Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Классификация и токсикологическое значение гипотензивных лекарственных средств 10
1.2. Фармакологические свойства гипотензивных лекарственных препаратов 15
1.2.1. Фармакология -адреноблокаторов 16
1.2.2. Фармакология блокаторов кальциевых каналов 18
1.2.3. Фармакология ингибиторов АПФ 21
1.3. Токсикология антигипертензивных лекарственных средств 24
1.3.1. Клиническая картина острых отравлений гипотензивными
лекарственными средствами 24
1.3.2. Терапевтические и токсические концентрации гипотензивных
лекарственных веществ и методы детоксикации 25
1.4. Физико-химические свойства гипотензивных лекарственных веществ 27
1.5. Методы лабораторного обнаружения гипотензивных лекарственных средств в биологических жидкостях человека 32
Выводы к разделу обзор литературы 39
ГЛАВА 2. Разработка методики скрининга гипотензивных лекарственных средств при острых отравлениях методом тонкослойной хроматографии 40
2.1. Материалы и методы 40
2.1.1. Оборудование 40
2.1.2. Растворы и реактивы 40
2.1.3. Стандартные образцы 41
2.1.4. Приготовление растворов и пробоподготовка 41
2.1.5. Разработка хроматографической методики 43
2.2. Результаты и обсуждение 44
ГЛАВА 3. Разработка методики скрининга гипотензивных лекарственных средств при острых отравлениях методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием 48
3.1. Материалы и методы 48
3.1.1. Оборудование 48
3.1.2. Растворы и реактивы 48
3.1.3. Стандартные образцы 49
3.1.4. Приготовление растворов и пробоподготовка 49
3.1.5. Разработка хроматографической методики 52
3.2. Результаты и обсуждение 54
3.2.1. Применение разработанной методики 66
ГЛАВА 4. Разработка методики определения гипотензивных лекарственных средств в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием 72
4.1. Материалы и методы 72
4.1.1. Оборудование 72
4.1.2. Растворы и реактивы 72
4.1.3. Стандартные образцы 73
4.1.4. Приготовление растворов и пробоподготовка 73
4.1.5. Разработка хроматографической методики определения атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла 77
4.1.6. Разработка хроматографической методики определения эналаприла и эналаприлата 79
4.2. Результаты и обсуждение 82
4.2.1. Валидация методики определения атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла 82
4.2.2. Валидация методики определения эналаприла и эналаприлата 90
4.2.3. Применение разработанной методики определения атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла 94
4.2.4. Применение разработанной методики определения эналаприла и эналаприлата 95
Общие выводы 98
Список литературы 100
- Фармакология ингибиторов АПФ
- Стандартные образцы
- Приготовление растворов и пробоподготовка
- Разработка хроматографической методики определения атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Заболевания сердечно-сосудистой системы занимают лидирующие позиции в структуре заболеваемости и смертности в Российской Федерации. Артериальная гипертензия является одним из самых распространённых заболеваний сердечно-сосудистой системы. Для лечения данной патологии существует большое количество лекарственных препаратов, многие из которых включены в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов и широко доступны населению.
Больные нередко нарушают дозировку и кратность приёма гипотензивных препаратов, что часто приводит к острым отравлениям. Встречаются также и умышленные отравления антигипертензивными лекарственными средствами (попытки суицида, криминальные случаи).
В среднем по статистике острые отравления гипотензивными средствами средней тяжести, тяжёлые и крайне тяжёлые составляют 5% от всех отравлений и 11% от отравлений лекарственными средствами, причём ежегодно наблюдается увеличение доли отравлений гипотензивными лекарственными средствами. В структуре заболеваемости заметное место занимают лекарственные препараты, относящиеся к группам -адреноблокаторов, блокаторов медленных кальциевых каналов и ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ). Летальность составляет до 6,5%, причем наиболее опасны в данном случае отравления верапамилом.
Действуя через разные механизмы, антигипертензивные препараты вызывают
ряд эффектов в сердечно-сосудистой системе. Помимо снижения артериального
давления, некоторые лекарственные средства обладают антиаритмическим и
антиангинальным действием. Ввиду сходства симптоматики при острых
отравлениях различными гипотензивными лекарственными средствами точная
диагностика острых отравлений только по клиническим проявлениям практически
не представляется возможной. Особенности фармакологических и
токсикологических свойств обуславливают наличие множества частных методов детоксикации при отравлениях различными гипотензивными лекарственными веществами, поэтому для оказания квалифицированной медицинской помощи требуется точное установление причины интоксикации на основе результатов химико-токсикологического анализа.
