фармакогностическая характеристика семейства Juglandaceae 38
1.3.3 Фармакогностическая характеристика семейства Urticaceae
1.4 Методы анализа нафтохинонов в лекарственном растительном сырье и лекарственных препаратах, их стандартизация 45
1.5 Заключение по обзору литературы 48
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследований 50
2.1 Материалы исследований 50
2.2 Методы исследований
2.2.1 Определение показателей подлинности и качества лекарственного растительного сырья 56
2.2.2 Выделение фракций из лекарственного растительного сырья для изучения состава биологически активных веществ 57
2.2.3 Химические методы анализа 58
2.2.4 Хроматографические методы анализа 58
2.2.5 Спектроскопические методы анализа 60
2.2.6 Статистическая обработка результатов количественного определения биологически активных веществ 60
2.2.7 Валидация методик количественного определения биологически активных веществ 61
2.3 Дизайн исследования 61
ГЛАВА 3 Выявление зависимости фармакологической активности нафтохинонов от структуры соединения 62
3.1 Структура и биогенез нафтохинонов 62
3.2 Зависимость фармакологической активности нафтохинонов от структуры соединения 67
3.3 Выводы по главе 84
ГЛАВА 4 Способы получения стандартных образцов нафтохинонов, разработка и валидация методик анализа этой группы бав в лекарственном растительном сырье 85
4.1 Получение стандартного образца шиконина 85
4.2 Усовершенствование и валидация методик анализа шиконина в лекарственном растительном сырье
4.2.1 Качественный анализ шиконина 92
4.2.2 Экспресс-анализ лекарственного растительного сырья на содержание шиконина 94
4.2.3 Спектрофотометрическое определение суммы нафтохинонов в пересчёте на шиконин 97
4.2.4 Валидация методик анализа шиконина 99
4.3 Получение и анализ стандартного образца юглона 101
4.3.1 Синтез юглона 101
4.3.2 Разработка методик качественного и количественного анализа юглона в лекарственном растительном сырье 105
4.3.3 Валидация методик анализа юглона 112
4.4 Выводы по главе 115
ГЛАВА 5 Стандартизация лекарственного растительного сырья сем. boraginaceae 116
5.1 Разработка характеристик подлинности лекарственного растительного сырья сем. Boraginaceae 116
5.1.1 Корни видов рода Echium 116
5.1.2 Лекарственное растительное сырьё видов рода Onosma 121
5.2 Скрининг лекарственного растительного сырья сем. Boraginaceae на наличие нафтохинонов 133
5.3 Качественный анализ нафтохинонов в корнях сем. Boraginaceae 134
5.4 Количественное определение суммы нафтохинонов в корнях сем. Boraginaceae 135
5.5 Выделение фракций из травы видов рода Onosma и их анализ 136
5.6 Показатели качества корней синяка русского 144
5.7 Выводы по главе 147
ГЛАВА 6 Стандартизация лекарственного растительного сырья видов рода juglans сем. juglandaceae 148
6.1 Разработка характеристик подлинности лекарственного растительного сырья видов рода Juglans 148
6.1.1 Показатели подлинности коры видов рода Juglans 148
6.1.2 Показатели подлинности листьев видов рода Juglans 153
6.1.3 Показатели подлинности плодов видов рода Juglans 160
6.2 Выделение фракций из лекарственного растительного сырья видов рода Juglans и их анализ 166
6.2.1 Выделение фракций из листьев видов рода Juglans 166
6.2.2 Выделение фракций из плодов видов рода Juglans
6.3 Анализ нафтохинонов в лекарственном растительном сырье видов рода Juglans 172
6.4 Анализ дубильных веществ в лекарственном растительном сырье видов рода Juglans 176
6.5 Анализ прочих фенольных соединений в лекарственном растительном сырье видов рода Juglans 177
6.6 Анализ эфирного масла в листьях видов рода Juglans 181
6.7 Определение макро- и микроэлементного состава в листьях видов рода Juglans 185
6.8 Показатели качества листьев ореха грецкого и ореха чёрного 186
6.9 Выводы по главе 191
ГЛАВА 7 Стандартизация фармацевтических субстанций и лекарственных форм, содержащих нафтохиноны 192
7.1 Разработка фармацевтических субстанций и лекарственных форм,
содержащих шиконин, и методик их стандартизации 192
