Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
Туберкулёз.
Эпидемиологическая ситуация и химиотерапевтическое лечение
Клиническое исследование оригинального лекарственного средства
Аналитические методы исследования фармакокинетики
Валидация биоаналитических методик Аналитические подходы к определению перхлозона .
Выводы по главе
ГЛАВА 2. Разработка и валидация методики определения перхлозона в плазме крови
2.1 Материалы и методы
2.2 Результаты и их обсуждение
ГЛАВА 3. Перенос методики определения перхлозона
ГЛАВА 4. В плазме крови 39
Материалы и методы 40
Результаты и их обсуждение 42
Применение разработанной методики для исследования фармакокинентики оригинального противотуберкулёзного
Препарата «перхлозон»
Общие выводы
Список литературы
- Эпидемиологическая ситуация и химиотерапевтическое лечение
- Валидация биоаналитических методик Аналитические подходы к определению перхлозона
- Результаты и их обсуждение
- Применение разработанной методики для исследования фармакокинентики оригинального противотуберкулёзного
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в Российской Федерации
сохраняется сложная эпидемиологическая обстановка по туберкулезу
(Перельман М.И., 2006; Скачкова И.Е., 2008; Габбасова Л.А., 2013).
Фармакотерапия является основой комплексного лечения и ключевым
фактором выздоровления больных различными формами туберкулеза,
значительного снижения летальности, уменьшения резервуара туберкулезной инфекции.
В Российской Федерации начиная с 50-х гг. для лечения туберкулеза
применяются изониазид, пиразинамид, стрептомицин, канамицин,
капреомицин, протионамид, циклосерин и ПАСК (Методические указания МЗ СССР. М.; 1963), рифампицин и этамбутол – с 70-х гг. (Методические рекомендации МЗ СССР. М.; 1983) и только фторхинолоны – с конца 90-х гг. XX в. (Хоменко А.Г., 1995).
Распространение штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной
лекарственной устойчивостью (устойчивые, по крайней мере, к изониазиду и
рифампицину) поставило под сомнение успех противотуберкулёзных
мероприятий и повлекло за собой снижение эффективности фармакотерапии.
На фоне вынужденной политерапии с использованием резервных
противотуберкулезных препаратов (протионамид (этионамид), канамицин, амикацин, капреомицин, циклосерин, рифабутин, ПАСК, фторхинолоны) уменьшается функциональная активность защитных систем организма и отмечаются побочные реакции со стороны различных органов и систем, что ведёт к затяжному течению заболевания и хронизации воспалительных процессов. В этих условиях становится очевидной необходимость создания инновационных лекарственных препаратов для борьбы с устойчивыми штаммами микобактерий туберкулёза.
«Перхлозон» – оригинальный противотуберкулезный лекарственный
препарат, разработанный в России сотрудниками Иркутского института химии
имени А.Е. Фаворского Сибирского отделения Российской Академии наук (СО
РАН) и Федерального государственного бюджетного учреждения «Санкт-
Петербургский научно-исследовательский институт
фтизиопульмонологии» совместно с открытым акционерным обществом
«Фармасинтез». Новый препарат был представлен на Всемирной конференции
«Против туберкулеза и заболеваний легких». Премьер-министр России
Дмитрий Медведев на совещании в российском инновационном центре
«Сколково» назвал препарат «Перхлозон», разработанный компанией
«Фармасинтез», среди прорывных в отечественной медицине.
Разработка методики определения перхлозона в плазме крови и
последующее изучение фармакокинетики данного инновационного
лекарственного средства являются важнейшей задачей при разработке нового
препарата. Данные о фармакокинетике перхлозона лягут в основу схемы
рациональной терапии, позволив правильно рассчитать дозу препарата,
кратность приёма, добиться максимального терапевтического эффекта с
минимальным риском возникновения нежелательных лекарственных реакций.
Все вышесказанное определяет актуальность настоящего исследования.
Степень разработанности темы исследования.
