Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Сведения о химическом составе и применении крыжовника отклоненного (grossulapja reclinata (l.) mill.) (обзор литературы) 11
1.1 Сведения о химическом составе крыжовника отклоненного (Grossularia reclinata (L.) Mill.) 11
1.2 Применение видов рода Grossularia Mill. в научной и народной медицине 18
Выводы по обзору и задачи собственных исследований 21
ГЛАВА 2. Изучение химического состава листьев крыжовника отклоненного (grossulapja reclinata (L.) mill.) 23
2.1 Обсуждение результатов 23
2.1.1 Биологически активные вещества в листьях крыжовника отклоненного 24
2.1.2 Содержание антиоксидантов в различных извлечениях из
2.1.3 Определение каротиноидов и хлорофилла 30
2.1.4 Определение органических кислот 32
2.1.5 Определение аскорбиновой кислоты 33
2.1.7 Определение фенольных соединений в листьях крыжовника отклоненного методом ВЭЖХ 35
2.1.8 Аминокислотный состав 37
2.1.9 Исследование дубильных веществ
2.1.10 Выделение полисахаридных комплексов 43
2.1.11 Количественное определение флавоноидов 45
2.2 Экспериментальная часть 49
2.2.1 Хроматографический анализ флавоноидов 49
2.2.2 Антиоксиданты 50
2.2.3 Каротиноиды и хлорофилл 52
2.2.4 Анализ фенольных соединений методом ВЭЖХ 53
2.2.5 Аминокислоты 54
2.2.6 Дубильные вещества 55
2.2.7 Количественное определение полисахаридов в сырье 58
2.2.8 Количественное определение флавоноидов в сырье 58
2.2.9 Валидация методики количественного определения флавоноидов 60
Выводы по главе 2 66
ГЛАВА 3. Выделение индивидуальных соединений из листьев крыжовника отклоненного и исследование свойств пектинов 68
3.1 Обсуждение результатов 68
3.1.1 Исследование индивидуальных соединений 76
3.1.2 Полисахариды
3.1.2.1 Определение степени набухания 96
3.1.2.2 Определение средней молекулярной массы биополимеров крыжовника отклоненного 97
3.1.2.3 Исследование сорбционной способности ПВ 102
Выводы по главе 3 109
ГЛАВА 4 . О фармакологической активности субстанции, полученной экстракцией спиртом этиловым 40% 110
4.1 Влияние 40К на физическую работоспособность и психо-эмоциональную стабильность мышей в условиях экспериментальных перегрузок 111
4.2 Нейропротекторная активность при ишемии мозга 115
4.3 Ранозаживляющее действие у животных с экспериментальным сахарным диабетом и одновременное влияния 40К на углеводный и липидный обмен 121
Выводы по главе 4 125
ГЛАВА 5. Показатели качества сырья листья крыжовника отклоненного (grossularia reclinata (l.) mill.) 126
5.1 Макро- и микроскопическое исследование крыжовника отклоненного 126
5.2 Определение числовых показателей сырья 136
5.3 Определение экстрактивных веществ 138
Выводы по главе 5 139
Заключение 140
Список литературы
- Применение видов рода Grossularia Mill. в научной и народной медицине
- Определение аскорбиновой кислоты
- Исследование индивидуальных соединений
- Нейропротекторная активность при ишемии мозга
Применение видов рода Grossularia Mill. в научной и народной медицине
Химический состав плодов крыжовника отклоненного во многом зависит от сорта, степени зрелости плода, климатических и почвенных условий его выращивания, в связи с чем, сведения о химическом составе крыжовника разноречивы.
В плодах крыжовника содержится около 10 % сахаров, а в десертных сортах – до 13% фруктозы и глюкозы.