Гипотензивные лекарственные средства (ГЛС) разнообразны как по механизму действия, так и по химическому строению, что усложняет лабораторную диагностику отравлений этими веществами. Химико-токсикологический анализ антигипертензивных лекарственных препаратов необходим как для постановки или уточнения диагноза, так и для контроля лечения, особенно в случае тяжёлых отравлений.
Таким образом, учитывая статистику острых отравлений, необходима
разработка подходов к химико-токсикологическому анализу антигипертензивных
лекарственных средств периферического действия, относящихся к -
адреноблокаторам, блокаторам кальциевых каналов и ингибиторам АПФ.
Степень разработки темы исследования
В настоящее время опубликовано множество методик определения изучаемых
лекарственных средств в биологических жидкостях человека с помощью различных
хроматографических методов анализа. Однако, в большинстве случаев они не
пригодны для проведения химико-токсикологического анализа, так как их
аналитические диапазоны не позволяют определять исследуемые вещества в
токсических концентрациях, либо методикой предусмотрена сложная
многостадийная пробоподготовка, значительно увеличивающая время анализа, тогда как для целей практического здравоохранения требуются удобные и экспрессные методики.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является разработка методик скрининга и
подтверждающего химико-токсикологического анализа гипотензивных
лекарственных средств при острых отравлениях.
Задачи исследования:
-
Провести анализ статистики острых отравлений и выбрать лекарственные средства, имеющие наибольшую токсикологичскую значимость; обосновать подходы к скринингу и подтверждающему химико-токсикологическому анализу для выбранных объектов с учётом их физико-химических свойств и особенностей токсикокинетики.
-
Разработать методику скрининга гипотензивных лекарственных средств в моче с применением метода тонкослойной хроматографии (ТСХ).
-
Разработать методику скрининга гипотензивных лекарственных средств в моче методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС).
-
Разработать методику количественного определения гипотензивных лекарственных средств в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).
-
Доказать пригодность разработанных методик для обнаружения и количественного определения ГЛС в биожидкостях пациентов.
Научная новизна.
Впервые рассмотрены и обобщены закономерности термодеструкции и образования производных некоторых гипотензивных лекарственных средств (атенолол, бисопролол, метопролол, нифедипин, пропранолол, эналаприл) при анализе острых отравлений методом ГХ-МС, составлены библиотеки времен удерживания и масс-спектров для автоматической идентификации анализируемых соединений и их производных (хроматографических артефактов) при анализе по разработанной методике. Разработаны и валидированы методики количественного определения гипотензивных лекарственных средств в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС, имеющие широкий аналитический диапазон и применимые как для химико-токсикологической диагностики острых отравлений, так и для проведения терапевтического лекарственного мониторинга и исследований биоэквивалентности. Разработанные методики отличаются простотой проведения процедуры пробоподготовки образцов биологических жидкостей, что обеспечивает экспрессность анализа.
Теоретическая и практическая значимость исследования
На основании результатов исследования выработан подход к проведению химико-токсикологического анализа при острых отравлениях гипотензивными лекарственными средствами с использованием методов ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС. Выявлены закономерности термодеструкции и образования формилированных производных (артефактов) атенолола, бисопролола, метопролола и пропранолола, окисления нифедипина и внутримолекулярной дегидратации эналаприла при анализе методом ГХ-МС.
Доказана возможность использования разработанных методик для скрининга гипотензивных лекарственных веществ в моче методами ТСХ и ГХ-МС, а также для их
обнаружения и количественного определения методом ВЭЖХ-МС/МС в плазме крови пациентов, госпитализированных с симптомами острых отравлений гипотензивными лекарственными средствами. Обосновано применение методики одновременного количественного определения эналаприла и эналаприлата методом ВЭЖХ-МС/МС в плазме крови человека для проведения терапевтического лекарственного мониторинга эналаприла с целью оптимизации фармакотерапии.
Основные положения, выносимые на защиту
Скрининг токсикологически значимых гипотензивных лекарственных веществ (атенолол, верапамил, нифедипин, пропранолол, эналаприл) в моче человека при острых отравлениях с использованием метода ТСХ.
