Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современный анализ алимемазина 14
1.1 Общая характеристика алимемазина 14
1.2 Побочное действие и отравления алимемазином 16
1.3 Сравнительная характеристика предложенных методов анализа алимемазина в НД фирм - производителей и зарубежных фармакопеях 19
1.4 Исследование алимемазина в биологических объектах 23
Заключение по главе 1 25
Глава 2 Материалы и методики исследований 27
2.1 Материалы исследований 27
2.2 Методики исследований 30
Глава 3 Изучение возможности использования различных физико – химических методов для анализа алимемазина 33
3.1 Обнаружение алимемазина с помощью метода ТСХ 33
3.2 Исследование алимемазина с помощью метода УФ - спектрофотометрии 38
3.3 Анализ алимемазина с помощью метода ВЭЖХ 42
3.4 Анализ алимемазина с помощью метода ВЭЖХ/МС 48
3.5 Анализ алимемазина с помощью метода ГХ/МС 50
Заключение по главе 3 53
Глава 4 Выбор оптимальных условий экстракции алимемазина 56
4.1 Влияние рН среды и природы органического растворителя на изолирование алимемазина 56
4.2 Изучение влияния электролитов на изолирование алимемазина 60
4.3 Влияние времени и кратности экстракции на изолирование алимемазина 61
Заключение по главе 4 63
Глава 5 Разработка методик изолирования алимемазина из модельных смесей плазмы, мочи, слюны 64
5.1 Изолирование алимемазина из модельной смеси плазмы с использованием разработанной методики 64
5.2 Изолирование алимемазина из модельной смеси мочи с использованием разработанной методики 68
5.3 Изолирование алимемазина из модельной смеси слюны с использованием разработанной методики 72
Заключение по главе 5 76
Глава 6 Разработка методик диагностики алимемазина и его метаболитов в биологических жидкостях при остром отравлении 77
6.1 Обнаружение и количественное определение алимемазина в моче с помощью метода ВЭЖХ 78
6.2 Идентификация алимемазина в моче методом ВЭЖХ/МС и ГХ/МС 82
6.3 Обнаружение и количественное определение алимемазина в плазме методом ВЭЖХ 86
6.4 Идентификация алимемазина в плазме с использованием метода ВЭЖХ/МС и ГХ/МС 90
6.5 Идентификация метаболитов алимемазина при анализе извлечений из биологических жидкостей лабораторных животных 95
Заключение по главе 6 108
Глава 7 Разработка схемы химико-токсикологического анализа алимемазина 110
Заключение по главе 7 111
Заключение 112
Список сокращений 115
Список литературы 116
Приложения 130
- Сравнительная характеристика предложенных методов анализа алимемазина в НД фирм - производителей и зарубежных фармакопеях
- Анализ алимемазина с помощью метода ВЭЖХ
- Изолирование алимемазина из модельной смеси мочи с использованием разработанной методики
- Идентификация метаболитов алимемазина при анализе извлечений из биологических жидкостей лабораторных животных
Сравнительная характеристика предложенных методов анализа алимемазина в НД фирм - производителей и зарубежных фармакопеях
Для идентификации алимемазина в таблетках используют различные физико-химические методы анализа, прописанные в отечественной нормативной документации и фармакопеях зарубежных изданий. Нами были использованы: нормативная документация на таблетки «Тералиджен 5 мг» ОАО «Щелковский витаминный завод», европейская фармакопея 8.0 (2014), британская фармакопея (2013), американская фармакопея USP 38 NF 33 (2015), японская фармакопея 17 издания (2016).
Обобщенная информация о представленных методах анализа алимемазина показана в таблице 1.
Согласно табличным данным, для анализа алимемазина рекомендуется использовать различные методы анализа: ТСХ, ВЭЖХ, УФ-СФМ, ИКС. Опираясь на данные отечественной НД на таблетки тералиджен, нами также была использована смесь 5 М раствора аммиака и спирта 96% в качестве раствора сравнения при проведении анализа методом УФ-СФМ. Спирт метиловый необходимо заменить на спирт этиловый 96% в связи с высокой токсичностью метанола. Подвижная фаза в предложенном анализе методом ВЭЖХ имеет довольно сложный состав, что затрудняет ее использование. Все предложенные методы анализа требуют наличия стандартов, что затрудняет воспроизведение анализа алимемазина по выше представленным методикам.
Как следует из вышесказанного, для химико-токсикологического анализа алимемазина необходимо провести разработку последовательной схемы анализа, которая может быть воспроизведена в условиях отечественных ХТЛ.