7.1.1 Разработка фармацевтических субстанций и лекарственных форм на основе корней синяка русского 192
7.1.2 Анализ лекарственных форм, содержащих шиконин 197
7.2 Разработка субстанций и лекарственных форм, содержащих юглон, и методик их стандартизации 201
7.2.1 Разработка технологии экстрактов листьев ореха грецкого 201
7.2.2 Анализ лекарственных форм, содержащих юглон 206
7.2.3 Валидация методик анализа фармацевтических субстанций «Ореха грецкого экстракт жидкий» и «Ореха грецкого экстракт сухой» 208
7.2.4 Разработка состава и анализ таблеток порошка ореха грецкого листьев 212
7.2.5 Разработка методик анализа БАД «Юглон», БАД «Веноспас» и смеси ЛРС для получения БАД «Веноспас» 215
7.3 Усовершенствование методики анализа лекарственного растительного препарата «Аллохол, таблетки, покрытые оболочкой» 219
7.3.1 Анализ фракций, полученных из листьев Urtica dioica 219
7.3.2 Анализ нафтохинонов в листьях Urtica dioica 221
7.3.3 Усовершенствование методики количественного определения БАВ для проекта ФСП «Аллохол, таблетки, покрытые оболочкой» 223
7.4 Выводы по главе 228
ГЛАВА 8 Обсуждение результатов исследования 230
8.1 Методологические подходы к фармакогностическому изучению лекарственного растительного сырья, содержащего нафтохиноны 230
8.2 Обсуждение полученных результатов 234
Общие выводы 240
Заключение 243
Список сокращений 246
Список литературы
- Сведения о химическом составе и фармакологических свойствах некоторых шиконинсодержащих представителей флоры Кавказа
- Статистическая обработка результатов количественного определения биологически активных веществ
- Зависимость фармакологической активности нафтохинонов от структуры соединения
- Спектрофотометрическое определение суммы нафтохинонов в пересчёте на шиконин
Сведения о химическом составе и фармакологических свойствах некоторых шиконинсодержащих представителей флоры Кавказа
В народной медицине Японии, Кореи, Тибета, Китая настои и отвары корней и листьев Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. используются внутрь как жаропонижающее, диуретическое средство, при инфекционных заболеваниях, артрите, импотенции; наружно – при ожогах, обморожениях, порезах, экземе, опухолях [96, 232]. Корни Onosma hookeri C.B. Clarke и Onosma paniculata Bur. et Franch. – наружно для лечения ожогов, обморожений, экземы, язв, воспалений, как кровоостанавливающее [198, 215, 225].
В народной медицине Турции корни Onosma microcarpa Stev. ex DC., O. armeniaca Klok. ex M. Pop и O. sericea Willd. применяют для лечения ран и ожогов [141, 196, 197].
В Индии траву Onosma bracteatum Wall. используют при ревматизме, сифилисе, проказе, переутомлении, лихорадке, тахикардии, раздражении мочевого пузыря и желудка; порошок корней – наружно при кожных заболеваниях; цветки – как тонизирующее и кардиотоническое [188, 215]. Сок корней и порошок Onosma emodi Wall. и O. bicolor Wallich ex G. Don применяют для лечения ушной боли, стимуляции роста и окраски волос; траву – при артериальной ги 38 пертензии, лихорадке, кожных заболеваниях, ревматизме, заболеваниях мочеполовой системы, глаз, лёгких [215].
В Непале порошок корней Onosma echioides L. используют при сыпи; порошок листьев – как слабительное средство; цветки – как кардиотоническое. В Тибете смесь порошка листьев, цветков и мёда применяют для лечения ревматических болей и как кардиотоническое средство, порошок корней – как антисептик для ран [132].
Экспериментально установлено, что извлечения из травы и корней представителей рода Onosma оказывают жаропонижающее, антимикробное [139, 196, 197], ранозаживляющее [193, 194], антипаразитарное, противовоспалительное и анальгезирующее [141, 166], противоопухолевое [218], гипотензивное, кардиотоническое [158], детоксикационное, слабительное, противоопухолевое [130, 198, 225], антиоксидантное [139], антифунгинальное [202], кровоостанавливающее, противокашлевое [141, 149, 189], седативное, тонизирующее, диуретическое, капилляроукрепляющее, противоязвенное действие [161, 233].
