Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. химическая природа биосферных гуминовых веществ и их биологическая активность 9
1.1. Состав и структурная организация гуминовых веществ 9
1.2. Элементный состав, функциональные группы и свойства гумусовых кислот 19
1.3. Биологическая активность пелоидов и препаратов на их основе 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования ... 34
2.1 Объекты исследования 34
2.2. Методы исследования 34
2.2.1 Получение субстанций гумусовых кислот пелоидов 34
2.2.2 Методы определения элементного состава и расчет физико химических характеристик 38
2.2.3. Получение !Н -ЯМР спектров 40
2.2.4. Получение спектров электронного парамагнитного резонанса .41
2.2.5. Исследование кислотно-основных свойств в ряду гуминовых веществ 43
2.2.6. Взаимодействие гумусовых кислот с ионами металлов
2.2.7. Исследование комплесообразовательной способности в ряду гуминовых веществ 46
2.2.8. Определение коэффициента распределения для гуминовых веществ в системе октанол-вода 49
2.3 Биологическая активность в опытах in vitro
ГЛАВА 3. Состав и свойства гуминовых веществ иловых сульфидных грязей 51
3.1. Элементный состав препаратов гуминовых веществ 51
3.2.Электронные спектры поглощения растворов гуминовых веществ
3.3 Инфракрасные спектры гуминовых веществ 57
3.4 Спектры протонного ядерного магнитного резонанса гуминовых веществ 60
3.5 Спектры электронного парамагнитного резонанса 67
3.6 Кислотно-основные свойства ряду гуминовых веществ 70
3.7 Осадительная и комплексообразовательная способности гуминовых веществ 76
ГЛАВА 4. Биологические свойства веществ гуминового ряда пелоидов 92
3.8 Коэффициент распределения гуминовых веществ в системе октанол вода 92
3.9. Кардиотоническая активность и влияние на вязкость крови гуминовых веществ 93
Заключение 96
Выводы 101
Список литературы
- Элементный состав, функциональные группы и свойства гумусовых кислот
- Получение субстанций гумусовых кислот пелоидов
- Инфракрасные спектры гуминовых веществ
- Кардиотоническая активность и влияние на вязкость крови гуминовых веществ
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из трудных проблем на пути создания и применения пелоидопрепаратов гуминового ряда является недостаточная изученность гумусовых кислот, обусловливающих терапевтическую эффективность пелоидов (Самугин Н М , Кривобоков Н Г , 1997) Одним из ведущих направлений развития исследовании является изучение физико-химических, биохимических основ действия гумусовых кислот в целях получения новых высокоэффективных пелоидопрепаратов, что имеет как общебиологическое значение в изучении закономерностей биотрансформации органических веществ, так и способствует увеличению доступности и эффективности пелоидотерапии, экономии истощающихся грязевых ресурсов и сохранению экологического равновесия биогеоценозов природных курортных зон
Установлено, что пеяоидопрепараты низкоминерализованных иловых сульфидных грязей относятся к IV классу токсичности, обладают противовоспалительной, антиоксидантной, иммуноферментной активностями (Агапов А И , 1999, Аввакумова Н П , 2003)
Известно, что пелоидопрепараты, не уступающие по эффективности синтетическим аналогам, являются более безопасными (Аввакумова Н П , 2003)
Цель исследования - выявление закономерностей в изменении физико-химических и химико-фармацевтических свойств в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей
Задачи исследования
-
Получить препараты гуминовых, гиматомелановых, фульвокислот и суммарного препарата низкоминерализованных иловых сульфидных грязей курорта федерального значения «Сергиевские минеральные воды»
-
Исследовать состав и структурные фрагменты пелоидопрепаратов гуминового ряда с применением как классических, так и современных методов исследования (ЭПР-, ЯМР-спекгроскопия)
-
Изучить кислотно-основные свойства, осадительную и комплексообразо-вательную способности и определить коэффициенты распределения гуминовых веществ
4 Охарактеризовать потенциальную кардиотоническую активность и влия
ние на вязкость крови препаратов гуминового ряда в модельных опытах
Научная новизна. Впервые с использованием современных методов ис
следования проведено сравнительное изучение совокупности свойств гумино
вых, гиматомелановых, фульвокислот и суммарный препарата, то есть ряда, на
основе которого можно получить большое количество биологически активных веществ с разнообразными функциями
Зафиксировано активирование кислотно-основных, комплексообразова-тельных свойств в результате разработанной технологии получения пелоидопрепаратов по сравнению с исходным суммарным органическим веществом
Впервые установлены потенциальное кардиотоническое действие и влияние на вязкость крови в опытах т vitro