В настоящее время существуют разработанные аналитические методики для определения перхлозона в фармацевтической субстанции и лекарственных формах. В то же время, данные методики не могут быть применимы для анализа данного лекарственного средства в биологических жидкостях, в том числе плазме крови человека, поскольку для решения данной задачи к биоаналитической методике предъявляются иные требования к аналитическому диапазону (ПКО метода на уровне менее 1 мкг/мл), условиям пробоподготовки (должна обеспечивать изолирование исследуемого ЛС из плазмы крови) и др. Таким образом, в настоящее время вопросы, связанные с разработкой и валидацией биоаналитических методик определения перхлозона в плазме крови человека для определения его фармакокинетики являются недостаточно разработанными.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка
метода анализа противотуберкулезного препарата «Перхлозон» для
фармакокинетических исследований. Для реализации данной цели ставятся следующие задачи:
-
Сделать научно-обоснованный выбор аналитического метода определения перхлозона в плазме крови на основании физико-химических свойств молекулы;
-
Разработать методику количественного определения перхлозона в плазме крови;
-
Провести валидацию методики определения перхлозона в плазме крови;
-
Осуществить межлабораторный перенос методики определения перхлозона в плазме крови;
-
Провести апробацию разработанной методики для изучения динамики концентраций и фармакокинетики инновационного противотуберкулёзного препарата «Перхлозон»;
-
Провести апробацию разработанной методики для терапевтического лекарственного мониторинга на фоне курсового лечения перхлозоном.
Научная новизна. В работе впервые разработана методика анализа иннова
ционного противотуберкулезного препарата «Перхлозон» для фармакокинетиче-
ских исследований, и получены значения равновесной концентрации в плазме
крови человека при курсовом приёме перхлозона. По результатам экспериментов
показано, что разработанная методика может быть применена для проведения те
рапевтического мониторинга на фоне курсового лечения перхлозоном в со
четании с другими противотуберкулёзными препаратами.
Теоретическая значимость работы.
В работе представлены подходы к разработке биоаналитических методик количественного определения лекарственных средств химической природы с учетом физико-химических свойств молекулы (растворимость, липофильность, наличие функциональных групп и др.) с использованием современных физико-химических методов анализа.
В целях оптимизации режима дозирования показана необходимость опре-
деления равновесной концентрации в процессе фармакотерапии.
Практическая значимость результатов работы.
Разработанные при выполнении диссертационного исследования методики
были успешно применены в открытом исследовании I фазы по изучению фар-
макокинетики, безопасности и переносимости препарата «Перхлозон» у здоровых
добровольцев при однократном применении, а также в открытом сравнитель-
ном рандомизированном многоцентровом исследовании эффективности
и безопасности препарата «Перхлозон» в комплексной терапии больных тубер-
кулезом легких.
Разработанная методика определения перхлозона в плазме крови, а также ее
перенос на хроматографическую станцию Agilent 1200 внедрены в международную
базу практических руководств по применению аналитических методик Agilent
Application Notes (руководства №№ 5991-3216RURU и 5991-2997RURU).
Методология и методы исследования.
Методология исследования построена на анализе и обобщении литературных
данных, оценке степени разработанности и актуальности темы, существующих под
ходов к изучению фармакокинетики лекарственных средств. Методологическая ос
нова работы при выборе методов анализа заключалась в изучении физико-
химических свойств препарата, подборе оптимальных условий хроматографирова-
ния, пробоподготовки и фармакокинетических расчетов.
В процессе выполнения работы был использован метод ВЭЖХ с УФ-
детектированием и добавлением ион-парного реагента в подвижную фазу, а также метод осаждения белков плазмы трифторуксусной кислотой с целью изолирования определяемого соединения.
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Степень достоверности результатов. Первичные данные, полученные в
результате проведения настоящего исследования, получены при помощи
современных методов анализа, являются достоверными и точными, что
подтверждено в ходе проведения процедуры валидации. Использованное в работе
оборудование имело действующие свидетельства о поверке и зарегистрировано в
Реестре средств измерений, что позволяет считать результаты исследования
достоверными. Все результаты обработаны статистически.
Апробация работы. Апробация работы проведена на Научном совете Научно-исследовательского института фармации Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (11 ноября 2014, Москва).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в проведении
экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных ре-
зультатов. Автором лично проведена разработка, валидация и межла-
бораторный перенос методики определения перхлозона в плазме крови, статистическая обработка результатов. Вклад автора является определяющим на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально - теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику. Диссертация написана лично автором.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 4 паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия»
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы НИИ Фармации Первого МГМУ имени И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований», номер государственной регистрации 01.2.006.06352.