Скрининг токсикологически значимых гипотензивных лекарственных веществ (атенолол, бисопролол, верапамил, метопролол, нифедипин, пропранолол, эналаприл) в моче человека при острых отравлениях с использованием метода ГХ-МС.
Доказательство пригодности методики количественного определения токсикологически значимых гипотензивных лекарственных веществ (атенолол, бисопролол, верапамил, метопролол, нифедипин, пропранолол, эналаприл) в плазме крови человека при острых отравлениях с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС.
Обоснование применения методики количественного определения эналаприла и эналаприлата в плазме крови человека с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС при острых отравлениях и при проведении терапевтического лекарственного мониторинга.
Методология и методы исследования. Методология исследования заключалась в обосновании оптимальных условий хроматографического разделения и детектирования изучаемых соединений на основании их физико-химических свойств. Пригодность разработанных методик для химико-токсикологического анализа подтверждалась валидацией по результатам анализа модельных образцов интактной плазмы крови и мочи с добавлением исследуемых соединений в токсических концентрациях.
В ходе выполнения работы были применены методы ТСХ, ГХ-МС (одноквадрупольный масс-детектор) и ВЭЖХ-МС/МС (тройной квадрупольный масс-детектор). Статистическая обработка результатов исследования выполнялась с использованием прикладного программного обеспечения Microsoft Excel.
Достоверность научных положений и выводов. Достоверность результатов исследования обеспечена использованием современных методов анализа, приведённых в диссертации (ТСХ, ГХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС). Первичные данные, полученные при
проведении настоящего исследования, являются достоверными и правильными, что подтверждено в ходе проведения процедуры валидации и статистической обработки полученных данных. Использованное в работе оборудование имело действующие свидетельства о поверке и зарегистрировано в Реестре средств измерений, что позволяет считать результаты исследования достоверными.
Апробация результатов исследования. Основные положения работы и результаты исследования доложены на юбилейном ХХ российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013 г.), Первой международной научной конференции молодых ученых и студентов «Перспективы развития биологии, медицины и фармации» (г. Шымкент, Казахстан, 2013 г.), Второй международной научной конференции молодых ученых и студентов «Перспективы развития биологии, медицины и фармации» (г. Шымкент, Казахстан, 2014 г.). Апробация работы проведена на заседании кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева фармацевтического факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (10 февраля 2016 г.).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Лично автором проведены все экспериментальные исследования в процессе разработки методик определения гипотензивных лекарственных средств (атенолол, верапамил, нифедипин, пропранолол, эналаприл) в моче методом ТСХ, определения гипотензивных лекарственных средств (атенолол, бисопролол, верапамил, метопролол, нифедипин, пропранолол, эналаприл) в моче методом ГХ-МС, разработка и валидация методики определения атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола, эналаприла и эналаприлата – методом ВЭЖХ-МС/МС. Вклад автора является определяющим на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику.
Внедрение результатов исследования Разработанные методики обнаружения и количественного определения гипотензивных лекарственных средств в биологических жидкостях человека внедрены в практическую деятельность химико-токсикологической лаборатории отделения лечения острых отравлений Научно-исследовательского института скорой помощи имени Н.В. Склифосовского. Методика количественного определения эналаприла и эналаприлата в плазме крови человека с помощью ВЭЖХ-МС/МС используется для проведения терапевтического
лекарственного мониторинга в Центре персонализированной медицины городской клинической больницы имени И.В. Давыдовского.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 4 паспорта специальности.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (№ государственной регистрации 01.2.006.06352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева «Основные направления создания и оценки качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01.2.009.07145).
Объем и структура диссертации.
Фармакология ингибиторов АПФ
БКК из группы фенилалкиламинов оказывают преимущественное действие на кардиомиоциты, снижая частоту и силу сердечных сокращений. В меньшей степени фенилалкиламины действуют на гладко-мышечные клетки (ГМК) сосудов. Применяются как антиаритмические и гипотензивные средства. Дигидропи-ридиновые БКК оказывают преимущественное действие на ГМК артерий и меньше действуют на кардиомиоциты, расширяют просвет сосудов, вследствие чего артериальное давление снижается. Возможно развитие рефлекторной тахикардии. Применяются как гипотензивные и антиангинальные лекарственные средства [9, 11, 21].