Анализ алимемазина с помощью метода ВЭЖХ
На сегодняшний день метод высокоэффективной жидкостной хроматографии является довольно востребованным и применяется в различных областях науки [67]. Благодаря использованию данного метода можно достоверно установить факт наличия лекарственного вещества в биологических объектах и его количественное содержание. При анализе литературных данных установлено, что хроматографические методы анализа значительно превосходят другие методы по использованию. Лидирующую позицию среди хроматографических методов занимает ВЭЖХ (около 45% среди остальных хроматографических методов) [68]. ВЭЖХ в настоящее время в значительной степени вытеснила классические методы анализа: КХ, ТСХ, БХ, по темпам развития превосходит метод ГХ.
Достоинствами метода ВЭЖХ являются: исследование различных объектов без ограничений по физико-химическим свойствам, большой рабочий диапазон молекулярных масс веществ, высокая скорость анализа, эффективность разделения, высокая чувствительность.
Анализ доступной нам литературы показал, что отечественная нормативная документация на таблетки «Тералиджен» 5 мг не предусматривает использование метода ВЭЖХ для установки подлинности. В некоторых зарубежных фармакопеях данный метод анализа рекомендован для идентификации алимемазина. Нами были изучены предложенные методики проведения анализа, состав подвижных фаз, неподвижные фазы, условия хроматографирования, описанные в данных фармакопеях.
Американская фармакопея в качестве подвижной фазы рекомендует использовать смесь 0,005 М натрия 1-гептансульфонат в метаноле, уксусная кислота и вода (65:1:34) [73]. Для расчета количественного содержания алимемазина требуется наличие внутреннего стандарта, что не дает возможности применять данный метод для проведения скрининговых исследований. Значительным фактором является то, что в состав подвижной фазы включен метанол, который является довольно токсичным реагентом; некоторые из них труднодоступны для использования, что исключает возможность воспроизведения анализа согласно данной методики в условиях российских ХТЛ.
В 4 издании Clarke s analysis of drugs and poisons для обнаружения алимемазина рекомендуется использовать градиентный режим хроматографирования с использованием следующего состава подвижной фазы: 575 мг аммония формиата с добавлением 1,3 мл муравьиной кислоты в 500 мл воды: ацетонитрил (60:40 – 3 минуты, 20:80 – 11 минут, 0:100 – 12 минут, 60:40 – 13 минут) [80]. Проанализировав предложенные составы подвижных фаз, методики и условия хроматографирования, нами была проведена оптимизация пробоподготовки и хроматографических условий разделения.
При разработке методики анализа алимемазина с использованием данного метода опирались на физико – химические свойства исследуемого вещества. Алимемазин является полярным соединением, которое обладает высокой гидрофильностью. Это послужило выбором обращенно – фазового варианта ВЭЖХ, в котором в качестве элюента используют водно – органические смеси с буферными растворами. Кроме того, обращенно – фазовый вариант ВЭЖХ характеризуется высокой скоростью разделения, селективностью, воспроизводимостью результатов. Критериями оптимизации служили коэффициент разделения и ассиметрии пиков.
Успех разделения компонентов сложных смесей во многом определяется правильным выбором неподвижной и подвижной фаз. От правильного выбора неподвижной фазы зависит селективность и разрешение при разделении. В качестве неподвижной фазы нами был использован сорбент ProntoSil 120-5-C18AQ (химически модифицированный сорбент на основе силикагеля и привитой фазы С 18).
Для оптимизации разделения в качестве подвижной фазы нами использовался:
1. 0,1 % раствор кислоты трифторуксусной, который получил наибольшее распространение благодаря ряду следующих свойств: это летучее соединение, которое легко удаляется из элюатов упариванием; является хорошим растворителем многих веществ; не образует пиков в области коротких длин волн, что представляет собой определенное преимущество при хроматографировании сложных смесей;
2. Ацетонитрил, который довольно часто используется в качестве подвижной фазы как самостоятельно, так и в смеси с другими органическими растворителями. Ацетонитрил в большинстве случаев является лучшим органическим растворителем, так как он обладает низкой вязкостью, легколетуч, характеризуется высокой селективностью, не дает пиков в УФ-области до 200 нм.
Хроматографирование проводили с использованием изократического режима элюирования, так как наблюдался четкий симметричный пик алимемазина. При анализе алимемазина использовали термостатирование при 35 С, которое было установлено экспериментальным путем. Выбор длины волны детектирования осуществляли на основании полученного ранее спектра в подвижной фазе в диапазоне длин волн от 200 до 300 нм. Аналитическая длина волны составила 254 нм.
Приготовление раствора СО алимемазина для проведения анализа проводили по методике, описанной в разделе 2.1. Условия хроматографирования представлены в разделе 2.2.