Сумма нафтохинонов Alkanna tinctoria (L.) Tausch наружно в виде мази оказывает ранозаживляющее действие при ожогах [167].
Извлечения из Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. дозозависимо ин-гибируют высвобождение гистамина из тучных клеток и нуклеарный -фактор. Благодаря этому подавляется атопическая аллергическая реакция [191].
Гексановый экстракт корней Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. в эксперименте на мозге мышей ингибировал моноаминоксидазу [195].
Сем. Juglandaceae (ореховые) в мировой флоре включает 12 родов и 89 видов [235]. В регионах Кавказа широко культивируются Juglans regia L. (родина Малая Азия, Средняя Азия, Иран, горные районы Балканов, Афганистан, Гималаи, Корея, Китай, Япония) и J. nigra L. (родина – Северная Америка) [123]; в европейской части России – J. cinerea L. (родина – восточные штаты США, Канада) [64]. Почвенно-климатические условия Северо-западного Кавказа считаются оптимальными для успешного разведения культур J. regia L. и J. nigra L. [55, 123]. В Самарской области ведутся интродукционные исследования J. mandshurica Maxim., J. cinerea L., J. cordiformis Maxim., J. nigra L., J. rupestris Englm. и J. regia L. [87, 88], в Калининградской – J. regia L. [122].
Сидячие, удлинённо-яйцевидные, с мелкозубчатым краем, верхушка заострённая, основание округлое, слегка нерав-нобокое, мелкоопушён-ные сверху, снизу по жилкам и на стержне листа, местами войлочные и железистые, длина 6-15 см, ширина 2-6 см Короткочерешковые, яйцевидные или эллиптические, цельнокрайние, основание, несколько неравнобокое, верхушка заострённая, голые, с пучками волосков в углах жилок с нижней стороны, длина 5-10 см, ширина 2,5-6 см Короткочерешковые, продолговато-яйцевидные, с неправильно мелкозубчатым краем, верхушка заострённая, основание округлое, неравнобокое, сначала опушённые, затем голые сверху и рассеянно-опушённые и железистые снизу, длина 6-10 см, ширина 2,5-3,5 см
Ложная костянка 4,5 см длиной и 2,5 см шириной, удлинённо-яйцевидная, постепенно заострённая к вершине 6 см длиной и 3 см шириной, густо-серовойлочная и клейкая от желёзок. Эндокарпий удлинённо-яйцевидный, заострённый наверху, чёрно-коричневый, с толстой скорлупой, имеющей 4 лакуны у основания двухгнёздный Ложная костянка 6-8 см в диаметре, шарообразная, яйцевидная, эллиптическая, тёмно-зелёная, снаружи кожистая. Эндокарпий круглый или яйцевидный, с 2 гладкими рёбрами, заострённый на вершине, с толстой скорлупой Ложная костянка 3-4 см в диаметре, Голые или мел-коопушённые, одиночные или понемногу вместе. Эн-докарпий у основания 4-гнёздный, круглый, яйцевидный или обратнояйце-видный, заострённый на вершине, с 2 зубчатыми, волнистыми рёбрами и остробороздчатый между ними
Железисто-опушённые, серые, позже красно- или пурпурно-бурые с чечевичками Гладкие, серо-оливковые, позже светло-серые с белыми чечевичками Железисто-опушённые серо- и оливково-зелёные с редкими чечевичками Рисунок 9 – Juglans cinerea L.
Химический состав ЛРС Juglans regia L., J. cinerea L. и J. nigra L. изучен достаточно хорошо и представлен различными группами БАВ. Нафтохиноны (юглон и его производные) обнаружены во всех частях видов рода Juglans (таблица 6).