Нифедипин. При приеме внутрь быстро и полностью всасывается. Интенсивно метаболизируется в печени, около 80% принятой дозы выводится почками в форме неактивных метаболитов. Слабо проникает через гистогематичекие барьеры. Нарушение функции печении ведёт к накоплению нифедипина в организме с увеличением периода его полувыведения. Время достижения максимальной концентрации, продолжительность и выраженность гипотензивного эффекта сильно зависят от лекарственной формы и способа применения, так, при приёме внутрь действие препарата наступает через 30-60, а для сублингвалиных лекарственных форм оно составляет порядка 5-10 минут. [18].
Верапамил. После приема внутрь всасывается более 90% дозы, однако биодоступность вследствие эффекта первого прохождения через печень не превышает 30%. Проникает через гистогематические барьеры. При длительном приеме верапамила понижается клиренс и повышается биодоступность. На фоне тяжелого нарушения функции печени плазменный клиренс уменьшается на 70% и T1/2 увеличивается до 14–16 ч. Метаболизм верапамила представлен на схеме 5 [18, 19]. Метаболизируется в печени с образованием норверапамила, обладающего 20% гипотензивной активности верапамила, и 11 других метаболитов (определяются в следовых количествах), в том числе О-дезметил-производные верапамила (№1, 2, 3, 4 на схеме 5), О-дезметилнорверапамила (№5), 2-(3,4-диметоксифенил)-5-(метилмамино)-2-(пропан-2-ил)пентаннитрил (№6), 2-(3,4-диметоксифенил)-N-метилэтанамин (№7).
Ингибиторы АПФ предотвращают образование ангиотензина II, тем самым уменьшается влияние ренин-ангиотензиновой системы на тонус сосудов, наблюдается их расширение, устраняется инактивирующее влияние АПФ на брадики-нин, оказывающий сосудорасширяющее действие [8, 9].
Эналаприл. После введения внутрь всасывается около 60% (независимо от наличия пищи в ЖКТ). Эналаприл является пролекарством, подвергается биотрансформации в печени с образованием активного метаболита — эналаприлата (схема 6). Эналаприлат легко проходит через гистогематические барьеры, исключая ГЭБ, проникает через плаценту. Экскретируется преимущественно почками (до 40% выводится в виде эналаприлата). В течение 24 ч элиминируется до 90% введенного количества. Понижение АД проявляется через 1 ч после приема, достигает максимума к 6 ч и продолжается в течение 1 суток. У некоторых больных для достижения оптимального уровня АД необходима терапия на протяжении нескольких недель [18, 22].
При передозировке гипотензивных лекарственных средств из разных групп клиническая картина острого отравления наблюдается схожая, имеются лишь небольшие различия в симптоматике, опираясь на которые, тем не менее, трудно точно установить токсикант [6]. -адреноблокаторы при передозировке могут спровоцировать снижение артериального давления вплоть до коллапса, брадикардию, атриовентри-кулярную блокаду, бронхоспазм, гипогликемию.
В связи с проникновением через ГЭБ и воздействием на центральные адренорецепторы возможны неврологические нарушения. Головокружение, слабость, оглушение с расстройством ориентации и памяти, нарушения зрения. Отмечают миоз с сохраненной реакцией на свет, сухость слизистых, при гипергидрозе кожного покрова, гипотермию, снижение перистальтики кишечника [6, 18, 24, 25, 26].
Блокаторы кальциевых каналов. Токсичность проявляется, прежде всего, действием на сердечно-сосудистую систему. Наблюдается резкое снижение артериального давления за счет падения периферического сосудистого сопротивления – первичный токсикогенный коллапс. Препараты обладают кардиотоксическим эффектом, причём, если при терапевтическом применении нифедипин действует в основном на гладкомышечные стенки сосудов, а верапамил – на сердечную мышцу, то при передозировки это различие исчезает и оба препарата действуют как на сосуды, так и на сердце. Развиваются синусовая брадикардия, нарушения внутрижелудочковой проводимости, вплоть до полной A-V блокады, возможна остановка сердца. Одновременно отмечаются оглушение, сопорозное состояние, судороги, кома с остановкой дыхания. Иногда развиваются парез кишечника и олигурия [6, 18, 24, 25, 27].
Стандартные образцы
Выбор подвижной фазы проводили с учётом кислотно-основных свойств исследуемых соединений. Хроматографическое разделение проводилось в прямофазном режиме, то есть неподвижная фаза имела большую полярность чем элюент. Для улучшения сродства слабых оснований к подвижной фазе добавляли аммиак, а для слабых кислот – уксусную кислоту.