Хроматограмма исследуемого вещества с помощью метода ВЭЖХ показана на рисунке 3.
На хроматограмме обнаружен пик алимемазина со временем удерживания 15,5 минут.
Метод ВЭЖХ будет нами использован для дальнейших исследований по обнаружению и количественному определению алимемазина в извлечениях из биологических жидкостей. Поэтому разработанная методика анализа алимемазина методом ВЭЖХ была подвергнута валидационной оценке.
Для расчета количественного содержания алимемазина использовали калибровочный график, который был построен в интервале концентраций исследуемого вещества 2-7 мкг/мл. Методика приготовления растворов описана в разделе 2.1.
Полученные данные были использованы для построения калибровочного графика (рисунок 4).
Калибровочный график подтверждает линейную зависимость площади пика от концентрации алимемазина, коэффициент корреляции составляет 0,99. Предел количественного определения алимемазина составил 2 мкг/мл (устанавливали как наименьшую концентрацию, которую можно количественно определить при заданных условиях хроматографирования).
Таким образом, в данных интервалах концентраций методика обеспечивает определение алимемазина с требуемой линейностью.
Правильность разработанной методики оценивали по анализу спиртовых растворов алимемазина с концентрациями 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 7 мкг/мл. Таблица 6 показывает полученные нами данные.
Изолирование алимемазина из модельной смеси мочи с использованием разработанной методики
Химико-токсикологический анализ мочи является самым простым способом определения содержания в организме токсических, сильнодействующих, психотропных веществ [40] в связи с тем, что большинство веществ экскретируются из организма с мочой, анализ мочи можно проводить при освидетельствовании живых лиц, в моче хороший уровень активности исследуемых веществ, а также достаточный объем биологического материала.
В моче лекарственные вещества могут находиться как в неизменном виде, так и в виде метаболитов, конъюгатов с серной, уксусной, глюкуроновой кислотами. Разрушение конъюгатов с указанными кислотами требует выполнения неспецифического кислотного или специфического ферментативного гидролиза [21]. На данном этапе исследования нами проводился анализ модельной смеси мочи, в которой не образуются метаболиты, поэтому пробоподготовка мочи осуществлялась без проведения гидролиза.
Разрабатывая методики изолирования алимемазина из модельных смесей мочи, нами были учтены ранее изученные факторы экстракции (глава 4).
Модельную смесь мочи в количестве 1 мл (методика приготовления описана в разделе 2.1) подщелачивали аммиака раствором 25% до рН=12 и прибавляли 30 мл хлороформа. Полученную смесь тщательно перемешивали в течение 3 минут и переносили в делительную воронку. После того как произошло разделение водной и органической фаз, органическую фазу помещали в выпарительную чашку и оставляли при комнатной температуре до полного высыхания. Сухой остаток, полученный после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл спирта 96%.
Полученные извлечения были проанализированы с помощью жидкостного хроматографа «Милихром А-02» по условиям, описанным в разделе 2.2.
На рисунке 14 показана полученная хроматограмма.
Как следует из рисунка, пик со временем удерживания 15 минут соответствует алимемазину.
Содержание алимемазина (Х,%) рассчитывали по СО [19]. Для расчета степени извлечения нами была использована формула 1. Результаты количественного определения алимемазина в извлечениях из модельной смеси плазмы представлены в таблице 14.
Степень извлечения алимемазина из модельной смеси мочи составила 68,67 -75,00%.
Данная методика анализа является специфичной, предел количественного определения составил 2,67 мкг/мл (формула 5).
Таблица 15 показывает результаты оценки правильности определения алимемазина в извлечениях из модельной смеси мочи с помощью метода ВЭЖХ.
Как следует из табличных данных, относительная ошибка и относительное стандартное отклонение не превышают установленных норм (менее 20% для минимальной концентрации алимемазина и менее 15% - для остальных концентраций).
Идентификация метаболитов алимемазина при анализе извлечений из биологических жидкостей лабораторных животных
С целью установления факта приема наркотических, сильнодействующих веществ в химико-токсикологическом анализе чаще всего используют мочу в качестве биологического объекта. Выделение токсических веществ с мочой происходит как в нативном виде, так и в виде метаболитов.
Благодаря возможности обнаружения метаболитов в анализируемой пробе удается исключить как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.
При обнаружении лекарственного вещества в моче необходимо принимать во внимание основные метаболические реакции, протекающие с этим веществом в организме человека; знать в виде каких метаболитов вещество выводится из организма с мочой; что происходит с этими метаболитами и нативными веществами в процессе подготовки мочи для анализа [29]. Идентификацию метаболитов чаще всего проводят методом ГХ/МС [103].