В народной медицине Греции, Средней Азии, Кавказа, Ирана и Южной Америки отвары и настои листьев и околоплодника Juglans regia L. используют как противоглистное, ранозаживляющее, бактерицидное и противовоспалительное средство для лечения ран, гнойных заболеваний кожи, обморожений, туберкулёза кожи, гортани, туберкулёзном лимфадените. Отвар листьев наружно применяют при лишаях, гнойных сыпях, нарывах и фурункулах, экземах, себорее, выпадении волос, угревой сыпи, псориазе, дерматите [97]. На Украине листья Juglans regia L. используются как гипотензивное, спазмолитическое, противовоспалительное, бактерицидное, кора – при язвах, опухолях, плоды -как антигельминтное средство [126].
В народной медицине Дагестана и Адыгеи листья и плоды Juglans regia L. применяются при гипертонической болезни, хроническом гастрите [95, 97]. Кора[6, 95, 97] Алкалоиды (берберин), дубильные вещества, нафтохиноны (юглон, региолон), стероиды (ситостерин), тритерпены (бетулин, бетулиновая кислота) Нафтохиноны (юглон) Алкалоиды (югландин), нафто-хиноны (юглон), тритерпены
Листья [4, 6, 15, 41, 89, 93, 95, 97, 151, 184, 228] Алкалоиды (югландин), аминокислоты (аспарагиновая кислота, треонин, серии, глютаминовая кислота, пролин, цистин, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, лизин, аргинин, триптофан), витамины (С, РР, Р-каротин, лютеин, виолаксантин, неоксантин, флавок-санитин, криптоксантин, инозит, пантотеновая кислота, биотин), дубильные вещества, кумарины, макро- и микроэлементы, нафтохиноны (юглон, а-гидроюглона глюкозид, а-гидроюглон, Р-гидроюглон), органические кислоты, сапонины, полисахариды, фенолкарбоновые кислоты (кофейная, галловая, эллаговая, п-кумаровая, салициловая, п-гироксибензойная, ванилиновая, гентизиновая, протокатеховая, хлорогеновая, п-гидроксифенилмолочная, феруловая, синаповая), флавоноиды (югланин, авикулярин, гиперозид, кверцетина 3-арабинозид, кверцетин, кемпферола 3-арабинозид, кемпферол, антоцианы -производные цианидина), эфирное масло (кариофиллен, лонгифолен, а-пинен, а-терпинеол, гумулен, у-кадинен, 8-кадинен, капроновый альдегид, А3- карен, Р-пинен, хамазулен, а-фелландрен, камфен, борнилацетат) Витамины (С), макро- и микроэлементы, нафтохиноны (юглон), органические кислоты, флавоноиды, эфирное масло (у-муролен, а-муролен, 5-кадинен) Алкалоиды (югландин), витамины (С, каротиноиды, Bi, Вб, Р, Е, РР), дубильные вещества, макро- и микроэлементы, нафтохиноны (юглон), органические кислоты, флавоноиды (кверцитрин, астрагалин, 3,5,7,3 ,4 -пента-оксифлавон-3-P-L-рамнофуранозид, 3,5,7,4 -тетраокси-флавон-3 -a-D-глюко-пиранозид, 7,3 ,4 ,5 -гексаокси-флавон-3 -a-L-рамнопиранозид, мирицитрин), эфирное масло (Р-кариофиллен, гермакрен D, а-пинен)
Плоды [5, 6, 41,65, 95, 97, 118, 124, 182, 228] Белок, витамины (околоплодник С, Вь В2, РР, Р-каротин), дубильные вещества, жирное масло, макро- и микроэлементы, нафтохиноны (а-гидроюглон, Р-гидроюглон, 5 - глюкозид гидроюглона, 1,4-нафтохинон, юглон, менадион, 2,3-дигидро-5-гидрокси-1,4-нафтохинон, 2,3-дигидро-5-гидрокси-2-метил-1,4-нафтохинон, плюмбагин, 5-гидрокси-3-метил-1,4-нафтохинон, 2,3-диметлил-5-гидрокси-1,4-нафтохинон), органические кислоты, стероиды (ситостерин 0,43 %, Р-ситостерол и его глюкозид), полисахариды, фенолкарбоновые кислоты (ванилиновая, галловая, гентизиновая, п-гидроксибензойная, 2,3-диметлил-5-гидрокси-1,4-нафтохинон, п-гидроксифенилмолочная, п-кумаровая, протокатеховая, салициловая, синаповая, сиреневая, феруловая, хлорогеновая, эллаговая), флавоноиды (катехины, проантоцианидины) Макро- и микроэлементы, нафтохиноны (юглон), органические кислоты, флаво-ноиды Витамины (околоплодник С, каротиноиды), дубильные вещества, жирное масло, кумари-ны, макро- и микроэлементы, нафтохиноны (юглон, гидроюг-лон), органические кислоты, фенолкарбоновые кислоты (галловая, эллаговая), флавоноиды (лютеолин)
