Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современный химико-токсикологический анализ оланзапина 13
1.1. Общая характеристика оланзапина как атипичного нейролептика.. 13
1.1.1. Применение оланзапина в медицинской практике 13
1.1.2. Фармакокинетика оланзапина 16
1.1.3. Метаболизм оланзапина 17
1.1.4. Отравления оланзапином 18
1.1.5. Возможные комбинации оланзапина с лекарственными препаратами различных фармакологических групп 19
1.2. Анализ оланзапина в биологических объектах 20
1.2.1. Идентификация оланзапина 20
1.2.2. Исследование оланзапина в биологических объектах 21 Заключение по главе 1 24
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2 Материалы и методики исследований 26
2.1. Дизайн исследования 26
2.2. Материалы исследований 27
2.3. Методики исследований и расчеты 30
ГЛАВА 3 Разработка методик обнаружения и количественного определения оланзапина 33
3.1. Разработка методики обнаружения оланзапина в извлечениях с помощью ГХ/МС 33
3.2. Разработка методик обнаружения оланзапина с помощью тонкослойной хроматографии 37
3.3. Разработка спектрофотометрической методики анализа оланзапина и ее валидация, 41
3.4. Разработка методики анализа оланзапина с использованием ВЭЖХ и ее валидация 44 Заключение по главе 3 49
ГЛАВА 4 Разработка оптимальной методики изолирования оланзапина из модельных смесей плазмы, мочи и слюны 51
4.1. Изучение влияния pH среды, природы органического растворителя, времени и кратности экстракции на изолирование оланзапина из растворов 51
4.2. Разработка методики изолирования оланзапина из модельных смесей плазмы 56
4.3. Разработка методики изолирования оланзапина из модельных смесей мочи 60
4.4. Разработка методики изолирования оланзапина из модельных смесей слюны 63
Заключение по главе 4 67
ГЛАВА 5 Разработка оптимальной методики изолирования оланзапина из модельных проб печени и почек 68
5.1. Сравнительная оценка использования классических методов для изолирования оланзапина из модельных проб внутренних органов 68
5.2. Разработка оптимальной методики изолирования оланзапина из модельных проб внутренних органов 72
Заключение по главе 5 81
ГЛАВА 6 Изучение сохраняемости оланзапина в модельных пробах внутренних органов и распределения после создания модели острого отравления 83
6.1. Изучение сохраняемости оланзапина в модельных пробах внутренних органов 83
6.2. Изучение распределения оланзапина после создания острого отравления лабораторных животных 84
6.3. Определение оланзапина в моче и крови лабораторных животных 87
6.4. Схема химико-токсикологического анализа 89
Заключение по главе 6 92
Заключение 93
Список сокращений 96
Список литературы
- Возможные комбинации оланзапина с лекарственными препаратами различных фармакологических групп
- Материалы исследований
- Разработка методик обнаружения оланзапина с помощью тонкослойной хроматографии
- Разработка методики изолирования оланзапина из модельных смесей плазмы
Введение к работе
Актуальность темы. Шизофрения – группа психических расстройств, которая происходит в результате распада процессов мышления и эмоциональных реакций. Шизофрения наиболее опасна тем, что среди больных наблюдается очень высокий процент нетрудоспособных людей, а также совершением преступлений в связи с нарушением психических действий. Основным и единственным методом лечения шизофрении в амбулаторных условиях является прием антипсихотических препаратов (нейролептиков).
Второе поколение антипсихотических препаратов превзошло первое поколение агентов в качестве первой линии лечения шизофрении. Среди них олан-запин, обладающий уникальным нейрофармакологическим профилем, является одним из наиболее широко прописываемых антипсихотических препаратов для лечения шизофрении и других серьезных психических расстройств. Известны случаи суицидального применения и летальные исходы при случайной передозировке препаратом.
Исследование, проведенное институтом безопасной лечебной практики и научным подразделением медицинского факультета Уэйк-Форестского университета, выявило, что среди 13 препаратов в списке лекарственных средств с самым высоким процентом смертности и побочных эффектов, препарат «Zyprexa» (действующее вещество оланзапин) американской компании «Eli Lilly and Co» занимает первую строчку.
В ходе 8-летнего исследования было установлено, что антипсихотический препарат «Zyprexa» явился причиной 1005 смертельных исходов и 4110 случаев нежелательных побочных реакций.