Практическая значимость работы Комплекс сведений о пелоидопре-паратах гуминового ряда, полученных в ходе исследования, создает основу для дальнейшего получения новых пелоидопрепаратов и разработки методов стандартизации субстанций гуминовых веществ и оценки их потенциальной эффективности
Получен патент № 2241471 Суппозитории для лечения хронического простатита от 10 12 2004 г
Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе
" кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии
ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (акт внедрения от 12 09 2007 г), кафедры фармацевтической технологии ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (акт внедрения от 12 09 2007 г)
Положения, выносимые на защиту:
-
Пелоидопрепараты, полученные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей озера Молочка, относятся к классу гуминовых веществ по идентификационным критериям элементный состав, ИК-спектры, коэффициенты цветности
-
В ряду гуминовые, пшатомелановые, фульвокислоты и суммарное органическое вещество низкоминерализованных пелоидов наблюдается периодически непрерывное, закономерное изменение состава и характеристических структурно-функциональных свойств
-
Гумусовые кислоты обладают хелатирующей способностью и являются своеобразными матрицами-носителями для введения в организм биологически активных компонентов, например, ионов биогенных элементов
-
Вещества гуминового ряда пелоидов потенциально могут являться высокоэффективными препаратами с разнообразным терапевтическим действием
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (г Санкт-Петербург, 2005 г), X Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (г Самара, 2005г ), VI Всероссийском съезде физиотерапевтов (г Санкт-Петербург, 2006 г )
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (Государственная регистрация № 01200405620)
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы, приложения Библиографический указатель включает 188 источников, в том числе 32 на иностранном языке Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 44 рисунка
Элементный состав, функциональные группы и свойства гумусовых кислот
Биосферные гуминовые вещества представляют собой макрокомпоненту органических веществ почвенных [71, 5, 105, 104], водных экосистем [20], твёрдых горючих ископаемых [40, 179, 36], пелоидов [15, 147, 3, 2].
До настоящего времени не существует единого мнения о химической природе гуминовых веществ. Ряд исследователей рассматривают их как продукт превращения лигнина (Trigo С, Ball A.S., 1994), другие считают гуминовые вещества результатом синтеза из фенолов и дубильных ве-ществ[68]. Гуминовые вещества были впервые выделены из торфа немецким ученым Ф. Ахардом [156] в 1786 году и уже более 200 лет изучаются учёными разных стран. Много внимания гуминовым веществам уделил великий шведский химик Я. Берцелиус, который в «Учебнике химии» («Lehrbuch der Chemie», 1839) посвятил им несколько разделов, описав не только состав и происхождение этих соединений, конечно, в соответствии с воззрениями позапрошлого века, но и дал подробную характеристику их взаимодействия с катионами металлов. Характерно, что если в XIX веке классические химики много писали о гуминовых кислотах, гумине, крено-вых и апокреновых кислотах (последние теперь называют фульвокислота-ми), то в современных руководствах по органической химии и химии при 10 родных соединений о них практически не упоминается. В последние годы прошлого столетия большой вклад в изучение гуминовых веществ внесли русские и советские учёные, преимущественно, почвоведы: И.В. Тюрин, М.М. Кононова, С.С. Драгунов, Л.Н. Александрова, Д.С. Орлов; многие исследователи зарубежных стран, в их числе В. Фляйг (ФРГ), Ф. Дюшофур . (Франция), Т. Хаяси (Япония), М. Шнитцер (Канада), Ф. Стевенсон (США), М.Х.Б. Хейес (Англия) и др. В нашей стране исследование гуминовых веществ осуществлялось в рамках вопросов почвоведения, химии горючих ископаемых и гидрохимии, биогеохимии. К числу таких исследований относятся работы Г.М. Варшал (1993,1999), изучавшей гумусовые кислоты водных экосистем, исследования Л.П. Шустова (1996,1999), А.И. Агапова (1999), Н.П. Аввакумовой (2003), посвященных гуминовым веществам пелоидов. Главная особенность образования гуминовых веществ пе-лоидов заключается в том, что они образуются в резко восстановительных условиях со специфическим набором микроорганизмов, характерных для данных сульфидсодержащих отложений. К настоящему времени разработаны методы выделения гуминовых веществ из большинства природных. объектов, определены их химический состав, важнейшие свойства, изучено влияние на почвы, растения, микроорганизмы, рыб, животных.