Плоды крыжовника содержат: натрий – 23 мг/%, калий – 170 мг/%, кальций – 20 мг/%, магний – 9 мг/%, фосфор – 28 мг/%, железо – 1,6 мг/% и такой минеральный состав крыжовника способствует жизнедеятельности клеток и поддержанию кислотно-щелочного равновесия в организме человека. Они являются основным поставщиком легкоусвояемых солей железа, а по содержанию меди превосходят все ягодные культуры. Благодаря содержанию солей железа и фолиевой кислоты, крыжовник полезен при анемии и кровопотерях. Плоды содержат также молибден, столь необходимый для биосинтеза гемоглобина и обмена аминокислот [24,83,108].
Общее количество органических кислот в плодах достигает 2% (из них 1,3% яблочной, 0,4% – лимонной, 0,01% щавелевой). Они влияют на процессы пищеварения и мочевыделения, что способствует более активной элиминации из организма человека метаболитов эндогенных веществ, а также продуктов распада радиоактивных элементов. Незрелые плоды содержат также янтарную кислоту, которая увеличивает энергетические ресурсы человеческого организма [62,83,108].
По содержанию пектиновых веществ (до 1,5%) крыжовник является одним из лидеров среди плодовых растений. Пектин обладает активной комплексообразующей способностью к радионуклидам и тяжелым металлам. Данная особенность позволяет считать, что при регулярном применении плодов накопления вредных веществ в организме не происходит [75,76,77,87].
Количество витаминов в плодах крыжовника отклоненного приравнено к плодам цитрусовых: по содержанию витамина С (30-50 мг/%) крыжовник уступает только черной смородине и облепихе, причем в зрелом крыжовнике этого витамина в два раза больше [67,83]. В плодах крыжовника накапливаются Р-активные капилляроукрепляющие вещества, количество которых у зеленоплодных ягод составляет 200 мг/%, а у темноокрашенных сортов 750-800 мг/%. По содержанию Р-активных веществ крыжовник превосходит малину и многие сорта земляники: ежедневный прием 100 г темноокрашенных плодов крыжовника обеспечивает суточную потребность организма в витамине Р [48,49,83]. Р-активные вещества укрепляют стенки сосудов и предупреждают развитие атеросклероза [49,83,126]. В плодах обнаружены также -каротин, фолиевая кислота, витамин Е. Установлено, что высокий уровень содержания витаминов сохраняется долго [62,83]. Описано наличие кумаринов (1,5-3 мг/%), серотонина (1,8-3,8 мг/%), а также катехинов, антоцианов, флавоноидов [35,83]. Флавоноиды характеризуются антирадикальной активностью, чем и обусловлены противоопухолевое, антиишемическое, антиаллергическое, противовоспалительное и другие виды фармакологических свойств [8,9,85]. Содержание антоцианов коррелирует с окраской плодов: больше всего их содержится в темноокрашенных плодах, меньше - в красных и еще меньше - в зеленых [37,85].
Сведения о химическом составе различных органов крыжовника представлены следующими биологически активными соединениями: Листья: S астрагалин; катехин, галлокатехин [87]; яблочная, лимонная, винная, янтарная кислоты [87,107]. Плоды: инвертные сахара - 4,67%; сахароза - 0,41%; вода - 85,4%; свободные кислоты -1,9% (яблочная, лимонная, винная, незрелые ягоды содержат также янтарную); пектиновые вещества - 1,13%; сырая клетчатка - 3,5% [62,67,77,87]; витамины С (30-60 мг в 100 г сока), Bь Р, -каротин [49,83,87]; витамин Е [35,62]; дубильные вещества – 0,089% [83,87]; антоцианы (в зрелых темно-окрашенных ягодах до 750 мг/100 г антоцианов, в красных – до 300) и флаваны [35,62]; фолиевая и пантотеновая кислоты (незначительные количества); серотонин (1,8-3,8 мг/%) [49,87,107]; минеральные элементы – 23 мг натрия, 170 мг калия, 20 мг кальция, 9 мг магния, 28 мг фосфора и 1,8-4,6 мг железа на 100 г [24,49,83,107]; катехин, галлокатехин [17,62,87]; флавоноиды – мирицетин, кверцетин, кемпферол [62,87]; лейкоцианидин, лейкодельфинидин [87,108].