Случаи интоксикации, связанные с оланзапином, будут день за днем увеличиваться потому, что оланзапин становится наиболее часто прописываемым нейролептическим лекарственным средством, в связи с этим увеличится и частота неумышленных приемов оланзапина детьми, в семьях которых неправильно хранят лекарственные средства. Передозировка приводит к нежелательным симптомам, вплоть до летального исхода у детей раннего возраста.
Для выяснения причины смерти лиц, принимавших оланзапин, решающее значение приобретают результаты судебно-химического исследования. При этом патологоанатомическая картина отравления не является характерной. Несмотря на токсикологическое значение оланзапина, методы его выделения и обнаружения в биологических объектах с использованием современных физико-химических методов разработаны недостаточно.
Таким образом, разработка методик изолирования, обнаружения и количественного определения оланзапина в биологических объектах для целей судеб-но-химической (химико-токсикологической) практики и клинического лабораторного анализа с использование современных физико-химических методов анализа, является актуальным и имеет важное научно-практическое значение.
Степень разработанности темы исследования. В отечественной и зарубежной литературе имеются разрозненные работы по исследованию оланзапина в области судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Анализ отечественной и зарубежной литературы свидетельствует о том, что не были проведены систематические исследования по разработке методик изолирования, идентификации и количественного определения оланзапина в биологических объектах. Кроме того, полученные данные невозможно сравнивать из-за различного диапазона значения концентраций оланзапина даже в одном и том же биологическом объекте. Все указанное позволило сформулировать цели и задачи настоящей работы.
В связи с вышеизложенным, целью исследования явилась разработка методик химико-токсикологического анализа оланзапина при направленном и ненаправленном анализах.
Поставленная цель определила следующие задачи исследования:
1. Разработать методики обнаружения и количественного определения
оланзапина с использованием современных физико-химических методов.
2. Изучить влияние некоторых факторов экстракции (природа органиче
ского растворителя, pH среды, время и кратность экстракции) на извлечение
оланзапина из растворов.
3. Разработать оптимальную методику изолирования оланзапина из мо
дельных смесей плазмы, мочи и слюны, а также методики его обнаружения и
количественного определения в извлечениях.
4. Определить степень извлечения оланзапина из модельных проб печени и
почек при использовании общих и частных методов: Стаса-Отто, А.А. Василье
вой, В.Ф. Крамаренко. Предложить оптимальную методику изолирования олан-
запина из модельных проб печени и почек, а также методики его обнаружения
и количественного определения в извлечениях.
5.Изучить сохраняемость оланзапина в гнилостно разложившихся модельных пробах печени и почек. Провести изучение распределения оланзапина в органах и биологических жидкостях экспериментальных животных после создания модели острого отравления.
6. Предложить схему химико-токсикологического анализа оланзапина при ненаправленном и направленном анализе.
Научная новизна. Найдены оптимальные условия для обнаружения олан-
запина и предложена методика для его экспресс-анализа методом ГХ/МС.
Предложены хроматографические системы для проведения общего и частного
ТСХ-скрининга оланзапина, а также для проведения его очистки в извлечениях
от соэкстрактивных веществ. Разработана методика обнаружения и количест
венного определения оланзапина в извлечениях методом УФ-
спектрофотометрии и ВЭЖХ. Осуществлена рекомендация по использованию
физико-химических методов анализа оланзапина для его обнаружения при на
правленном и ненаправленном анализе, а также для дальнейшего изучения оп
тимальных условий экстракции из растворов.
Обоснована необходимость разработки оптимальной методики изолирования оланзапина из внутренних органов. Предложена методика изолирования оланзапина из внутренних органов с помощью извлекателя спирта 40% при pH=1. Разработаны методики количественного определения оланзапина в извлечении из печени и почек, которые валидированы по показателям: специфичность, прецизионность, правильность на уровне intra-day и inter-day.
Предложены методики изолирования оланзапина из модельных смесей плазмы, мочи и слюны с помощью жидкость-жидкостной экстракции с использованием результатов изучения влияния некоторых факторов на экстракцию оланзапина. Методики количественного определения оланзапина в извлечениях из плазмы, мочи и слюны валидированы по показателям: специфичность, прецизионность, правильность на уровне intra-day и inter-day.