Все гуминовые вещества образуются в результате постмортального (посмертного) превращения органических остатков. Превращение органических остатков в гуминовые вещества получило название процесса гумификации. Он идет вне живых организмов, как с их участием, так и путем чисто химических реакций окисления, восстановления, гидролиза, ком-плексообразования, конденсации и др. В отличие от живой клетки, в которой синтез биополимеров осуществляется в соответствии с генетическим кодом, в процессе гумификации нет какой-либо установленной программы, поэтому могут возникать любые соединения, как более простые, так и более сложные, чем исходные биомолекулы. Образующиеся продукты вновь подвергаются реакциям синтеза или разложения, и такой процесс идёт практически беспрерывно [15, 20].
Гуминовые вещества выполняют в биосфере множество функций, из которых важнейшими являются протекторная (защитная), аккумулятивная, транспортная, регуляторная, физиологическая [35, 105, 104].
Суть протекторной функции заключается в способности гуминовых веществ связывать в малоподвижные или труднодиссоциирующие соединения токсичные и радиоактивные элементы, а также соединения, негативно влияющие на экологическую ситуацию в природе, в том числе они могут инкорпорировать некоторые пестициды, углеводороды, фенолы. Защитная функция гуминовых веществ настолько велика, что богатые ими биообъекты могут полностью предотвратить поступления в грунтовые воды ионов свинца и других токсических веществ [105].
Физиологическая функция заключается в том, что гуминовые вещества, особенно гуминовые кислоты и их соли, могут стимулировать прорастание семян, активизировать дыхание растений, повышать продуктивность крупного рогатого скота, птицы. Более того, было показано, что некоторые препараты гуминовых веществ сдерживают развитие злокачественных новообразований, повышают устойчивость организмов к различного рода воспалительным процессам [105, 104].
Выше перечислены далеко не все функции, которые выполняют гуминовые вещества в природных средах, но приведенных примеров достаточно, чтобы подчеркнуть не только исключительно важную, но и поистине незаменимую роль гуминовых веществ в биосфере.
Объяснение функций невозможно без знания механизмов и природы взаимодействий гуминовых веществ с различными соединениями и без представления о строении этих сложных макромолекул и их структурных составляющих. Молекулярное строение гуминовых веществ и механизмы их образования очень тесно связаны. Эти вещества относятся к соединениям переменного состава, поскольку формируются в различных природных условиях, из разных структурных предшественников. Несмотря на то, что гумусовые кислоты высокомолекулярны, их нельзя отнести к полимерам в строгом смысле слова: в их структурных составляющих нет регулярности [112].
Большинству исследователей гуминовые вещества представляются соединениями, отдельные структурные "блоки" которых связаны друг с другом мостиками через углерод и кислород, а также посредством алифатических цепочек. Важными структурными единицами являются кольца, как конденсированные, так и неконденсированные, несущие кислород- и азотсодержащие функциональные группы. С кольцами связаны также различные алифатические структуры [35, 178, 177,].
Сложность строения этих веществ достаточно хорошо отражает модель структурного фрагмента гумусовых кислот почв, опубликованная в 1970 году Д. Кляйнхемпелем (рис.1).
Как видно из данного рисунка, гумусовые кислоты по своей химической структуре являются нерегулярными сополимерами ароматических оксиполикарбоновых кислот с включениями азотсодержащих и углеводных фрагментов. Указанное строение - наличие каркасной части, т.е. ароматического углеродного скелета, замещенного алкильными функциональными группами, среди которых преобладают карбоксильные, гидро-ксильные и метоксильные, и периферической части, содержащей полиса-харидные и полипептидные фрагменты, - является общим для гуминовых веществ всех источников происхождения.
Получение субстанций гумусовых кислот пелоидов
Нативную грязь декальцировали и десульфировали 2М раствором хлороводородной кислоты без термического воздействия с целью предотвращения деструкции органических веществ. Ежесуточно производили замену растворителя до отрицательной реакции на ионы кальция (проба с аммония оксалатом), ионы железа (III) (проба с калия тиоцианатом), карбонат-ионы (проба с кальция хлоридом), сульфид-ионы (проба с меди хлоридом), после чего осадок обрабатывали горячей водой с последующей декантацией и промыванием дистиллированной водой до отрицательной реакции на хлорид-ионы (проба с серебра нитратом).