Статистическая обработка результатов количественного определения биологически активных веществ
В соответствии с требованиями ГФ XI, ГФ XII и ГФ XIII в ЛРС определяли влажность (ОФС.1.5.3.0007.15 «Определение влажности лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов»), золу, золу нерастворимую в хлористоводородной кислоте (ОФС.1.5.3.0005.15 «Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте»), измельчённость, посторонние примеси (ОФС.1.5.3.0004.15 «Определение подлинности, измельчённости и содержания примесей в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах»), микробиологическую чистоту (ОФС.1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота»), содержание тяжелых металлов и мышьяка (ОФС.1.5.3.0009.15. «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах») [17, 18, 19, 20]. 2.2.2 Выделение фракций из лекарственного растительного сырья для изучения состава биологически активных веществ
Для изучения состава БАВ исследуемого ЛРС проводили последовательное фракционирование, а затем качественный и количественный анализ полученных извлечений. Выделение отдельных фракций необходимо для удаления мешающих веществ, уменьшения их влияния на анализ, получения более чистых проб. Для этого использованы растворители с постепенным повышением полярности на каждом этапе, извлечение отделяли от ЛРС, а шрот просушивали. Общая схема представлена на рисунке 14. Полученные фракции после полного удаления растворителя взвешивали и проводили их дальнейший анализ химическими, хроматографическими и спектроскопическими методами.
В исследованиях использовали качественные реакции на следующие группы БАВ: - нафтохиноны (реакция окрашивания с раствором натрия гидроксида 5 %); - алкалоиды (реакции осаждения с реактивом Драгендорфа, с реактивом Вагнера-Бушарда); - сапонины (реакция пенообразования); - флавоноиды (цианидиновая проба); - полисахариды (реакция осаждения со спиртом этиловым 95 %); - дубильные вещества (реакция окрашивания с сульфатом железа (III)-аммония).
Для идентификации и количественного определения БАВ в ЛРС и ЛРП использовали ТСХ (ОФС.1.2.1.2.0003.15 «Тонкослойная хроматография») [18]. Подготовленные пробы и растворы СО наносили на хроматографические пластинки поршневыми микрошприцами c тупым концом иглы двумя способами: в виде пятен (2-5 мм диаметром) с промежутками между ними не менее 10 мм и в виде полос длиной от 10 до 20 мм с промежутком между ними не менее 10 мм. Подсушивание нанесенных проб осуществляли на воздухе или столе с электроподогревом.
Хроматографические камеры предварительно насыщали парами смесей растворителей в течение 20-30 мин, помещали в них пластинки с пробами и элюировали восходящим способом. Когда фронт подвижной фазы проходил расстояние 10 см, пластинку вынимали из камеры, высушивали на воздухе до удаления следов растворителей. Пригодность подвижных фаз оценивали в со 59 ответствии с требованиями ГФ XIII (ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Хроматография») [18]. Детектирование зон адсорбции осуществляли следующими способами: – наблюдением под дневным светом; – наблюдением под УФ-светом; – опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов; – выдерживанием в парах обнаруживающего реагента.