Впервые изучена сохраняемость оланзапина в модельных пробах печени и почек. Разработанные методики изолирования, обнаружения и количественного определения оланзапина апробированы на лабораторных животных. На основании создания модели острого отравления на белых мышах осуществлена рекомендация по выбору внутренних органов для судебно-химического исследования оланзапина.
Теоретическая и практическая значимость работы заключается в обобщении полученных данных о химико-токсикологическом анализе атипичного нейролептика – оланзапина. Впервые теоретически обоснованы оптимальные методики изолирования оланзапина из внутренних органов и биологических жидкостей, основываясь на его физико-химических свойствах. Предложены методики обнаружения оланзапина в извлечениях, а также методики его количественного определения, которые валидированы.
Методика изолирования, обнаружения и количественного определения оланзапина во внутренних органах включена в методические рекомендации «Методика судебно-химического анализа рисперидона, сертиндола, оланзапина и арипипразола во внутренних органах», которые утверждены Федеральным государственным бюджетным учреждением «Российский центр судебно - медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации и рекомендованы для работы в судебно-химических лабораториях Российской Федерации. Указанные методики апробированы в условиях лаборатории ГБУЗ СК «Бюро судебно-медицинской экспертизы» г. Ставрополя (акт апробации от 19.10.2015), а также внедрены в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Федерального государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего образования «Северо-Осетинский государственный университет имени Коста Левановича Хетагурова» (акт внедрения от 23.06 2016 г.), в учебную работу кафедры фармации государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации (акт внедрения от 22.06.2016 г.) и в учебную и научную работу кафедры фармацевтической и токсикологической химии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (акт внедрения от 25.06.2016 г.).
Методология и методы исследования. Теоретическую основу исследования составили труды отечественных и зарубежных ученых, исследующих лечение психических заболеваний атипичными нейролептиками, а также публикации в области фармакологических, токсикологических и аналитических исследований оланзапина; международная и российская нормативная документация по метрологии и валидации методик анализа. Методология заключалась в разработке методик обнаружения и количественного определения оланзапина с использованием современных физико-химических методов, изучении оптимальных условий изолирования оланзапина из модельных проб внутренних органов и модельных смесей биологических жидкостей на основе его физико-химических свойств, апробации разработанных методик на лабораторных животных, а также в обобщениях, заключениях и рекомендациях по практическому применению методик изолирования, обнаружения и количественного определения оланзапина. При выполнении работы было проведено комплексное физико-химическое и токсикологическое исследование оланзапина в извлечениях из биологических объектов.
Положения, выносимые на защиту. На защиту диссертационной работы
выносятся следующие результаты исследования:
- обнаружение и количественное определение оланзапина с помощью со
временных физико-химических методов (ГХ/МС, ТСХ, УФ-
спектрофотометрии, ВЭЖХ);
- разработка оптимальных условий химико-токсикологического анализа
оланзапина в биологических жидкостях;
необходимость разработки оптимальной методики изолирования оланза-пина из модельных проб внутренних органов, выбор оптимальных условий су-дебно-химического анализа оланзапина;
результаты изучения сохраняемости оланзапина в тканях трупной печени и почек при разных температурах и сроках хранения;
результаты изучения распределения оланзапина в органах и биологических жидкостях экспериментальных животных после создания модели острого отравления;
- разработка схемы химико-токсикологического анализа оланзапина при
направленном и ненаправленном анализе.
Степень достоверности результатов. Достоверность результатов подтверждена статистической обработкой полученных результатов. Научные положения и выводы основываются на обширном экспериментальном материале и логически вытекают из результатов исследования. Основные результаты исследований рассмотрены и обсуждены на IV научно-практической конференции с международным участием «Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового поколения» (Новосибирск, 2014 г.), I Международной научно-практической конференции «Теоретические и практические аспекты развития научной мысли: Медицинские науки, Фармацевтические науки, Ветеринарные науки, Биологические науки, Химические науки» (Москва, 2014 г.), IV Всероссийской научно-практической конференции «Беликовские чтения» (Пятигорск, 2015), ежегодной научно-практической конференции «Синтез и анализ лекарственных средств синтетического и растительного происхождения» (Пятигорск, 2016 г.), II Международной научно-практической конференции «Современная химико-токсикологическая экспертиза» (Москва, 2015 г.).