Для подготовки проб мочи к анализу с помощью метода ГХ/МС необходимо провести кислотный гидролиз и дериватизацию (с целью получения ацетилированных производных). Выполнение этих стадий проводится для разрушения конъюгатов с глюкуроновой кислотой и получения более летучих, менее полярных соединений.
Наиболее часто используемым дериватизирующим агентом является уксусный ангидрид [30]. Нами было проведено ацетилирование согласно типовой методике в смеси уксусного ангидрида и пиридина (1:1). Сухие продукты растворяли в спирте 96%.
Как известно, данная реакция широко применяется для анализа исследуемых веществ в связи с тем, что она подходит для большинства соединений практически полностью без образования побочных продуктов.
Среди главных преимуществ реакции ацетилирования можно выделить следующие: невысокая стоимость используемых реактивов, стабильные дериваты с хорошими газохроматографическими свойствами, отсутствие эффекта «привыкания» колонки.
После хроматографирования извлечения из мочи автоматически включается библиотечный поиск по справочным масс – спектрам. Современные библиотеки масс-спектров помимо нативных веществ включают несколько дериватов их метаболитов. Вначале производится поиск масс – спектров по личной библиотеке с вероятностью совпадения не ниже 90%. Однако, не всегда библиотечный поиск эффективно обнаруживает анализируемые вещества, в связи с тем, что помимо метаболических процессов, происходящих с исследуемыми веществами в организме человека, могут происходить изменения этих веществ и их метаболитов на стадии пробоподготовки проб, а также в ходе хроматографической разгонки. Поэтому для надежной достоверности присутствия в моче анализируемого вещества и его метаболитов необходимо сопоставление данных по масс-спектрам и временам удерживания на полученных хроматограммах и сравнении их со стандартом.
Алимемазин, как было отмечено ранее, является веществом основного характера. Всасывание его происходит преимущественно в кишечнике. Алимемазин связывается с белками на 20 - 30%. Метаболизируется в печени, выводится почками, в моче обнаруживается в основном в виде метаболитов [50].
Образование метаболитов алимемазина, как и многих других лекарственных веществ, включает две фазы. I фаза метаболизма производных фенотиазина состоит из следующих этапов: гидроксилирование, деалкилирование, деметилирование и образование сульфоксидов. II фаза метаболизма включает образование глюкуронидов [55].
Нами проводилось изучение метаболитов, образующихся в I фазе метаболизма алимемазина, так как при остром отравлении необходимо как можно скорее провести его идентификацию и применять меры по инактивации. Образование глюкуронидов происходит во II фазе метаболизма, что является довольно длительным процессом, который рассматривался нами в разделе 6.1.
Данные литературы содержат сведения об основных метаболитах алимемазина, однако ни в одном из источников не указан временной промежуток их появления в биологических объектах.
Так, идентификация метаболитов алимемазина в моче крыс проводилась методом ГХ/МС. После перорального введения алимемазина в дозе 0,5 мг/кг крысам, было идентифицировано несколько метаболитов алимемазина, основным из которых был 3 – гидрокситримепразин (m/z 314). Также были обнаружены следующие метаболиты: N – деметилтримепразин (m/z 284), N – деметил -3-гидрокситримепразин (m/z 300) и сульфоксид тримепразина (m/z 314). Автором обозначено, что основной путь метаболизма алимемазина у крыс – ароматическое гидроксилирование, второстепенные – сульфоксидирование и N-деметилирование [92].
Согласно исследованиям другого автора, при изучении метаболизма алимемазина в моче крыс было обнаружено девять метаболитов, которые определяли с помощью методов ТСХ, УФ - СФМ, масс-спектрометрии. Среди выявленных метаболитов основную группу составляли гидрокси-, N - деалкил, S - оксид и сульфоновые производные. Более 50% среди идентифицированных метаболитов составляли гидроксисоединения, 5-10% - сульфоновые производные. Основная экскреция метаболитов была через мочу (около 75%) [77].
На основании работы другого исследователя были сделаны следующие выводы: концентрация фенотиазиновых производных и их метаболитов в моче выше, чем в плазме. Мониторинг метаболитов алимемазина в моче после кислотного гидролиза показал, что было обнаружено шесть метаболитов алимемазина с молекулярными массами 199, 257, 356, 326, 312, 384 а.е.м., большинство из них были ацетилированными продуктами [102].
Нами были получены масс - спектры 3-гидрокситримепразина (рисунок 34), сульфоксид тримепразина (рисунок 35), а также масс-спектры извлечений мочи и плазмы в разные временные промежутки (рисунки 36- 45).