С целью получения более чистых препаратов извлечение специфиче-ких органических веществ проводилась 0,5М раствором натрия гидроксида (Орлов Д.С., 1990) в соотношении пелоид - растворитель 1:10 не более трех раз, так как в последующих порциях количество минеральных компонентов значительно возрастает. На данной стадии получали экстракт, содержащий сумму натриевых солей гумусовых кислот. С целью его перевода в Н-форму полученный раствор пропускали через катионит КУ-2. Полноту ионного обмена контролировали по постоянству значений рН раствора элюэнта. Препарат доводили до воздушно-сухого состояния при температуре 35-40С с использованием принудительной вентиляции. Получили гумусовые кислоты - черные чешуйки без запаха.
Для дальнейшего фракционирования специфических органических веществ к щелочному экстракту добавили 50%-ный раствор серной кислоты до рН=1 (по универсальному индикатору). Смесь оставляли на 20 часов для полноты осаждения. Надосадочную жидкость, содержащую фульво-кислоты, декантировали, отфильтровывали, переводили в адсорбированное состояние на активированном угле марки БАУ, после чего проводили очистку по методике Форсита (Forsyth W.G.L.,1947). Фульвокислоты снимали с угля 0,5М раствором натрия гидроксида и переводили в Н-форму с использованием катионита КУ-2 при контроле постоянства рН. Препарат вы 37 сушивали при температуре не выше 37 С в тонком слое с использованием принудительной вентиляции. Готовый продукт представляет собой бурые чешуйки.
Осадок суммы гуминовых и гиматомелановых кислот после извлечения фульвокислот промывали на фильтре дистиллированной водой до отрицательной реакции на сульфат-ионы (проба с бария хлоридом). Далее проводили исчерпывающее экстрагирование 96 % этанолом до бледно-желтого окрашивания экстрагента. Полученная фракция представляла собой спиртовой раствор гиматомелановых кислот. После отгонки под вакуумом максимально возможного количества растворителя высушенный остаток гиматомелановых кислот переводили в натриевую форму путем растворения в ОДМ растворе натрия гидроксида и осаждали, добавляя 50%-ную серную кислоту до значения рН =1-2. Остав ляли на 18-20 часов с целью более полного осаждения. Для очистки препарата от минеральных примесей переосаждение повторяли дважды. После препарат переводили в Н-форму с использованием катионита КУ-2 при контроле постоянства рН и высушивали при температуре 35-40С в тонком слое с использованием принудительной вентиляции. Полученный продукт представляет собой черные чешуйки со слабым запахом.
Остаток на фильтре, полученный после экстракции гиматомелановых кислот, представляет собой гуминовые кислоты, составляющие основную часть гумусовых кислот. Его растворяли в минимально достаточном количестве 0,02М раствора натрия гидроксида, затем осаждали 50%-ным раствором серной кислоты. Для получения низкозольного препарата переосаждали дважды, после чего щелочной раствор пропускали через катио-нит и высушивали (гуминовые кислоты).
Определение углерода, водорода и азота проводили на анализаторе фирмы «Карло Эрба» модели 1106 при температуре 1010 С при постоян ном потоке гелия, доокисление проводили оксидом хрома (3). Последую щее восстановление осуществлялось медью при 650 С, после чего компо ненты разделялись хроматографически (Т=1000 С). Количество кислорода в образцах рассчитывали по разности. По результатам элементного анализа определяли степень окисленно-сти и бензоидности в ряду гумусовых кислот расчетным путем. Степень окисленности (W) гумусовых кислот пелоидов рассчиты вали по формуле: W=_2[O]-[H] И (і) где W - степень окисленности, [ ]- концентрация соответствующего элемента в мольных процентах. Степень бензоидности (а), которая показывает отношение углерода бензоидных фрагментов к общему количеству углеродных атомов, выраженное в процентах (Орлов Д.С. с соавт, 1987), определялась по следующей формуле:. Ct — L/бенз. ал. бенз) где С бенз. общ. алиф) а- степень бензоидности; С бенз. -содержание углерода бензоидных фрагментов; С алиф. - содержание углерода алифатических фрагментов; С общ. - общее содержание углерода. Содержание алифатического углерода рассчитывали по уравнению регрессии С алиф. = 95,5 - 246,71 X , где X - коэффициент экстинкции 0,001%-ного раствора гуминовых веществ при длине волны 465 нм, толщине кюветы 1 см. Определение зольных элементов проводили на атомно-абсорбционном анализаторе «Спектр -5-3» (рис. 6) (ОАО «Союзцветметав-томатика») на базе предприятия ЗАО «Плазтекс» г.Самара. В качестве стандартов были использованы растворы эталонов - ГСО соответствующих элементов: Fe, Mn, Си, Со, Si, Al. Определение содержания зольных элементов проводили по калибровочному графику.