Личный вклад автора. Личное участие автора выразилось в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки цели и задач работы, реализации эксперимента, апробации проведенных испытаний, интерпретации полученных результатов до их обобщения, систематизации и формулировке общих выводов. Автором проведен комплекс исследований по разработке методик изолирования, идентификации, количественного определения оланза-пина в биологических объектах.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, 3 из них - в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Ми-нобрнауки России.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 113 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (6 глав), общих выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 24 таблицами. Список литературы включает 150 источника, из них 65 на иностранных языках. В приложение включены акты апробации и внедрения.
Возможные комбинации оланзапина с лекарственными препаратами различных фармакологических групп
Оланзапин относится к группе нейролептических средств [4, 26, 44, 67, 71], применяемых для лечения различных психических заболеваний и состояний, таких как, расстройства центральной нервной системы, шизофрения, галлюцинации, острый маниакальный синдром, депрессия и им подобные [30, 34, 42, 44, 60, 87].
Появление атипичных антипсихотических средств позволили впервые разработать принципы и методы рациональной фармакотерапии шизофрении и других форм психической патологии, и привели к радикальным изменениям в лечении и содержании больных шизофренией [18]. Лечение большинства клинических форм оказалось возможным во внебольничных условиях, а содержание в психиатрических стационарах приблизилось к общемедицинским нормам. По предварительным данным некоторых ученых, атипичные нейролептики могут полностью вытеснить нейролептики первого поколения [30, 72].
Ключевой особенностью атипичных нейролептиков является их способность одновременно блокировать дофаминовые рецепторы второго типа (D2-рецепторы) и серотониновые рецепторы типа 2А(5-HT2A-рецепторы), что определяет отсутствие или слабую выраженность экстрапирамидных побочных эффектов, а также отсутствие усиления секреции пролактина при их применении [39, 56, 91, 139]. Все препараты этой группы обладают выраженными адреноблокирую-щими и антигистаминными свойствами, что определяет наличие у них седативного и гипотензивного эффектов. Оланзапин достаточно сильно блокирует также мускариновые рецепторы, что и приводят к развитию холинолити-ческих побочных эффектов [40, 132].
По клинико-нейрохимической классификации современных антипсихотических препаратов Мосолова С.Н. [51] оланзапин относится к 5 группе, которую составляют поливалентные атипичные нейролептики трицикличе-ской дибензодиазепиновой или близкой к ней структуры. Они недифференцированно блокируют большинство нейрорецепторов [47]. Однако 5-HT2А-рецепторы блокируются сильнее, чем D2- и D4- рецепторы, особенно расположенные в нигростриальной области. Это определяет фактическое отсутствие или слабое экстрапирамидное действие и отсутствие связанных с усилением выработки пролактина нейроэндокринных побочных явлений при отчетливом антипсихотическом эффекте и способности уменьшать выраженность негативной симптоматики [91, 139]. Кроме того, все препараты этой группы обладают выраженными адренолитическими и антигистаминными свойствами, что определяет наличие у них седативного и гипотензивного эффектов [67].
Оланзапин используется для лечения шизофрении с 1996 года. Хорошо действует на негативную симптоматику. Применяется для лечения шизофрении, шизоаффективных, биполярных расстройств (для купирования маниакальной симптоматики), включая терапевтически резистентные случаи [4, 127, 145]. Эффективен для лечения резистентных больших депрессивных эпизодов. Оланзапин часто прописывают для лечения психических состояний детей [43, 97, 127].
Для оланзапина в первую очередь характерно наступление активирующего эффекта, что может проявляться в усилении психомоторного возбуждения, впрочем, не достигающего чрезмерного уровня [149]. При этом на первый план выступает доступность больных в плане своих психотических пе 15 реживаний и лишь в последующем снижается выраженность бредовых и галлюцинаторных феноменов [93]. Изучается применение оланзапина при рвоте, индуцированной противоопухолевой терапией. Оланзапин не относятся к противорвотным препаратам первого выбора, однако может оказаться полезными у отдельных пациентов [140].