Положения, выносимые на защиту.
-
Методика количественного определения перхлозона в плазме крови методом ион-парной ВЭЖХ с УФ-детектированием и ее валидация.
-
Результаты апробации разработанной методики для оценки фармакокине-тических параметров препарата «Перхлозон», полученные в открытом исследовании I фазы по изучению фармакокинетики, безопасности и переносимости препарата «Перхлозон» у здоровых добровольцев при однократном введении.
-
Результаты апробации разработанной методики для оценки значения равновесной концентрации перхлозона в открытом сравнительном рандомизированном многоцентровом исследовании эффективности и безопасности препарата «Перхлозон» в комплексной терапии больных туберкулезом легких на фоне противотуберкулезной терапии.
Объем и структура работы.
Эпидемиологическая ситуация и химиотерапевтическое лечение
В настоящее время в Российской Федерации сохраняется сложная эпидемическая обстановка по туберкулезу [1-3]. По данным на 2011 год остаются на невысоком уровне показатели эффективности лечения впервые выявленных больных туберкулезом легких: прекращение бактериовыделения составило 66,6%; закрытие полости распада – 58,5%; летальность – 7,1%, смертность – 17,9%, доля впервые выявленных больных с множественной лекарственной устойчивостью составила 19,4% [2].
Химиотерапия является основой комплексного лечения и ключевым фактором выздоровления больных различными формами туберкулеза, значительного снижения летальности, уменьшения резервуара туберкулезной инфекции. При своевременно начатом лечении и правильном подходе к терапии впервые выявленный туберкулез в абсолютном большинстве случаев излечивается.
К основным противотуберкулёзным препаратам относятся изонизид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол и стрептомицин. Эти препараты оказывают эффективное бактерицидное действие на Mycobacterium tuberculosis и демонстрируют наименьшую частоту нежелательных лекарственных реакций. Основные противотуберкулёзные препараты используются для лечения впервые выявленных больных туберкулезом [4, 5].
Группу резервных противотуберкулёзных препаратов составляют канамицин (амикацин), капреомицин, протионамид, циклосерин, парааминосалициловая кислота (ПАСК) и фторхинолоны. Эти препараты оказывают менее эффективное бактериостатическое действие на Mycobacterium tuberculosis и являются заменой основным противотуберкулёзным препаратам в случае выявления лекарственной устойчивости и неустранимых побочных реакций [4].
В Российской Федерации начиная с 50-х гг. для лечения туберкулеза применяются изониазид, пиразинамид, стрептомицин, канамицин, капреомицин, протионамид, циклосерин и ПАСК [6], рифампицин и этамбутол – с 70-х гг. [7] и только фторхинолоны – с конца 90-х гг. XX в. [8].
Распространение штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (устойчивые, по крайней мере, к изониазиду и рифампицину) поставило под сомнение успех противотуберкулёзных мероприятий [9] и повлекло за собой снижение эффективности химиотерапии [10,11, 13, 14]. На фоне вынужденной полихимиотерапии с использованием резервных противотуберкулезных препаратов уменьшается функциональная активность защитных систем организма и отмечаются побочные реакции со стороны различных органов и систем, что ведёт к затяжному течению заболевания и хронизации воспалительных процессов. В этих условиях становится очевидной необходимость создания инновационных лекарственных препаратов для борьбы с устойчивыми штаммами микобактерий туберкулёза.
Оригинальное лекарственное средство - лекарственное средство, содержащее впервые полученную фармацевтическую субстанцию или новую комбинацию фармацевтических субстанций, эффективность и безопасность которых подтверждены результатами доклинических исследований лекарственных средств и клинических исследований лекарственных препаратов [15]. Одним из обязательных этапов государственной регистрации оригинального препарата является его клиническое исследование в одной или нескольких медицинских организациях.