Инфракрасные спектры гуминовых веществ
Площадь под кривой поглощения прямо пропорциональна количеству парамагнитных частиц в исследуемом образце. На практике провести вычисление абсолютного содержания в образце количества парамагнитных частиц с разумной точностью очень трудно и поэтому выполняется сравнение исследуемого образца со стандартом, содержащим известное заранее число парамагнитных частиц.
Общепринятым стандартом для таких измерений является дифенилпик-рилгидразил (C6H5)2N-N-C6H5(N02)3, который на 100% состоит из радикалов.
Минимальное количество парамагнитных частиц содержится в фульво-кислотах, являющихся наименее конденсированными и обладающих минимальной молекулярной массой среди представителей данного ряда веществ, в то время как концентрация их в гиматомелановых кислотах превышает в 9 раз и достигает максимального значения у гуминовых кислот, где их концентрация по сравнению с фульвокислотами возрастает в 13 раз. Концентрация свободных радикалов в суммарном препарате занимает промежуточное значение и определяется, в основном, содержанием гуминовых кислот, являющихся здесь преобладающей фракцией.
Присутствие металлов, безусловно, влияет на количество парамагнитных частиц, но в данных соединениях не является определяющим, так, например, препарат фульвокислот, минерализация которого близка к 30 %, содержит минимальное значение парамагнитных частиц.
Таким образом, с помощью метода электронного парамагнитного резонанса можно определить количество свободных радикалов в веществе, что позволяет прогнозировать степень выраженности его антиоксидантных свойств.
Кислотно-основные свойства гуминовых веществ, как полифункциональных амфолитов, обусловлены кислородсодержащими функциональными группами - карбоксильными - СООН, которые титруются в интервале рН 3-8, фе-нольными и некоторыми спиртовыми (рН 8-12). Результаты потенциометрического титрования приведены на рисунках
Кривые титрования гуминовых и гиматомелановых кислот схожи и отличаются от фульвокислот и суммарного препарата меньшей крутизной, отсутст 74 виєм выраженных перегибов. Различия дифференциальных кривых гуминовых и гиматомелановых кислот появляются после рН=6,5. Но возможно выделить одинаковые для гуминовых и гиматомелановых кислот кислотные функциональные группы с рКі=4,0; рК2=5,4; рК3=7,25 отличающиеся с рК4=8,5 для гиматомелановых и с рК4=8,8 и рК5=9,3 для гуминовых кислот.
Количественное содержание кислотных групп в соответствии с силовыми показателями представлено в таблице 9.
Как и следовало ожидать, наиболее выражены кислотные свойства у фульвокислот, где преобладающей группой является - СООН с рК=6,0, с содержанием 63,6%. Суммарный препарат титруется как трехосновная кислот; наименьшее количество кислотных групп и более равномерное распределение по количественному содержанию в соответствии с рК. Преобладающей является группа с рК=7,0 (42,8%).
Гуминовые кислоты титруются как пятиосновные, а гиматомелановые, как четырехосновные. Ведущими у них являются группы с рК=7,25 с содержанием 44,4 % и 52,9% соответственно. Что примечательно, гуминовые и гиматомелановые кислоты содержат небольшое количество более сильных кислотных групп, чем у фульвокислот (с рК]=4,0 и рК2=5,4). У гуминовых кислот представлены и наиболее слабая кислотная группа с рК=9,3, вероятно, из числа фе-нольных.
Потенциометрическое титрование не позволяет определить полное содержание гумусовых кислот из-за особенностей их строения, как полимеров. Для получения представления о том, насколько могут отличаться эти данные, нами была использована классическая баритовая методика.