К особенностям действия оланзапина следует отнести своеобразную гамму трофотропных эффектов, что проявляется в усилении аппетита, улучшении общего физического тонуса, нормализации цвета кожных покровов и повышении массы тела [83, 126, 150]. При этом имеется положительная корреляция между увеличением массы тела, по крайней мере, до 3 кг и наступлением терапевтического эффекта через 2, 4 и 6 недель терапии. Дальнейший прирост массы тела, однако, уже значения для наступления терапевтического эффекта не имеет, но может продолжаться [118]. Подобные трофотропные эффекты оланзапина обычно рассматриваются в качестве выраженных побочных эффектов. Тем не менее, наибольшего прироста массы тела следует ожидать у больных с изначально низким весом. Из этого следует, что препарат можно использовать для лечения больных с истощением при широкой группе синдромов «нервной анорексии» [133].
В рамках голландского исследовательского консорциума, исследования под руководством Саймона Эверса (Simon Evers) (Университет Гронингена, Нидерланды) стремились выявить основные механизмы метаболических эффектов оланзапина путем изучения здоровых взрослых добровольцев мужского пола. Исследование было мотивировано замечанием соавтора Anton Scheurink, которое описывается как «загадочная связь между диабетом и шизофренией» [102].
Их результаты подтвердили ранее полученные данные о том, что олан-запин вызывает прибавку веса за счет увеличения потребления калорий, но также показали, что оланзапин снижает температуру тела, а это в свою очередь способствует к снижению расхода энергии. Действительно, снижение температуры тела после лечения оланзапином может спровоцировать многие из известных побочных эффектов этого антипсихотического препарата. Новые данные авторов также показывают влияние оланзапина на изменение периферического метаболизма глюкозы, что может способствовать нарушению чувствительности к инсулину.
По словам ведущего автора Саймона Эверса, понижение температуры тела может объяснить некоторые побочные эффекты метаболизма оланзапи-на, в том числе повышенное потребление пищи, снижение энергетических затрат, седативный эффект, высокий уровень сахара в крови, увеличение массы тела и резистентность к инсулину [102, 124].
Материалы исследований
Для исследований готовились хлороформные растворы оланзапина концентрацией 0,1 мг/мл. На линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ наносили в точки по 20 мкл раствора с помощью микрошприца. Пластину с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 10 минут, затем помещали в камеру со смесью растворителей, предварительно насыщенную их парами в течение 30 минут и хроматографировали восходящим способом. После прохождения фронта растворителей 10 см пластину вынимали и сушили на воздухе в течение 15 мин. Проводили детекцию пятен с помощью УФ - света при длине волны 254 нм. Величину хроматографической подвижности Rf рассчитывали по формуле: Rf=—, (1) где Lx - расстояние от линии старта до центра пятна исследуемого вещества; Ls - расстояние от линии старта до линии финиша. Значения величин Rf явились средним результатом трех параллельных определений. Расчет степени извлечения оланзапина из водных растворов и биологических объектов (Х, %) проводили по формуле: Х= х 100, (2) где Сн - найденная концентрация в извлечении, мкг; Со - внесенная в биологический объект (водный раствор) концентрация вещества, мкг. Расчет правильности (R, %) проводили для каждого уровня концентраций по формуле: [среднее значение —известная концентрация 1 R = хЮО, (3) _ известная концентрация \ Изолирование изучаемых веществ методом Стаса-Отто. В колбу с широким горлом объемом 500 мл вносили навеску измельченного объекта массой 100 г, заливали спиртом 96% в количестве, необходимом для покрытия им биологического материала, подкисляли щавелевой кислоты спиртовым раствором 10% до рН=2-3. Содержимое колбы периодически перемешивали и через некоторое время проверяли рН смеси.
Колбу, закрытую пробкой, оставляли на сутки при температуре 25 С и периодически перемешивали ее содержимое. По истечении времени кислую спиртовую вытяжку сливали. Настаивание проводили аналогично еще 2 раза с новыми порциями спирта, подкисленного 10% щавелевой кислоты раствором до рН=2 - 3.
Спиртовые вытяжки объединяли, биологический материал промывали на фильтре спиртом 96%, а после объединяли его к полученным вытяжкам. Объединенные спиртовые вытяжки упаривали на водяной бане при 40 С. До прекращения выпадания белков в осадок по каплям прибавляли спирт 96%. Упаривание спиртовых фильтратов и осаждение белков спиртом проводили до прекращения осаждения примесей от прибавления спирта. Очищенный остаток растворяли в 25 мл воды.