Интерпретацию результатов проводили, используя фактор удерживания (Rf), расчёт которого для каждой зоны адсорбции осуществляли с помощью программы Sorbfil TLC Videodensitometer. Хроматограммы сканировали и данные полученного графического файла обрабатывали в программе. Каждой зоне адсорбции соответствует пик денситограммы. В отчёт выводилась сама денси-тограмма и таблица, в которой приводились значения Rf, площадь пиков (S), отношение площади каждого пика к сумме площадей всех пиков в треке (S %), высота пиков (H), отношение высоты каждого пика к сумме высот всех пиков в треке (%H). При нанесении на хроматограмму известного объёма извлечения и раствора СО известной концентрации рассчитывали содержание соединения в ЛРС [50]. Для идентификации и полуколичественного определения компонентов эфирного масла использовали газовую хроматографию с масс спектроскопической детекцией (ГХ-МС) (ОФС.1.2.1.2.0004.15 «Газовая хроматография») [18]. Из ЛРС эфирное масло отгоняли с водяным паром и экстрагировали из отгона (с промыванием холодильника) диэтиловым эфиром. Эфирные извлечения упаривали до маслянистого остатка под вакуумом при температуре не выше 35 C, после чего остаток растворяли в гексане. Компонентный состав определяли методом хромато-масс-спектометрии на приборе Shimadzu GCMS-QP2010plus на колонке Supelco SLBTM-5ms (30 m 0,25 mm 0,25 m) в режиме «split». Температуру колонки поднимали от 60 C (выдержка 4 мин) до 150 C со скоростью 10 C/мин, далее до 250 C со скоростью 5 C/мин. Температура инжектора, интерфейса и детектора были 250 C. В качестве газаносителя использовали гелий чистотой 99,9999 % со скоростью потока 1 мл/мин. Ионизация электронным ударом с энергией электронов 70 эВ. Ток эмиссии катода 120 мкА, диапазон регистрируемых ионов с m/z 45-600, скорость сканирования – 2500 m/z. Идентификацию компонентов проводили с использованием библиотек масс-спектров NIST08 и FFNSC. 1 мкл разведенной пробы вводили в прибор с делением потока 1 : 40.
ВЭЖХ-анализ (ОФС.1.2.1.2.0005.15 «Высокоэффективная жидкостная хроматография» [18]) проводили на хроматографе Summit фирмы Dionex (США), УФ-детектор UVD-170S, детекция при длинах волн 220, 254, 280 и 430 нм, колонка Prodigy фирмы Phenomenex (5 мкм, ODS 3, 100 ) размером 250 4,6 мм. Элюирование осуществлялось в градиентном режиме в подвижных фазах: А – 0,1 % водный раствор трифторуксусной кислоты, В – ацетонит-рил. Образцы перед анализом центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об./мин.
Зависимость фармакологической активности нафтохинонов от структуры соединения
Для экспресс-определения содержания нафтохинонов в корнях синяка русского разработана методика хромато-денситометрического анализа с использованием СО шиконина.
Расчёты проводили с помощью градуировочного графика, для построения которого использовали раствор СО шиконина 0,05 % в спирте этиловом 95 %. На линию старта хроматографической пластинки марки TCL Silica gel 60 F254 Merck KgaA размером 15 15 см наносили микрошприцем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 мкл раствора шиконина. Пластинку с нанесенными пробами подсушивали и хрома-тографировали в камере, предварительно насыщенной парами смеси петролей-ный эфир – диэтиловый эфир (10 : 3,5) по методике, описанной в главе 2.
Хроматограмму сканировали, данные полученных графических файлов подвергали обработке программой Sorbfil TLC Videodensitometer, получая в результате площади пиков (S), отношение площади каждого пика к сумме площадей всех пиков в треке (S %), высоты пиков (H), отношение высоты каждого пика к сумме высот всех пиков (%H) в треке (рисунок 30). Используя значения площади пиков, строили градуировочный график (рисунок 31).
Градуировочный график – зависимость площади пика от количества шиконина, нанесенного на хроматографическую пластинку
Анализируя полученные данные, можно заключить, что в диапазоне 0,5-3,5 мкг наблюдается линейная зависимость между площадью пика и количеством шиконина.
Для определения содержания нафтохинонов в корнях Echium russicum на линию старта хроматографической пластинки наносили микрошприцем 0,02 мл извлечения, полученного в следующих условиях: около 2,0 г (точная навеска) ЛРС, измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл спирта этилового 95 %, присоединяли обратный холодильник, нагревали на водяной бане при 60 C в течение 15 минут, затем охлаждали и фильтровали извлечение в мерную колбу вместимостью 25 мл через бумажный фильтр «красная лента». Фильтр с частицами ЛРС возвращали в колбу со шлифом, прибавляли 10 мл спирта этилового 95 % и операцию повторяли. Извлечение доводили до метки спиртом этиловым 95 %, перемешивали. Хроматогра 96 фирование вели в условиях, использованных для построения градуировочного графика. Хроматограммы сканировали и данные полученных графических файлов подвергали программной обработке Sorbfil TLC Videodensitometer (рисунок 32).