Для веществ нейтрального и основного характера (атенолол, пропрано-лол, верапамил, нифедипин) были выбраны следующие подвижные фазы: толуол - изопропанол - конц. раствор аммиака (5:4:1), хлороформ - этанол (9:1), этилацетат - этанол - конц. раствор аммиака (10:30:1). Для эналаприла как вещества слабокислого характера были выбраны следующие подвижные фазы: ацетон - ледяная уксусная кислота (20:1), хлороформ - ацетон - ледяная уксусная кислота (10:2:2).
Перед проведением анализа хроматографическая камера насыщалась парами подвижной фазы в течение 30 минут. На линию старта пластинки длиной 10 см наносили по 5 мкл. стандартных растворов лекарственных веществ в концентрации 500 мкг/мл. Пластинки помещались в хроматографи 44 ческую камеру, и проводилось разделение методом восходящего хромато-графирования. Когда фронт подвижной фазы проходил 90% длины, пластины вынимали и высушивали на воздухе.
Детектирование веществ проводили, просматривая пластины в УФ-свете при 254 нм. Далее пластины обрабатывали либо модифицированным реактивом Драгендорфа, либо реактивом Либермана, либо смесью концентрированных серной и азотной кислот (1:1 по объёму).
Значения коэффициентов подвижности (Rf) для ГЛС в различных системах растворителей, установленные в ходе эксперимента с использованием ТСХ, приведены в таблице 9.
Подвижная фаза Атено-лол Пропра-нолол Верапа-мил Нифе-дипин Энала-прил толуол - изопропанол -конц. раствор аммиака (5:4:1) 0,30 0,51 1 1 хлороформ - этанол (9:1) 0,02 0,23 0,51 0,83 этилацетат - этанол -конц. раствор аммиака (10:30:1) 0,27 0,43 0,61 0,94 ацетон - ледяная уксусная кислота (20:1) - - - - 0,79 хлороформ - ацетон -ледяная уксусная кислота (10:2:2) - - - - 0,54 Среди опробованных подвижных фаз наиболее полного разделения веществ удаётся добиться в системе хлороформ - этанол (9:1). Однако, эта система не подходит для элюирования эналаприла. Атенолол имеет слабую подвижность при данном составе подвижной фазы, так как является полярным соединением, и практически не растворяется в смеси хлороформа и этанола. В системе этилацетат - этанол - конц. раствор аммиака (10:30:1) также наблюдается хорошее разделение исследуемых веществ, однако нифедипин практически не сорбируется неподвижной фазой в данных условиях и элюи-руется с фронтом растворителя. В системе толуол - изопропанол - конц. раствор аммиака (5:4:1) не удаётся разделить верапамил и нифедипин, поэтому она не пригодна для скрининга ГЛС при острых отравлениях.
Как в случае сильного удерживания компонента силикагелем (Rf 0,1), так и в случае элюирования вещества с фронтом подвижной фазы (Rf 0,9) создаются трудности для детектирования пятен и интерпретации результатов, т.к. исследуемы вещества будут накладываться на другие сильно или слабо удерживаемые компоненты, соответственно.
Эналаприл, как слабая кислота, имел оптимальное удерживание в системе хлороформ - ацетон - ледяная уксусная кислота (10:2:2), которая непригодна для анализа соединений основного характера.
При рассмотрении пластин в УФ-свете пятна всех исследуемых веществ выглядят как зоны гашения флуоресценции. В таблице 10 указаны результаты проведения цветных реакций исследуемых лекарственных веществ с проявляющими реактивами. Таблица 10.
Окрашивание пятен гипотензтвных лекарственных веществ с различными проявляющими реактивами. Реактив Вещество Реактив Дра-гендорфа Реактив Либермана H2S04 - HN03 (1:1) Атенолол Оранжевый Светло-кирпичный, переходящий в бесцветный Серо-коричневый, слабый
Пропранолол Оранжевый Сине-зелёный, переходящий в зелёный Светло-оранжевый, переходящий в жёлто-зелёный Верапамил Жёлто-оранжевый Серо-коричневый, кирпично-красная кайма при нагревании Малиновый, переходящий в серо-коричневый Нифедипин Жёлтый Жёлтый с коричневатой каймой Ярко-жёлтый Эналаприл Жёлто-оранжевый Оранжевый, переходящий в бурый Коричневато-жёлтый Реактив Драгендорфа селективен в отношении азотистых оснований. Все исследуемые вещества, кроме нифедипина, имеют основный атом азота, поэтому реактив Драгендорфа не специфичен по отношению ни к какому из веществ. Реактив Либермана достаточно специфичен в отношении пропрано-лола, однако с остальными веществами он даёт окраски, которые похожи между собой. Смесь концентрированных серной и азотной кислот также даёт с разными веществами во многом схожие окрашивания. В целом, идентификация гипотензивных лекарственных веществ по реакциям окрашивания носит субъективный характер.