Водный раствор последовательно экстрагировали хлороформом (10— 15 мл) при рН=2 и рН=10 после подщелачивания аммиака раствором 25%. Экстракцию хлороформом повторяли 3 раза [23, 74, 80]. Изолирование изучаемых веществ методом А.А. Васильевой. Навеску измельченного биологического объекта массой 100 г заливали водой очищенной (1:2), подкисляли насыщенным щавелевой кислотой раствором до рН=2-2,5 и настаивали 2 часа. После сливали вытяжку, а навеску биологического материала снова заливали водой, подкисленной щавелевой кислотой, и настаивали в течение 1 часа. Суммированные кисло-водные вытяжки фильтровали через двойной слой марли и центрифугировали. Жид 32 кость над осадком отделяли. Центрифугат экстрагировали последовательно 3 раза хлороформом (10-15 мл) при значениях рН=2, затем при рН=10 после подщелачивания 25% раствором аммиака [23, 74, 80].
Изолирование изучаемых веществ методом В.Ф. Крамаренко. Навеску измельченного объекта массой 100 г заливали серной кислоты раствором 0,02 М (рН=2,5) в количестве, необходимом для покрытия им биологического материала, и настаивали 2 часа, затем процеживали через марлю. Биологический материал еще дважды настаивали с новыми порциями серной кислоты раствора 0,02 М (рН=2,5) в течение часа. Объединенные кисло-водные вытяжки центрифугировали, отделяли от осадка, насыщали аммония сульфатом и вновь центрифугировали. Центрифугат (рН=2,5) экстрагировали диэтило-вым эфиром с целью очистки [23, 74].
Изучение распределения оланзапина на модели острого отравления. Экспериментальные исследования по изучению распределения токсических веществ при остром отравлении оланзапином проводили на белых мышах обоего пола массой 20,0-27,0 г. Уход за животными и их содержание осуществляли в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Вещество вводили в виде суспензии в желудок в токсической концентрации 450 мг/кг [138]. Мочу собирали в течение суток. По истечении 24 часов животных вводили в наркоз, декапитировали и отбирали внутренние органы и кровь. Контрольной группе животных вещество не вводили. Программное обеспечение исследований. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Excel.
Разработка методик обнаружения оланзапина с помощью тонкослойной хроматографии
Идентификация оланзапина согласно НД [54, 55] производителя рекомендует использовать в качестве подвижной фазы 50% смесь 50 мМ натрия фосфата одноосновного моногидрата, 42 мМ натрия додецилсульфата: 50% ацетонитрила. В литературе описана методика анализа оланзапина в смеси с другими лекарственными препаратами в плазме крови методом ВЭЖХ с использованием в качестве подвижной фазы ацетонитрила и фосфатного буферного раствора 50 Мм рН=3,8 [120]. Для того, чтобы улучшить селективность анализа, фосфатный буферный раствор нами был заменен на 0,1% раствор кислоты трифторуксусной. Приготовление раствора оланзапина для проведения анализа описано в разделе 2.2. Нами применялись следующие условия хроматографирования: хроматографическая колонка размером 275 мм, заполненная обращено-фазовым сорбентом «ProntoSil 120-5-C18 AQ»; подвижная фаза: элюент А - 0,1% раствор кислоты трифторуксусной, элюент Б – ацетонитрил; скорость потока – 100 мкл/мин; время измерения 0,18 с; температура термостата колонки – комнатная, объем пробы 2 мкл. Для выяснения характеристик удерживания оланзапина выполняли анализ в градиентном режиме от 10% элюента Б до 90% за 15 мин.
На хроматограмме (рисунок 3.8) обнаружен один основной пик со временем удерживания 7,15 мин, характерный для оланзапина.
Расчет количественного содержания оланзапина проводили по калибровочному графику. Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям: правильность, прецизионность, линейность и предел количественного определения. Для построения калибровочного графика готовили растворы оланзапи-на в спирте 96% в концентрациях 0,03 мкг/мл, 0,04 мкг/мл, 0,05 мкг/мл, 0,06 мкг/мл, 0,07 мкг/мл, 0,08 мкг/мл (приготовление растворов описано в разделе 2.2.). Измеряли площадь пика в описанных выше условиях. Нами был установлен предел количественного определения оланзапина с помощью метода «десяти сигма».