Количественное содержание суммы нафтохинонов в корнях Echium russi-cum в пересчёте на шиконин и абсолютно сухое ЛРС рассчитывали, используя сумму площадей пиков и градуировочный график, по формуле (1): (1) где S – площадь пика; а – навеска ЛРС, г; V – объём пробы, нанесённой на пластинку, мл; W – влажность ЛРС, %. Полученные при этом результаты представлены в таблице 19. Таблица 19 – Содержание суммы нафтохинонов в пересчёте на шиконин в корнях Echium russicum Хi, % /5 X s2 s Р T(PJ) Лх s 2,34; 2,18; 2,23; 2,21; 2,14; 2,11 2,20 0,006 0,08 95 2,57 0,08 3,85
Как следует из полученных экспериментальных данных, денситометриче-ское определение шиконина возможно использовать для экспресс-анализа ЛРС.
Ранее нами были подобраны условия получения извлечения из корней Echium russicum для спектрофотометрического анализа суммы нафтохинонов в пересчёте на шиконин в ЛРС [32].
Спектр хлороформного извлечения из корней Echium russicum имеет четыре чётких максимума поглощения при 275 ± 2 нм, 493 ± 2 нм, 525 ± 2 нм, 568 ± 2 нм, совпадающих с максимумами поглощения СО шиконина, при этом линейная зависимость величины оптической плотности от концентрации наблюдается в длинноволновой области спектра (рисунок 33). Методика: около 0,2 г (точная навеска) ЛРС, измельчённого до частиц размером 1 мм, помещали в коническую колбу, добавляли 10 мл хлороформа, присоединяли обратный холодильник, нагревали на водяной бане при температуре 60 C 15 мин. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр «красная лента» в мерную колбу объёмом 25 мл. Фильтр возвращали в колбу с ЛРС и операцию повторяли дважды. Извлечение в мерной колбе доводили до метки тем же растворителем и перемешивали. 5 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили хлороформом до метки, перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 525 нм на спектрофотометре СФ-2000 относительно хлороформа в кювете толщиной 1 см. Концентрацию шиконина определяли с использованием удельного показателя поглощения. Содержание нафтохинонов в пересчёте на шиконин в абсолютно сухом ЛРС в % (Х) вычисляли по формуле (2): , (2) где А – оптическая плотность; – удельный показатель поглощения шиконина; а – навеска ЛРС; W – влажность ЛРС. Результаты эксперимента представлены в таблице 20.
Спектрофотометрическое определение суммы нафтохинонов в пересчёте на шиконин
На поперечном срезе корни видов рода Onosma круглой формы, имеют беспучковую структуру, характерную для вторичного строения. Покровная ткань – перидерма. Пробка отслаивающаяся, состоит из 2-10 рядов клеток. Клетки паренхимы крупные, овальные или прямоугольные, бесцветные. Клетки расположены несколькими слоями, между ними имеются небольшие межклетники. Клетки флоэмы четырёх-пяти-угольные, мелкие, плотно расположенные. Проводящая система беспучкового типа, флоэма представлена мелкими ситовидными элементами, ксилема – сосудами и трахеидами. Сосуды сосредоточены ближе к центральной зоне поперечного среза.
Качественный анализ ЛРС сем. Boraginaceae на наличие нафтохинонов проводили по разработанной нами методике: около 1,0 г (точная навеска) измельчённого до размера частиц 2 мм ЛРС помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 15 мл хлороформа, присоединяли обратный холодильник и нагревали 15 минут на водяной бане при температуре 60 C, затем охлаждали, извлечение фильтровали через бумажный фильтр «красная лента» в мерную колбу вместимостью 50 мл. Фильтр с частицами ЛРС возвращали в колбу со шлифом, прибавляли 15 мл хлороформа и операцию повторяли ещё дважды. Извлечение в мерной колбе доводили хлороформом до метки и перемешивали (испытуемый раствор).