ТСХ в химико-токсикологическом анализе используется как предварительный скрининговый метод. Соответственно, методика должна позволять обнаруживать ГЛС в пробах, не давая ложноотрицательных результатов.
Чтобы соответствовать этим требованиям, скрининг ГЛС в моче методом ТСХ необходимо отдельно параллельно проводить, используя два вида экстракции: использовать систему Toxi Tube А для слабых оснований и Toxi Tube В для слабых кислот (эналаприл). Далее полученные экстракты параллельно хроматографируют в двух системах: этилацетат - этанол - конц. раствор аммиака (10:30:1) – для слабых оснований, экстракт из Toxi Tube А и хлороформ - ацетон - ледяная уксусная кислота (10:2:2) – для эналаприла, экстракт из Toxi Tube В. Проявление пластин следует осуществлять реактивом Либермана.
Предложенная методика скрининга ГЛС в моче методом ТСХ может быть использована как экономичный предварительный метод групповой идентификации гипотензивных лекарственных веществ. Ввиду низкой селективности методики необходимо проведение подтверждающего анализа другим аналитическим методом.
Приготовление растворов и пробоподготовка
Для приготовления исходного стандартного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 10,0 мг ГЛС (в пересчёте на основание и с учётом чистоты стандартного образца), прибавляли 25 мл этанола, перемешивали до полного растворения, доводили объём раствора до метки тем же растворителем (таблица 11). В полученном растворе концентрация ГЛС составляла 100 мкг/мл. Далее отбирали 2 мл исходного стандартного раствора, помещали в мерную колбу вместимостью 20 мл, доводили до метки этанолом и перемешивали (таблица 12). Концентрация ГЛС в полученном растворе составляла 10 мкг/мл.
Бисопролола гемифумарат 11,90 Верапамила гидрохлорид 10,87 Метопролола тартрат 12,99 Нифедипин 10,20 Пропранолола гидрохлорид 11,63 Эналаприла малеат 13,33 Таблица 12. Приготовление рабочих стандартных растворов
Для приготовления исходного раствора внутреннего стандарта 10,00 мг дифениламина (ДФА) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяли в 20 мл метанола, затем доводили объём раствора до метки метанолом и перемешивали. 5 мл полученного раствора помещали в мерную кол 51 бу вместимостью 25 мл, доводили объём раствора до метки метанолом и перемешивали. Концентрация дифениламина в полученном рабочем растворе внутреннего стандарта составляла 20,00 мкг/мл.
Пробоподготовка образцов мочи проводилась методом ЖЖЭ с использованием стандартных экстракционных систем Toxi Tube А (Agilent Technologies) для веществ нейтрального и слабоосновного характера и Toxi Tube B (Agilent Technologies) для веществ слабокислого и нейтрального характера. Toxi Tube А содержит в качестве экстрагента 2,3 мл смеси гептан – изопропанол – 1,2-дихлорэтан – дихлорметан (77 : 38 : 58 : 58 по объёму), натрия хлорид как высаливающий агент и смесь карбоната и гидрокарбоната натрия в качестве буфера. Toxi Tube B содержит в качестве экстрагента 2,3 мл смеси гептан – дихлорметан (105 : 125 по объёму), цинка хлорид как высаливающий и создающий кислую реакцию среды агент. Процедура пробо-подготовки одинаковая для обеих систем.
В Toxi Tube помещали 3 мл мочи больного либо 2,8 мл интактной мочи с прибавлением 200 мкл стандартного раствора ГЛС, добавляли 30 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта. Концентрация ДФА в пробе составляла 200 нг/мл, концентрация ГЛС при прибавлении к интактной моче стандартных растворов составляла 30, 50, 100, 500, 1000, 5000 нг/мл.