Определение аскорбиновой кислоты
Примечание: – максимальное количество антиоксидантов в соответствующем сырье выделены полужирным курсивом [2]; I – спирт этиловый 95%, II – спирт этиловый 70%, III – спирт этиловый 40%, IV – вода очищенная.
Из данных таблицы 3 следует, что в извлечении, полученном из листьев крыжовника отклоненного (сорт «Московский красный») 40% спиртом этиловым, суммарное содержание антиоксидантов максимальное, и это явилось основанием для выбора спирта этилового 40% в качестве оптимального экстрагента при получении субстанций и последующего их исследования.
Качественную оценку содержания этих соединений в листьях крыжовника осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Хроматографический анализ хлорофиллов поводили в системе растворителей: хлороформ – спирт этиловый 95% (19:1), каротиноидов – в системе: гексан – бензол (29:1) [19,113,114]. Более подробные данные представлены в разделе 2.2.3. Количественное содержание определяли спектрофотометрически [19,69]. Результаты представлены в таблицах 4, 5 и на рисунках 2, 3. Таблица 4 – Содержание каротиноидов в листьях крыжовника отклоненного № Навеска сырья, г Оптическая плотность Сумма каротиноидов% Метрологические характеристики 1 0,9996 0,512 0,021 х - 0,02 є - 3,62% Sx = 0,0003 Ах = 0,0008 2 1,0012 0,533 0,022 3 1,0009 0,526 0,022 4 0,9989 0,510 0,021 5 1,0041 0,539 0,023 6 1,0036 0,537 0,022 Содержание каротиноидов в пересчете на Р-каротин составляет 0,02±0,0008%. н 0,7 -в 0,6 " 0,5 -0! 0,4 -w 0,3 -В 0,2 -О 0,1 0370 390 410 430 450 470 490 510 530 55Длина волны, нм Рисунок 2 – УФ-спектр гексанового извлечения из листьев крыжовника Таблица 5 – Содержание хлорофилла в листьях крыжовника отклоннного (в % на абсолютно сухое сырье) №12 3 4 5 6 Навеска сырья, г Оптическая плотность Содержаниехлорофилла,% Метрологические характеристики 1,0126 0,9312 0,106 = 0,11 є = 3,62% S = 0,0015 Ах = 0,0040 1,0012 0,9876 0,114 1,0145 0,9886 0,112 1,0178 0,9207 0,104 1,0234 0,9715 0,109 1,0187 0,9789 0,111 Содержание хлорофилла в сырье составляет 0,11±0,0040%. 1,2 -і w 1 о 0,8 0! 0,6S 0,4 0,20 59 0 610 630 650 670 690Длина волны, нм Рисунок 3 – УФ-спектр извлечения, полученного экстракцией листьев крыжовника отклоненного спиртом этиловым 80% Таким образом, в результате исследования обнаружено содержание каротиноидов и хлорофилла в листьях крыжовника отклоненного (сорт «Московский красный»).
Обнаружение органических кислот проводили методом ТСХ на пластинках «Сорбфил» с использованием стандартных образцов (СО), в качестве ПФ использовали: спирт этиловый 95% – концентрированный раствор аммиака (16:4,5), проявителем служил раствор бромкрезолового зеленого [34,44]. Органические кислоты проявились в виде желтых пятен на зелено-синем фоне. В листьях крыжовника отклоненного обнаружены яблочная, янтарная, винная и лимонная кислоты. Количественное содержание органических кислот определяли титриметрически согласно ГФ XI [32]. Результаты исследования представлены в таблице 6. Таблица 6 – Содержание органических кислот в листьях крыжовника № Навеска сырья, г Объемтитранта,мл Содержаниеорганическихкислот, % Метрологические характеристики 1 25,0016 4,49 3,27 = 3,38 = 3,83 % S = 0,0504 х = 0,1294 2 25,0190 4,91 3,57 3 25,0092 4,71 3,43 4 25,0076 4,47 3,25 5 25,0023 4,74 3,45 6 25,0978 4,57 3,32 Из данных, представленных в таблице 6, следует, что суммарное содержание органических кислот в листьях крыжовника отклоненного составляет 3,38±0,1294%.