Оказалось, что содержание -СООН и -ОН групп, определенное потен-циометрически, составляет для гуминовых кислот 39,4%, для гиматомелано-вых - 50,7%, для фульвокислот - 23,0%, для суммарного препарата — 46,0% от данных баритовой методики. В суммарном органическом веществе индивидуальные компоненты находятся в «связанном» состоянии, когда функциональные группы неактивны, в процессе выделения этих веществ происходит активирование данных групп, чем и объясняются результаты таблицы 10.
В результате проведенных исследований было выявлено, что динамика процесса осаждения в ряду гуминовых веществ сходный характер (рис .22).
Из графика видно, что быстрее осаждаются такие токсичные ионы металлов, как свинец, хром, медь.
Динамика осаждения таких ионов металлов, как кальций, цинк, марганец, никель, кобальт носит сходный характер рис.
По результатам исследований было выявлено, что осаждение гуминовых и гумусовых кислот завершается к одному часу, в то время как гетерогенное равновесие металл — гиматомелановые кислоты устанавливается только по прошествии 24 часов. По этой причине измерения оптической плотности раствора над осадком проводилось по прошествии суток.
Результаты исследования по осадительной способности представлены в таблицах 11-13. Судя по данным таблицы из выбранного ряда ионов металлов, наибольшей осадительной способностью обладают ионы хрома и ионы свинца, о чем свидетельствует наименьшая величина пороговой концентрации. Напротив, для ионов серебра и магния данный показатель является максимальным. D t,4
Кардиотоническая активность и влияние на вязкость крови гуминовых веществ
Элементный состав, выраженный в массовых процентах, определяет принадлежность полученных препаратов к классу гуминовых веществ, но не дает представления о роли отдельных элементов в макромолекулах вещества, которое можно получить с помощью мольных процентов. В этом случае наблюдается изменение содержания водорода с 3,80% (масс.) до 34,5% (мольн.) у гуминовых кислот; с 7,56%) (масс.) у фульвокислот до 54,3% (мольн.); у гиматомелано-вых кислот с 6,50% (масс.) до 47,9% (мольн.). Эти данные показывают вклад водорода в структуру вещества и указывают на значительную развитость цепей, представленных алкильными радикалами. При переходе к мольным процентам изменяется и относительное содержание углерода. Наиболее обуглероженные по массовым процентам гиматомелановые кислоты (59,56) теперь уступают гу-миновым кислотам, в которых содержание становится более значительным (41,10 мольн.%). Из результатов анализа видно, что по степени увеличения обуглероженности гуминовые вещества располагаются в следующем ряду: фульвокислоты, гиматомелановые, гуминовые кислоты.
Соотношение Н/С для гуминовых кислот низкоминерализованных пелои-дов составляет 0,84, характеризуя их более высокую обуглероженность. Гуминовые кислоты оз. Б. Тамбукан, как оказалось, более обогащены периферическими алифатическими объектами; соотношение Н/С составляет 1,42. Соотношение водород/углерод для фульвокислот высокоминерализованных пелоидов достигает 1,75, что значительно ниже, чем в низкоминерализованных, где оно составляет 3,63. Соотношение водород/углерод для гиматомелановых кислот составляет 1,32, что свидетельствует о превалировании в их составе алифатических цепочек. По результатам элементного анализа органических веществ выделяется ярко выраженный окисленный характер фульвокислот со значением степени окисленности +0,20. Напротив, группа гиматомелановых кислот характеризуется явным преобладанием восстановительной природы, о чем свидетельствует значение степени окисленности -0,53. Объективной характеристикой гуминовых веществ является степень их бензоидности. Фульвокислоты представлены наименее полисопряженными, поликондесированными структурами, в которых степень бензоидности не превышает 7,0%. В гиматомелановых кислотах бензоидные структуры составляют 17 %. Наиболее развита полисопряженность в макромолукулах гуминовых кислот, у которых данный показатель составляет 36,3%.
Электронные спектры поглощения являются одним из диагностических принципов в изучении гуминовых веществ. Эти спектры мало специфичны из-за схожести: поглощение света растворами гуминовых веществ с увеличением длины волны убывает. Несмотря на это сходство, спектры различаются крутизной, что делает отношение Е4/Е6 идентификационным критерием, который не зависит от концентрации веществ и косвенно характеризует состав и структуру, а именно, степень ароматичности. Среднее значение коэффициента цветности фульвокислот составляет 6,81±0,02, что характеризует их слабо ароматические соединения в ряду гуминовых веществ. По сравнению с ними, большей ароматичностью обладают гиматомелановые кислоты со значением Е4/Е6 3,47±0,02. Минимальное значение данного показателя имеют гуминовые кислоты 2,42±0,01.