Экстракцию проводили на шейкере с частотой 100 об/мин в течение 3 минут. Слои разделяли центрифугированием в течение 5 минут со скоростью 3200 об/мин. После центрифугирования отбирали органическую фазу (верхний слой) и упаривали досуха. Сухой остаток перерастворяли в 200 мкл этил-ацетата или метанола. В хроматограф вводили 2 мкл полученного экстракта.
Toxi Tube А использовали в случае ненаправленного скрининга или для подтверждения отравлений веществами слабоосновного и нейтрального характера – пропранололом, атенололом, метопрололом, бисопрололом, нифе-дипином. Для экстракции эналаприла, обладающего слабокислыми свойствами, целесообразно использовать Toxi Tube B. Однако, поскольку эналаприл может извлекаться из мочи и при слабощелочных значениях рН, для унификации способа пробоподготовки при ненаправленном анализе была выбрана экстракция с использованием системы Toxi Tube А.
Для получения формилированных производных в пробирку с навинчивающейся крышкой вносили 50 мкл стандартного раствора -адреноблокатора с концентрацией 100 мкг/мл, 2,5 мл воды очищенной и 0,5 мл формалина. Далее полученную смесь нагревали на песчаной бане в течение 15 мин, охлаждали, проводили экстракцию 3 мл этилацетата на шейкере с частотой 100 об/мин в течение 3 мин. Затем пробирки центрифугировали 5 мин со скоростью 3200 об/мин. Отбирали органическую фазу (верхний слой), упаривали досуха. Сухой остаток перерастворяли в 200 мкл этилацетата.
Хроматографическое разделение производили на колонке TR-5MS, длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина плёнки неподвижной жидкой фазы 0,25 мкм. Фаза – 5% дифенил, 95% – диметилполиси-локсан. Газ-носитель – гелий. Температура инжектора – 220C, интерфейса – 280C, ионного источника – 200C. Детектирование проводили по полному ионному току в диапазоне m/z 41–650, ионизация электронным ударом с энергией 70 eV. Начало регистрации сигнала – через 4,5 мин после ввода пробы. Объём вводимой пробы 2 мкл, образец вводили в инжектор хроматографа в режиме без деления потока.
Изначально разделение проводилось по следующей температурной программе: 50C – 0,5 минуты, нагрев 100C/мин. до 100C, 100C – 1 минута, нагрев 15C/мин. до 280C, 280C – 20 минут.
Установлено, что при анализе с использованием описанной выше температурной программы в интервале времени от 10 до 15 минут расположены пики пропранолола, бисопролола, метопролола, атенолола и нифедипина. Анализ проб мочи показал в дальнейшем, что в этом же промежутке находятся пики некоторых метаболитов нифедипина, а также других веществ, которые не являются объектами данного исследования. В этих условиях создаётся риск неполного разделения пиков или их наложения. Для улучшения разрешения была модифицирована температурная программа: 50C – 0,5 минуты, нагрев 100C/мин. до 190C, 190C – 1 минута, нагрев 10C/мин. до 280C, 280C – 13 минут.
Изменение программы привело к сокращению времени анализа на 8 минут. Замедление в 1,5 раза скорости нагревания на участке 190-280C позволило добиться улучшения разрешения пиков на данном участке.
Разработка хроматографической методики определения атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла
Разделение осуществляли на колонке Synergi Polar RP, 4 мкм, 250 4.6 мм (Phenomenex, США) с привитой фенильной неподвижной фазой при температуре 40С. Подвижная фаза состояла из элюента А: 1% муравьиной кислоты / деионизованная вода – и элюента В: 1% муравьиной кислоты / ацетонитрил. Хроматографическое разделение проводили в градиентном режиме элюирова-ния, описанном в таблице 20. Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин.
Введение в подвижную фазу различных добавок, называемых динамическими модификаторами, необходимо для изменения, а именно, улучшения хро-матографического разделения. Произведен экспериментальный подбор динамического модификатора для обеспечения оптимального разделения и ионизации эналаприла и эналаприлата при совместном присутствии. Наилучшие результаты достигнуты при добавлении к подвижной фазе муравьиной кислоты в количестве 1% по объёму. При этом при отсутствии модификаторов не наблюдалось полного разделения исследуемых веществ. Соли муравьиной кислоты, как и она сама, являются летучими, кроме того, добавка кислот в случае ионизации электрораспылением важна для формирования правильной формы капли получаемого аэрозоля и как следствие улучшение ионизации веществ.