Определение аскорбиновой кислоты в листьях крыжовника отклоненного осуществляли хроматографически с использованием метода ТСХ на пластинках «Сорбфил» с ПФ: этилацетат – ледяная уксусная кислота (80:20), проявитель – 0,04% раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в воде. Аскорбиновая кислота проявляется в виде белого пятна на розовом фоне [11,34,114]. Количественное содержание аскорбиновой кислоты определяли титриметрическим методом ГФ XI [32]. Полученные результаты приведены в таблице 7.
Определение элементного состава проводилось в Центральной Испытательной Лаборатории при ФГУП Кавказгеолсъемка по методике предприятия МП 4-С: это полуколичественный метод спектрального анализа минерального сырья из кратера угольного электрода в плазме электрической дуги переменного тока (ДГ-2). Для получения спектра использовали кварцевый спектрограф ДФС-8-1 (Россия) [33,43].
Установлено, в извлечении, полученном из листьев крыжовника отклоненного спиртом этиловым 40%, количественно преобладают калий (3,0%), кальций (0,3%), магний (0,5%) и фосфор (1,0%).
Полифенольный состав листьев крыжовника отклоненного определяли методом ВЭЖХ. С этой целью получали извлечение из листьев крыжовника экстракцией спиртом этиловым 40% (кратность экстракции – 3). Извлечения объединяли, спирт отгоняли под вакуумом до объема 25 мл и далее подвергали детектированию. Обнаружено 23 вещества, из которых идентифицировано 13 соединений (по количеству имеющихся в наличии СО) полифенольной природы. Они представлены флавоноидами, кумаринами и фенолкарбоновыми кислотами. Результаты проведенных исследований приведены на рисунке 4 и в таблице 9. Впервые установлено наличие витексина, изовитексина, хлорогеновой, цикоревой и феруловой кислот [79].
Исследование индивидуальных соединений
Осаждение дубильных веществ в 50 мл полученного извлечения осуществляли 1% раствором желатина в 10% растворе натрия хлорида. Выпадал осадок. Фильтрат объемом 25 мл переносили в колбу вместимостью 1000 мл, куда добавили 500 мл воды и 25 мл раствора индигосульфокислоты, после чего титровали при перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания раствора.
Содержание других окисляющихся веществ (X2) рассчитывали по той же формуле [33], но в ней вместо V использовали значение V2 – объем 0,02 М раствора калия перманганата, израсходованного на титрование извлечения после осаждения дубильных веществ, мл. Содержание дубильных веществ (X3), найденных перманганатометрически в сочетании с методом осаждения находили по формуле 4: X3 = X1 - X2, (4) где: X1 – общее содержание веществ, окисляющихся при титровании раствором калия перманганата; X2 – содержание других окисляющихся веществ [86,91,96]. Спектрофотометрическое определение дубильных веществ
Анализ осуществляли по методике [86,91]. Качественная реакция с 1%-ным раствором железа (III) хлорида указывает на преобладание в извлечении из листьев крыжовника отклоненного конденсированных танинов (окрашивание раствора в черно-зеленый цвет).
УФ-спектр раствора водного извлечения из листьев крыжовника отклоненного практически идентичен спектру танина и имеет максимум поглощения при длине волны 277 нм. Раствором сравнения служила вода очищенная, в качестве CO использовали танин, который в УФ-спектре имеет максимум поглощения 277 нм (рисунок 7).