Было установлено, что с помощью разработанной методики можно определить 0,1 мкг/мл оланзапина. По полученным результатам был построен график зависимости площади пика от концентрации оланзапина в растворе (рисунок 3.9).
Как следует из представленных данных, линейная зависимость наблюдается в области концентраций оланзапина 0,03-0,08 мкг/мл.
Оценку правильности и прецизионности методики проводили с помощью анализа растворов оланзапина концентрацией 0,04 мкг/мл, 0,06 мкг/мл, 0,08 мкг/мл. Для каждого уровня концентрации рассчитывали стандартное отклонение (SD), относительное стандартное отклонение (RSD, %) и относительную погрешность (, %). Полученные данные представлены в таблице 3.5.
Полученные данные свидетельствуют о том, что относительное стандартное отклонение определения не превышает 2,29% при значении правильности 99,17%. Как свидетельствуют данные таблицы 3.5, значение правильности при исследовании трёх различных концентраций (0,4 мкг/мл, 0,6 мкг/мл и 0,8 мкг/мл) составляет 99,17%, что находится в пределе доверительного интервала результатов. Поэтому разработанная методика приемлема по критерию правильности. Прецизионность не превышает 1%.
Таким образом, разработанная методика с использованием ВЭЖХ является линейной, воспроизводимой, правильной и может быть использована при разработке схемы химико-токсикологического исследования оланзапина. Приказ Минздрава России от 12 мая 2010 года № 346н «Об утвержде нии порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» [58] рекомендует применять предварительные и подтверждающие инстру ментальные методы для судебно-химического анализа. В качестве предвари тельных методов используется ТСХ, в качестве подтверждающих – УФ спектрофотометрия, ИК-спектроскопия, ВЭЖХ, хромато-масс спектрометрия, ГЖХ. Поэтому разработанные нами методики ТСХ-скрининга использованы нами для обнаружения оланзапина в извлечениях при ненаправленном анализе, в качестве подтверждающих методов в работе использованы методы ВЭЖХ и ГХ/МС. Несмотря на то, что метод УФ 49 спектрофотометрии рекомендуется использовать для проведения судебно-химических исследований по приказу, нами он использован для определения степени извлечения оланзапина из водных растворов, так как предлагаемые нами методы ВЭЖХ и ГХ/МС для анализа оланзапина более специфичны и чувствительны. Для химико-токсикологических исследований оланзапина нами использован метод ГХ/МС согласно приказу Минздравсоцразвития РФ от 27.01.2006 №40 «Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ» [57].
Разработка методики изолирования оланзапина из модельных смесей плазмы
При извлечении токсического вещества из биологических объектов часто используются вода, подкисленная щавелевой кислотой, слабым раствором серной кислоты, спирт 96% [36]. Как показали проведенные исследования эти извлекатели подходят для изолирования оланзапина мало [34].
Оланзапин проявляет слабоосновные свойства. В кислой среде наблюдается протонирование атома азота в 1 и 4 положениях диазепинового кольца. В щелочной среде наблюдается лактим-лактамная таутомерия азометино-вого фрагмента.
При использовании воды в качестве извлекателя будут проявляться свойства оланзапина как кислоты, так и основания. Причем, в некоторых методиках добавляются апротонные растворители для увеличения шкалы кислотности. Одним из таких часто используемых растворителей является спирт, который будет повышать константу диссоциации оланзапина [34, 36]. Нами на первом этапе изолирования предложено использовать смесь воды и спирта. Во внутренних органах основными соэкстрактивными веществами, которые будут переходить в извлечение, являются белки и аминокислоты. Если в качестве извлекателя использовать воду, то диссоциация белков и аминокислот может происходить во всем диапазоне pH. При добавлении спирта к воде при извлечении меняется заряд белков и аминокислот, которые выпадают в осадок. Поэтому от них можно избавиться уже в процессе извле 73 чения. Если концентрацию спирта увеличить, то в извлечение будут переходить и липидные вещества, что потребует дополнительных методик очистки.
При использовании малых концентраций спирта (40%) взаимодействие извлекателя и ионизированного токсического вещества должно протекать в более кислой среде из-за увеличения кислотных свойств протонированного гетероатома. Поэтому нами предложено к извлекателю добавлять 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты до pH=1 для перевода оланзапина в ионизированное состояние. Так как максимальное количество оланзапина при использовании общих методов изолирования извлекалось методом А.А. Васильевой, то соотношение навески и извлекателя и режим настаивания нами не изменялись. Основываясь на физико-химических свойствах оланзапина, нами предложена следующая методика изолирования.
