Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время продолжают
оставаться актуальными исследования по созданию лекарственных средств
растительного происхождения, характеризующихся низкой токсичностью,
достаточной фармакологической эффективностью и широтой терапевтического действия в сочетании с относительной безопасностью и возможностью длительного применения. В связи с этим интерес представляют растения, содержащие полифенольные соединения, которые опосредованно через ферментные системы регулируют окислительно-восстановительные процессы, определяющие состояние клеточной мембраны. С этой точки зрения бархатцы распростертые (Tagetes patula L.) представляют собой сырьевой источник с богатым и разнообразным составом полифенолов. Настои и отвары бархатцев широко используются в народной медицине в качестве антимикробных, гипотензивных, гепатопротекторных и мочегонных средств.
Благодаря своей неприхотливости, бархатцы распростертые широко
интродуцированы во многих эколого-географических районах России, а
селекционерами созданы многочисленные сорта, отличающиеся высотой, размером соцветий, их окраской, сырьевой массой.
Своевременным и важным является также разработка технологии получения стандартного образца патулетина, так как этот флавоноид является доминирующим для рода Tagetes (Asteraceae) и характерен для растений некоторых других семейств.
Актуальность данной работы заключается в изучении химического состава и фармакологической активности извлечения, полученного из соцветий бархатцев сорта «Carmen» экстракцией спиртом этиловым 40%. Данное исследование проводится впервые и дополнит общую картину химического состава и фармакологических свойств бархатцев распростертых.
Степень разработанности темы исследования. Соцветия бархатцев
распростертых (Tagetes patula L.) являются ценным источником биологически активных веществ (БАВ), преимущественно, флавоноидов, что подтверждается исследованиями, посвященными изучению, как химического состава, так и фармакологической активности различных фракций и выделенных индивидуальных
веществ. Интерес представляет также комплексное использование шрота соцветий как дополнительного источника биологически активных соединений.
Следует отметить, что важной задачей остается разработка стандартного образца патулетина. Ранее была попытка получения стандарта патулетина из цветков бархатцев, однако эти исследования дальнейшего развития не получили, поскольку не были доведены до логического завершения и соответствующая документация не была представлена в Научный центр экспертизы средств медицинского применения.
Цель и задачи исследований. Учитывая вышеперечисленное, мы сочли целесообразным провести комплексное изучение соцветий бархатцев распростертых (Tagetes patula L.), а также разработать технологию получения стандарта патулетина, что собственно, является целью наших исследований.
В связи с поставленной целью мы сочли целесообразным решить следующие задачи:
осуществить предварительный фармакологический скрининг фракций, полученных экстракцией соцветий бархатцев распростертых сорта «Carmen» спиртом этиловым различной концентрации;
изучить химический состав извлечения, проявившего наиболее выраженную фармакологическую активность;
осуществить идентификацию индивидуальных соединений в анализируемом извлечении;
разработать технологию получения стандартного образца патулетина из сырья (соцветий бархатцев распростертых сорта «Carmen»);
провести количественное определение суммы флавоноидов в анализируемом извлечении;
из шрота соцветий бархатцев выделить пектиновые вещества и изучить их физико-химические свойства;
провести фармакологическое исследование патулетина и анализируемого извлечения.
Для решения поставленных задач предполагается использовать современные химические и физико-химические методы исследования.
Научная новизна исследования заключается в том, что впервые осуществлено
углубленное изучение химического состава извлечения, полученного экстракцией
спиртом этиловым 40%. Обоснован выбор экстрагента для данного объекта.
Приоритетным направлением является изучение и установление химического состава
анализируемого извлечения с целью получения субстанции, обладающей
ранозаживляющей активностью.
Установлен качественный и количественный состав основных групп БАВ в анализируемом извлечении: флавоноидов, фенолкарбоновых и органических кислот, дубильных веществ, аминокислот, макро- и микроэлементов, производных тиофена.
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
идентифицированы фенольные соединения. Впервые выявлено наличие дубильных веществ танина, кислоты галловой, эпигаллокатехин галлата. Выявлены различия в количественном содержании дубильных веществ в обертках и цветках соцветий бархатцев, а также обоснован выбор наиболее оптимального экстрагента для их извлечения.
Методом препаративной колоночной хроматографии выделены 4 вещества, которые на основании данных физико-химического анализа идентифицированы как патулетин, патулитрин, кверцетин, кислота кофейная.
Предложен способ получения стандарта патулетина, структура которого доказана такими физико-химическими методами, как ЯМР-1H-, 13C-, масс-, ИК-, УФ-спектроскопия, а в соответствии с требованиями ГФ ХIII проведены исследования, предъявляемые к стандартным образцам.