С целью изучения природы представителей гуминового ряда нами были поулучены ИК-спектры, анализ которых позволяет выявить как общие стороны специфических органических веществ пелоидов, так и отличительные, в том числе в сравнении с другими биосферными объектами. Гуминовые, гиматомелановые, фульвокислоты и суммарный препарат имеют однотипные спектры, свидетельствующие о родстве этих веществ друг с другом и с другими биосферными объектами, к примеру с гуминовыми кислотами торфа фирмы «Merck». Несмотря на сходства ИК- спектров, наблюдаются и различия. Фуль-воксислоты имеют максимальную интенсивность полос в области поглощения спиртовых гидроксилов и простых эфиров. Для гиматомелановых кислот характерно набольшая насыщенность метальных групп. Интенсивность полосы поглощения 1620-1600 см"1, характеризующая ароматическую структуру гуму 98 совых кислот, возрастает в следующей последовательности: фульвокислоты, суммарный препарат, гиматомелановые, гуминовые кислоты.
Сравнение ИК-спектров гуминовых кислот серноводских пелоидов и фирмы «Merck» позволяет выявить существенные различия при лишь самом общем сходстве.
На основании результатов экспериментального исследования элементного анализа, оптических свойств гуминовых веществ можно сказать, что группы специфических органических веществ характеризуются общностью строения и составляют по мере увеличения бензоидности ряд: фульвокислоты, гиматомелановые, гуминовые кислоты. В данном ряду закономерно изменяются обугле-роженность, ароматичность, электроно-донорные и электроно-акцепторные свойства. Поэтому идентификацию можно проводить по ИК-спектрам, по значению коэффициента цветности.
По литературным данным многие авторы связывают лечебный эффект гуминовых веществ с наличием в них свободных радикалов, поэтому нами были проанализированы их ЭПР-спектры. Возрастание количества свободных paдикалов происходит с увеличением сопряженных структур в макромолекулах.
Кислотно-основные свойства изучаемых препаратов гуминового ряда пелоидов есть следствие их полифункциональности. Согласно литературным данным макромолекулы гуминовых веществ содержат до 15 функциональных групп разной природы, в том числе кислотных. В процессе потенциометриче- ; ского титрования фульвокислоты титруются как двухосновные, суммарный препарат — как трехосновная, почти на порядок слабее фульвокислот; гиматомелановые - как четырехосновные, а гуминовые - как пятиосновные. Причем, гуминовые и гиматомелановые кислоты содержат более сильные - СООН группы, хотя и в меньшем количестве, нежели фульвокислоты.
Изучение осадительной способности гуминовых веществ ионами металлов показало, что данный процесс носит сходный характер для представителей выбранного нами ряда веществ. Равновесие в системе гуминовые кислоты — металл устанавливается через 1 час, в то время, как гиматомелановых кислот на 99 ступает через сутки, вследствие чего измерения проводили по прошествии суток. Нами было выявлено, что наибольшей осадительной способностью обладают ионы меди хрома и свинца. В меньшей степени она проявляется у серебра и магния. В связи, с чем, представляется возможность расширения фармакологического спектра действия пелоидопрепаратов на основе гумусовых кислот путем введения в них ионов металлов-биогенов (например, серебра и магния).
Комплексобразовательная способность гуминовых веществ, как ранее нами было отмечено, является фундаментальным свойством, обеспечивающим большинство функций этих веществ в биосфере. С помощью электрофореза на бумаге были получены данные о комплексообразовательной способности препаратов. Установлено, что гуминовые вещества образуют с ионами кобальта, меди, цинка комплексно-гетерополярные соли. При увеличении щелочности происходит активизация кислотных функциональных групп, принимающих участие в комплексообразовании, поэтому количество ионов металлов, связанных в составе анионного комплекса, увеличивается, что было количественно подтверждено. На основании как классических, так и современных методов исследования, в нашей работе дана разносторонняя количественная характеристика гуминовых веществ. На субмолекулярном уровне установлен элементный состав макромолекул представителей гуминовых веществ пелоидов, а также свойства, характеризующие структуру.