2 мл полученного извлечения переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили до метки водой очищенной. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны от 275 до 277 нм относительно воды очищенной. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора СО танина (Sigma Aldrich) [52,86,104]. Далее готовили раствор СО танина [86].Суммарное содержание дубильных веществ в пересчете на воздушно-сухое сырье (X4, %) определяли по формуле (5): х , (5) А а ст х ст где: aст и ax – навеска СО танина и навеска сырья соответственно, г; Аст и Аx – оптическая плотность раствора СО танина и анализируемого раствора соответственно; Wст и Wx – объемы мерных колб, использованных для разведения навесок СО танина и анализируемого образца соответственно, мл; Vст и Vх – аликвоты растворов СО и анализируемого образца соответственно, мл; W – влажность, %. Выделение ВРПС, ПВ, Гц А и Гц Б осуществляли согласно методике [60,65,81]. Далее с целью установления моносахаридного состава полученные фракции подвергали гидролизу 10% раствором кислоты серной при 100С в течение 10 часов для ВРПС и в течение 48 часов для остальных полисахаридных комплексов [28,98,109,118].
Моносахариды идентифицировали методом восходящей БХ (бумага марки MUNKTELL Chrom. – Paper Sheets Grade. FN 7 (Германия)) путем сравнения с СО. В качестве ПФ применяли БУВ (4:1:5) и пиридин – этилацетат – вода (1:2:2). Проявитель – анилинфталатный реактив и 1% раствор резорцина в этаноле с 2М кислотой соляной (1:9) [50,78,97,99,109].
Содержание суммы флавоноидов в листьях крыжовника отклоненного определяли по следующей методике [33]. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл спирта этилового 40%, содержащего 2,0 мл хлористоводородной кислоты 10%. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. После охлаждения полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, так чтобы частицы сырья не попали на фильтр. Экстрагирование повторяют дважды в описанных выше условиях. Извлечения фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу. После охлаждения объем доводят спиртом 40% до метки и перемешивают (раствор А).
2,0 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл алюминия хлорида спиртового раствора 2%, 0,15 мл хлористоводородной кислоты раствора 10% и доводят объем раствора спиртом этиловым 40% до метки (раствор Б). Через 30 мин измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 432 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2,0 мл раствора А, 0,15 мл хлористоводородной кислоты раствора 10% и доведенный спиртом этиловым 40% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Примечание. Приготовление раствора СО кверцетина: около 0,01 г (точная навеска) кверцетина, предварительно высушенного при температуре 130-135С в течение 3 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в минимальном количестве спирта этилового 95%, доводят объем раствора спиртом этиловым 40% до метки и перемешивают. Для последующего измерения 1 мл полученного раствора СО переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл алюминия хлорида спиртового раствора 2%, 0,15 мл хлористоводородной кислоты раствора 10% и доводят объем раствора спиртом этиловым 40% до метки и оставляют на 30 мин.
Нейропротекторная активность при ишемии мозга
Результаты изучения влияния 40К на физическую работоспособность и психо-эмоциональную стабильность мышей в условиях экспериментальных перегрузок, изложенные ниже, получены в ходе исследований, проведенных на кафедре фармакологии с курсом клинической фармакологии ПМФИ – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России под руководством доктора медицинских наук Андрея Владиславовича Воронкова.
Под руководством профессора, доктора медицинских наук, член. корр. РАН Ивана Николаевича Тюренкова на базе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России была изучена нейропротекторная, антигипергликемическая и ранозаживляющая активности.
Примечание: участие автора при выполнении фармакологических исследований заключалось в подготовке проб, наблюдении за поведением подопытных животных, а также обсуждении и интерпретации полученных результатов.
В контрольной группе мышей без фармакологической коррекции время плавания достоверно сократилось на 25,28% относительно исходных данных, что соответствует раннее полученным результатам [26,46,90]. В группе мышей, получавших извлечение из листьев крыжовника отклоненного, время плавания достоверно увеличилось на 222,81% относительно исходных результатов, а также было выше аналогичных значений контрольной группы на 342,00% (рисунок 37). Полученные результаты могут свидетельствовать о способности изучаемого 40К препятствовать физическому истощению и снижению работоспособности на фоне длительных физических нагрузок [21].