Из шрота, остающегося после экстракции сырья спиртом этиловым 40%, выделены пектиновые вещества и гравиметрически установлено их высокое содержание. Кислотным гидролизом установлен их моносахаридный состав. Изучены такие физико-химические свойства пектиновых веществ, как средняя молярная масса, константа Хаггинса, поверхностная активность, изоэлектрическая точка, коэффициент распределения. Выявлена комплексообразующая способность по отношению к ионам свинца: степень связывания ионов Pb2+ пектином из шрота соцветий бархатцев составляет 29,2%.
Фармакологические исследования показали, что извлечение, полученное
спиртом этиловым 40%, проявляет антиоксидантное, ранозаживляющее,
эндотелиопротекторное действие. Установлено также, что анализируемое извлечение и патулетин оказывают благоприятное влияние на вазодилатирующую и антитромботическую функцию эндотелия сосудов головного мозга на фоне его фокальной ишемии экспериментальных животных.1
Теоретическая и практическая значимость работы.
Теоретическая значимость
Проведенные исследования являются достаточным обоснованием, позволяющим расширить сырьевую базу отечественных лекарственных растений с целью последующей разработки лечебно-профилактических средств на основе бархатцев. Разработка стандарта патулетина дополнит каталог стандартных образцов, что в дальнейшем может использоваться в фармакопейном анализе.
Практическая значимость
«Результаты фармакологического исследования извлечения из соцветий
бархатцев распростертых (Tagetes patula L.), полученного экстракцией 40% спиртом
этиловым» (акт внедрения от 18.04.2017 г.) внедрены на кафедре фармакологии с
курсом клинической фармакологии Пятигорского медико-фармацевтического
института – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ.
«Модифицированный способ получения патулетина из соцветий бархатцев распростертых сорта «Carmen»» внедрен в учебный процесс кафедры фармакогнозии для студентов, обучающихся по специальности «Фармация» на III курсе по теме: «Фитохимический анализ лекарственного растительного сырья, содержащего фенольные соединения» (акт внедрения от 22.03.2017 г.).
Материалы по технологии получения и аналитическим характеристикам стандарта природного флавоноида – патулетина, выделенного из соцветий бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) приняты к рассмотрению Центром фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения Российской Федерации от 10.08.2017 г. №15426.
Методология и методы исследования. Изучение и обобщение литературных
1 Фармакологические исследования выполнены на кафедре фармакологии и биофармации ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ под руководством профессора, д. м. н. И.Н. Тюренкова и на кафедре фармакологии с курсом клинической фармакологии ПМФИ – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ под руководством д. м. н. А. В. Воронкова.
данных об объекте исследования, а также оценка актуальности и разработанности темы является методологической основой настоящей диссертационной работы. Для качественного и количественного определения основных групп БАВ, выделения и идентификации индивидуальных соединений использовали различные физико-химические методы: хроматографию, ВЭЖХ, титриметрический анализ, УФ-спектрофотометрию, ЯМР-1Н-, 13С-, масс-спектроскопию, ИК-спектроскопию. Фармакологические исследования построены на методологии классической фармакологии.
Положения, выносимые на защиту:
-
Совокупность данных по изучению химического состава извлечения из соцветий бархатцев, полученного спиртом этиловым 40%.
-
Препаративные методы выделения индивидуальных веществ.
-
Технология получения стандартного образца патулетина.
-
Результаты изучения физико-химических свойств пектиновых веществ.
-
Данные фармакологического исследования анализируемого извлечения и патулетина.
Степень достоверности и апробация результатов. Значительный объем
информационной базы, экспериментальные исследования, проведенные с
использованием современных методов анализа, определяют степень достоверности полученных результатов. Полученные данные обработаны статистически с помощью компьютерных программ. Методика количественного определения флавоноидов валидирована.
Основные положения диссертационной работы были представлены и доложены на научно-практических конференциях: «Беликовские чтения» (г. Пятигорск, ПМФИ – филиал ВолгГМУ, 2015 г.); на 74-ой и 75-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов ВолгГМУ с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Пятигорск, ПМФИ – филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ, 2016-2017 гг.).
Личный вклад автора. При выполнении работы диссертант принимал непосредственное участие на всех этапах научно-практического исследования. Автором самостоятельно осуществлен сбор информации об объекте, проведен
экспериментальный анализ, выполнена статистическая обработка полученных результатов, подготовлены основные публикации по теме диссертационной работы, сформулированы выводы и оформлена диссертация.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложения. В тексте содержится 43 таблицы, 55 рисунков. Список литературы включает 149 источников, из них – 24 на иностранных языках.