Клиническое исследование лекарственного препарата – изучение диагностических, лечебных, профилактических, фармакологических свойств лекарственного препарата в процессе его применения у человека, животного, в том числе процессов всасывания, распределения, изменения и выведения, путем применения научных методов оценок в целях получения доказательств безопасности, качества и эффективности лекарственного препарата, данных о нежелательных реакциях организма человека, животного на применение лекарственного препарата и об эффекте его взаимодействия с другими лекарственными препаратами и (или) пищевыми продуктами, кормами [15].
Клинические исследования должны проводиться в соответствии с правилами Надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice; GCP), которые представляют собой международный этический и научный стандарт планирования и проведения исследований с участием человека в качестве субъекта, а также документального оформления и представления результатов таких исследований [16, 17].
Клинические исследования лекарственных препаратов для медицинского применения проводятся в следующих целях: 1) установление безопасности лекарственных препаратов для здоровых добровольцев и (или) переносимости их здоровыми добровольцами. 2) подбор оптимальных дозировок лекарственного препарата и курса лечения для пациентов с определенным заболеванием. 3) установление безопасности лекарственного препарата и его эффективности для пациентов с определенным заболеванием [15]. Существуют три основных типа дизайна клинических исследований: параллельное, перекрестное и факториальное [18]. Клиническое исследование обычно принято разделять на 4 фазы [19].
На данном этапе проводится изучение фармакокинетических свойств (всасывание, распределение, метаболизм и выведение), безопасности и переносимости лекарственного средства. Исследование первой фазы проводят на небольшой группе здоровых добровольцев, но в случае, если препарат обладает высокой потенциальной токсичностью или обладает цитотоксическим фармакологическим действием, в исследовании участвуют пациенты с соответствующим заболеванием. Иногда проводится предварительное исследование фармакокинетики препарата при введении микродоз на маленькой выборке [19, 20].
Валидация биоаналитических методик Аналитические подходы к определению перхлозона
Аналитическая часть исследования эффективности и безопасности перхлозона при комплексной терапии туберкулёза проводилась на оборудовании, отличном от того, которое было описано выше и использовалось в клиническом исследовании первой фазы. Согласно требованиям руководств по валидации, при переносе методики потребовалось проведение частичной валидации методики по показателям: селективность, линейность, правильность и прецизионность, предел количественного определения.
Для переноса ВЭЖХ методики были выбраны две хроматографические системы: исходная хроматографическая система – хроматограф WatersAlliance 2695 с автосамплером, термостатом колонок и диодно-матричным детектором Waters 2998 (Waters США) под управлением программного обеспечения WatersEmpowerPro 2. Подробно оборудование, условия и результаты анализа описаны в предыдущей главе.
Система для переноса методики: хроматограф Agilent 1260 (Agilent Technologies, США), оснащенный градиентным насосом, термостатом колонок и образцов, дегазатором, автосамплером, диодноматричным УФ детектором G1315D. Обработку данных проводили при помощи программного обеспечения ChemStation (ver. B.03.01). Хроматографическое разделение проводили на хроматографической колонке Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 150х4,6 мм, 5 мкм с предколонкой Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 12,5 4,6мм 5 мкм.
В данной работе продемонстрирован перенос разработанной методики определения перхлозона в крови методом ион-парной ВЭЖХ с УФ детектированием.
Образцы чистой и исследуемой плазмы крови хранили в морозильнике для плазмы при температуре от - 35 оС до - 40 оС. Стандартные растворы хранили в холодильнике при температуре от +2 до+8 оС.
В качестве способа пробоподготовки было выбрано осаждение белков плазмы с помощью трифторуксусной кислоты (ТФУ). 150 мкл чистой плазмы крови (либо плазмы с предварительно прибавленным стандартным раствором перхлозона) вносили в центрифужные пробирки Eppendorf вместимостью 2 мл, прибавляли 50 мкл 50 % раствора трифторуксусной кислоты, встряхивали на вортекс-шейкере при 2400 об/мин в течение 20 секунд, и центрифугировали при 15200 об/мин в течение 10 мин. Отбирали 125 мкл надосадочной жидкости и переносили в микровиалы для ВЭЖХ.
Количественное определение проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1200 Series с диодноматричным детектором. Обработку данных проводили при помощи программного обеспечения ChemStation. Подвижная фаза: ацетонитрил - 50 мМ фосфатный буфер с 5 мМ октансульфонатом натрия рН 2,50, 15 : 85 по объёму, предварительно профильтрованная и дегазированная.