Влияние 40К на продолжительность плавания мышей в условиях физических и психо-эмоциональных перегрузок Примечание: 0 – р 0,05 относительно исхода, 00 – р 0,01 относительно исхода; 000 – р 0,001 относительно исхода; – р 0,05 относительно контроля, – р 0,01 относительно контроля; – р 0,001 относительно контроля В тесте «открытое поле» у животных контрольной группы наблюдалось достоверное снижение относительно исходных данных двигательной (на 25,22%) и исследовательской активности (число заглядываний на 77,46%, число стоек на 52,11%). В этой же группе мышей повышалось психо-эмоциональное напряжение, судить о котором можем по снижению времени, проведенного в центральных квадратах на 69,58%, тогда как изменений показателей груминга и количества болюсов отмечено не было.
В группе мышей, получавших 40К, в тесте «открытое поле» не было достоверного изменения поведенческих реакций относительно исходных значений. При этом стоит отметить, что в группе животных, получавших 40К изменения показателей «груминг» и «количество болюсов» не было. Это может свидетельствовать о сохранении психо-эмоционального статуса в условиях экспериментальных перегрузок (рисунок 38, 39).
Влияние 40К на психо-эмоциональный статус мышей в тесте «Открытое поле» после длительных физических и психо-эмоциональных перегрузок Примечание: 0 – р 0,05 относительно исхода. В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» в контрольной группе мышей по сравнению с исходными данными достоверно увеличилось время, проведенное в закрытых рукавах на 15,82%, тогда как время, проведенное в центральном квадрате, достоверно уменьшилось на 75,73%, а в открытые рукава мыши не заходили. Стоит отметить, что у этой же группы животных, по сравнению с показателями первого тестирования, достоверно снизились исследовательская активность (количество стоек) на 60,53% и двигательная активность (число переходов) – на 56,66%. Это может свидетельствовать об угнетении когнитивной функции мозга и повышении психо-эмоционального напряжения после перенесенных нагрузок, что согласуется с ранее полученными данными [26].
В группе мышей, получавших 40К, достоверных отличий между исходными значениями и данными, полученными в конце эксперимента, не было. Это коррелирует с результатами, полученными в тесте «открытое поле» и может указывать на то, что введение 40К сохраняет стабильный эмоциональный статус на фоне экспериментальных перегрузок (таблица 41).
В эксперименте были использованы мыши самцы массой 25-30 г. Животные были рандомизированы по времени плавания и двигательной активности в тесте «открытое поле», после чего разделены на три группы по 10 мышей в каждой. Первая группа – контрольная. Животным этой группы, вводили воду очищенную. Второй группе мышей вводили 40К в дозе 200 мг/кг. Извлечение и воду очищенную вводили интрагастрально в эквивалентном объме за 60 мин до принудительного плавания ежедневно в течение всего эксперимента.
Экспериментальная модель дезадаптации была построена на 10-дневном принудительном плавании [26,90] с нагрузкой 15% от веса каждого животного до полного истощения и отказа борьбы за жизнь, после чего животные извлекались из воды. Длительность плавания фиксировалась. До плавания и на следующий день после окончания 10-дневного плавания проводили тесты «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» [21,89,93]. Срыв адаптационных механизмов определяли по снижению локомоторной, исследовательской и психо эмоциональной активности, а сохранение этих показателей рассматривали как возможное сохранение физической работоспособности и психической стабильности. Результаты обрабатывали методом вариационной статистики. Межгрупповые различия анализировались параметрическими или непараметрическими методами, в зависимости от типа распределения. В качестве параметрического критерия использован критерий Стьюдента. В качестве непараметрического критерия – U-критерий Манна-Уитни. Различия определены при р 0,05 уровне значимости. Для статистической обработки результатов использовали пакет программ «StatPlus 2009».