Эналаприл содержит в своей структуре карбоксильную и вторичную алифатическую аминогруппу, а в молекуле эналаприлата имеются две карбоксильных и вторичная алифатическая аминогруппа. В связи с этим оба соединения обладают как кислотными, так и основными свойствами, в зависимости от рН в растворе эти вещества могут существовать в форме катионов, анионов и цвиттер-ионов. Для улучшения ионизации электрораспылением в положительном режиме и, следовательно, увеличения чувствительности методики необходимо подавление диссоциации карбоксильных групп эналаприла и эналаприла-та и смещение кислотно-основного равновесия в сторону протонирования ами 81 ногруппы для приобретения молекулой положительного заряда, что достигается при взаимодействии исследуемых соединений с муравьиной кислотой.
Более ярко выраженные кислотные свойства эналаприлата приводят к тому, что эффективность его ионизации и сигнал детектора примерно в 10 раз меньше по сравнению с эналаприлом. Тем не менее, предложенные условия анализа обеспечивают нПКО методики на уровне 5 нг/мл и оставляют возможность ещё больше его снизить.
В процессе создания методики был произведен подбор неподвижной фазы. Колонка Synergi Polar RP с силикагелем, модифицированным фенильными радикалами, позволила достичь более качественного разделения, чем колонка Zorbax Eclipse XDB-C18 с силикагелем, модифицированным алкильным радикалами С18. Разрешение между пиками эналаприла и эналаприлата и удерживание эналаприлата увеличилось, уменьшилось размывание пиков. Данное явление можно объяснить тем, что фенильная неподвижная фаза по сравнению с фазой С18 и лучше сорбирует эналаприл и эналаприлат за счёт -взаимодействий. Существенно, что колонка Synergi Polar RP способна работать при рН 1,5, позволяя тем самым увеличить концентрацию муравьиной кислоты в подвижной фазе до 1% и подавить диссоциацию молекул эналаприла и энала-прилата по карбоксильным группам.
При определении условий масс-спектрометрического детектирования в режиме сканирования полного ионного тока (scan+) были выбраны ионы-предшественники: для эналаприла 349,30 m/z, для эналаприлата 377,20 m/z, что соответствует протонированным молекулярным ионам исследуемых веществ. Затем в режиме сканирования фрагментных ионов (product scan+) были выбраны ионы, которые в дальнейшем использовались для мониторинга множественных реакций (MRM+). Энергия соударений подбиралась экспериментально. В таблице № 21 представлены параметры детектирования в режиме MRM+. Таблица 21.
Параметры детектирования эналаприла и эналаприлата в режиме MRM+. № п/п Ион предшественник, m/z Фрагментный ион, m/z Энергия соударений, В Эналаприлат
Валидация методики количественного определение атенолола, бисопро-лола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС выполнена по следующим характеристикам: селективность, линейность, правильность (внутри цикла и между циклами), прецизионность (внутри цикла и между циклами), предел количественного определения, перенос пробы, стабильность растворов, эффект матрицы, извлечение [105, 106, 107].
Селективность методики оценивали при сравнении хроматограмм проб интактной плазмы с прибавлением стандартных растворов атенолола, бисопро-лола, верапамила, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла (ри 83 сунок 20) с хроматограммами проб интактной плазмы (рисунок 21). На хрома-тограмме пробы интактной плазмы не наблюдается пиков, соответствующих по временам удерживанию ГЛС. Времена удерживания имеют следующие величины: атенолол – 1,93 мин, метопролол – 4,28 мин, бисопролол – 6,46 мин, про-пранолол – 7,43 мин, эналаприл – 8,34 мин, верапамил – 9,99 мин, нифедипин – 12,39 мин.
ГЛС на уровне нПКО. При оценке линейности проводили анализ 7 проб интактной плазмы с добавлением стандартного раствора атенолола, бисопролола, метопролола, нифе-дипина, пропранолола и эналаприла до получения концентраций на уровне 10, 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000 нг/мл и. 6 проб интактной плазмы с добавлением стандартного раствора верапамила до получения концентраций на уровне 10, 50, 100, 500, 1000, 2500 нг/мл.
Для атенолола, бисопролола, верапамила, метопролола, пропранолола и эналаприла построены калибровочные графики с использованием весового коэффициента 1/С (Рис. 22). Уравнения калибровочных прямых и коэффициенты корреляции представлены в таблице 22.