Навеску измельченного объекта заливали спиртом 40% (1:2), подкисляли 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до pH=1, проводили настаивание 2 часа при периодическом взбалтывании. К водной фазе добавляли 5 мл диэтилового эфира, органический слой отбрасывали. К водной фазе прибавляли 1 мл натрия сульфата раствора насыщенного и 60 мл хлороформа. Содержимое колбы взбалтывали в течение 5 минут и помещали в делительную воронку. После разделения фаз отделяли слой органического растворителя. Растворители удаляли при комнатной температуре. Сухие остатки, полученные после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл спирта 96% и проводили обнаружение и количественное определение оланзапина методом ВЭЖХ.
Так как оланзапина является слабым основанием, то при изолировании будет обнаруживаться как в извлечении из кислого раствора, так и в извлечении из щелочного раствора. Для того, чтобы выбрать оптимальное значение pH среды для изолирования при направленном анализе, нами было проведено изолирование оланзапина из другой навески из щелочной среды на II этапе изолирования. Навеску измельченного объекта заливали спиртом 40% (1:2), подкисляли 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН=1, прово 74 дили настаивание 2 часа при периодическом взбалтывании. К водной фазе добавляли 5 мл диэтилового эфира, органический слой отбрасывали. Водную фазу подщелачивали 25% раствором аммиака до pH=12, прибавляли 1 мл натрия сульфата раствора насыщенного и 60 мл хлороформа. Содержимое колбы взбалтывали в течение 5 минут и помещали в делительную воронку. После разделения фаз отделяли слой органического растворителя. Растворители удаляли при комнатной температуре. Сухие остатки, полученные после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл спирта 96%.
Обнаружение и количественное определение оланзапина проводили методом ВЭЖХ, используя условия, описанные в разделе 3.4. Расчет содержания оланзапина в извлечении из модельных проб печени и почек проводили по калибровочному графику (рисунок 3.9.). Полученные данные представлены в таблицах 5.3, 5.4.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в извлечении из рас твора с рН=2 удается обнаружить 71,36-72,17% оланзапина, в то время как в извлечении из раствора с рН=12 – 82,68-83,01%. Так как степень извлечения оланзапина из раствора с рН=2 и из раствора с рН=12 более 50%, то нами рекомендуется использовать при направленном анализе извлечение как из раствора с рН=2, так и с рН=12.
Исходя из того, что разработанные нами методики количественного определения предлагаются для целей химико-токсикологического анализа оланзапина, то была проведена их валидация по показателям: специфичность, прецизионность, правильность на уровне intra-day и inter-day.
Оценку методики изолирования оланзапина из модельной смеси печени и почек проводили, используя результаты определения оланзапина в извлечении из раствора с рН=12 как извлечения с большим содержанием оланза-пина.
Для определения специфичности методики проводили анализ извлечений из печени и почек без добавления оланзапина (контрольный образец), образцов печени с добавками оланзапина 6 мкг/г. На хроматограммах извлечений контрольного образца не наблюдалось пиков со временем удерживания 6,75 мин, соответствующих оланзапину. Хроматограммы извлечений представлены на рисунках 5.1, 5.2, 5.3, 5.4.
Рисунок 5.1 - Хроматограмма извлечения контрольного образца печени (1– неидентифицированный компонент) Рисунок 5.2 - Хроматограмма извлечения из модельной пробы печени (1,2 – неидентифицированные компоненты, 3 – пик оланзапина)
На рисунке 5.1 наблюдается четко выраженный пик неидентифициро-ванного вещества. В извлечении из модельной пробы печени наблюдается появление на хроматограмме еще два пика, один из которых соответствует исследуемому веществу (рисунок 5.2).
Предел количественного определения оланзапина, определенный в разделе 3.4. с учетом степени извлечения из печени, составляет 0,12 мкг/мл. Результаты определения прецизионности и правильности определения оланза-пина в извлечениях из печени методом ВЭЖХ в течение первого дня (intra-day) и второго дня (inter-day) исследований представлены в таблице 5.5.