В делительную воронку объёмом 125 мл помещали 5 мл испытуемого раствора, имеющего красный цвет различной степени интенсивности, прибавляли 10 мл раствора гидроксида натрия 5 %, встряхивали в течение 5 минут, наблюдали обесцвечивание хлороформного слоя, и окрашивание водного в синий цвет, что свидетельствовало о наличии шиконина и его эфиров.
Нафтохиноны способны возгоняться при нагревании измельчённого ЛРС, поэтому для экспресс-анализа ЛРС использовали реакцию микросублимации, проводимую по следующей методике: около 0,2 г ЛРС, измельчённого до размера частиц 2 мм, помещали в фарфоровый тигель и нагревали на электрической плитке. Сублимат конденсировался на стенках тигля в виде мелких капель красного цвета (шиконин). При перенесении капель сублимата в пробирку и добавлении раствора натрия гидроксида 5 % образовывалась натриевая соль, имеющая ярко-синюю окраску.
Кроме скрининга проводили качественный анализ нафтохинонов в ЛРС методом ТСХ. Наносили микрошприцем по 0,02 мл хлороформного извлечения и раствора СО шиконина на линию старта хроматографической пластинки, подсушивали на воздухе, помещали в камеру, предварительно насыщенную парами смеси 1 (петролейный эфир – диэтиловый эфир 10 : 3,5) или смеси 2 (гексан – ацетон 20 : 1). Шиконин и его эфиры идентифицировали в виде зоны адсорбции розового, красного или красно-фиолетового цвета, меняющей окраску на синюю при обработке парами аммиака.
Как следует из данных, представленных в таблице, наиболее высокое содержание нафтохинонов в пересчёте на шиконин наблюдается в корнях E. russicum. Другие виды рода Echium в этом случае можно рассматривать как примеси, что нашло отражение в инструкции по сбору и сушке корней синяка русского (приложение 6).
Перед фитохимическим исследованием травы оносмы армянской, оносмы кавказской и оносмы шелковистой ставилось две задачи: проанализировать нафтохиноны и сравнить химический состав видов, чтобы определить дальнейшее использование изучаемых видов как самостоятельных источников ЛРС, либо допустить заготовку травы оносмы от нескольких видов.
Так как трава видов рода Onosma является малоизученным объектом с точки зрения химического состава, то для проведения скрининга последовательно выделяли фракции по схеме, описанной в главе 2 (рисунок 14) с использованием хлороформа (Х), этанола 95 % (Э-95), этанола 70 % (Э-70), этанола 40 % (Э 40) и воды (В). Полученные фракции взвешивали и рассчитывали процентное содержание от массы ЛРС (рисунок 51).
Как следует из данных, представленных на рисунке 51, при последовательном выделении фракций БАВ из ЛРС различия в их распределении между видами рода оносма небольшие.
Для идентификации основных групп БАВ получали раствор каждой фракции по следующей методике: около 0,1 г фракции помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли соответствующий растворитель, растворяли при перемешивании, доводили до метки и перемешивали. Полученные растворы анализировали с помощью: - качественных реакций, перечисленных в главе 2, - ТСХ в смесях растворителей петролейный эфир - диэтиловый эфир (10 : 3,5), хлороформ - метанол (8 : 2), хлороформ - муравьиная кислота - вода (6 : 3 : 1), этилацетат - муравьиная кислота - вода (10 : 2 : 3), - спектрофотометрии (максимумы поглощения обнаружены только в извлечениях, полученных хлороформом, спиртом 95 % и спиртом 70 %).
Как следует из данных, представленных в таблице 39, нафтохиноны присутствуют в следовых количествах, что не позволяет использовать эту группу БАВ, как для подтверждения подлинности, так и для оценки качества ЛРС. Перспективным являются исследование фенольных соединений.
Изучение состава фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ. Из образцов травы видов рода Onosma получали извлечения по следующей методике: 2,0 г измельченного до размера частиц 2 мм ЛРС помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл спирта этилового 70 % и выдерживали при периодическом перемешивании в течение 2 суток при комнатной температуре. Затем извлечение фильтровали через бумажный фильтр «красная лента» (испытуемый раствор). Параллельно готовили серию растворов СО в спирте этиловом 70 %.