Разработанная методика определения перхлозона методом ион-парной ВЭЖХ с УФ детектированием была перенесена с системы Waters Alliance на систему Agilent 1260 HPLC без изменения состава подвижной фазы, скорости потока, объема вводимой пробы и условий детектирования. При этом была произведена замена хроматографической колонки Waters Atlantis T3 на колонку Agilent Zorbax Eclipse Plus C18.
Валидацию методики при ее переносе определения перхлозона в плазме крови проводили на основании руководства по валидации биоаналитических методик FDA [58] и EMA [59], по следующим характеристикам: селективность, линейность, правильность и прецизионность, предел количественного определения. Следует отметить, что согласно нормативным документам FDA и EMA при переносе биоаналитической методики на новую хроматографическую станцию или в другую лабораторию проводится частичная валидация методики (по основным валидационным характеристикам – селективность, линейность, правильность, прецизионность).
Для определения селективности хроматографических систем проводили анализ 6 образцов чистой плазмы и образца чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхлозона до получения концентрации 1 мкг/мл. На хроматограммах образцов чистой плазмы не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания перхлозона.
Для определения линейности на каждой хроматографической системе проводили анализ 5 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхлозона до получения концентраций: 200 нг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл. По полученным значениям были построены калибровочные графики. Калибровочный график для системы Waters (r2 0,998), приведен на Рисунке 6. Калибровочный график для системы Agilent (r2 0,99913), приведен на Рисунке 7.
Результаты и их обсуждение
Индивидуальные профили изменения концентpаций (C) перхлозона в плазме крови во времени (t), заpегистpиpованные после приема препарата «Перхлозон», капсулы 400 мг, 800 мг, 1200 мг, хаpактеpизовали максимальной концентрацией лекарственного вещества (Cmax, наибольшее из измеренных значений), временем ее достижения (Tmax), также площадью под кривой «концентрация – время» в пределах от нуля до момента отбора последней пробы крови (t = 72 ч), рассчитанной методом трапеций (AUC0-72), периодом полувыведения (t1/2), средним временем удерживания (MRT), константой элиминации (kel), показателем скорости всасывания (Сmax/AUC). Сопоставление значений AUC0-72 с общим AUC0- (их отношение составляло значительно больше 80%) свидетельствовало о том, что выбранный регламент фармакокинетического исследования обеспечивает необходимую надежность оценки фармакокинетических параметров перхлозона.
Индивидуальные уровни концентраций перхлозона и описательная статистика полученных данных приведены в Таблицах 5 – 8. Индивидуальные фармакокинетические параметры представлены в Таблицах 9 – 12.
При определении перхлозона в плазме крови пациентов на фоне сопутствующей противотуберкулёзной терапии было показано, что не наблюдается наложения пика перхлозона на пики, соответствующие другим противотуберкулёзным препаратам (Рисунок 9). а)
Хроматограмма плазмы крови пациента во время курсового приема препарата Перхлозон на фоне сопутствующей терапии (а) и при применении тех же противотуберкулёзных препаратов за исключением перхлозона (б) (WatersAlliance 2965). Таблица 5
Как видно из представленных данных, Перхлозон быстро всасывался в системный кровоток при пероральном приеме (Tmax – 1,25 ч для дозировок 400 мг и 800 мг; 2,55 ч для дозировки 1200 мг). Разное время достижения максимальной концентрации в плазме при приёме разных доз препарата может быть связано с лимитированием скорости всасывания препарата при увеличении дозы. Перхлозон практически не обнаруживался в плазме крови спустя 48-72 ч после однократного применения для дозировок 400 мг – 800 мг, либо обнаруживался на очень низких уровнях для дозировки 1200 мг. Сmax перхлозона составила 4,49 ± 0,95 мкг/мл; 7,03 ± 1,00 мкг/мл; 9,64 ± 2,10 мкг/мл для дозировок 400 мг, 800 мг и 1200 мг, соответственно. AUC0-72 перхлозона составила 50,62 ± 10,98 мкг ч/мл; 88,04 ± 9,28 мкг ч/мл; 184,7 ± 41,35 мкг ч/мл для дозировок 400 мг, 800 мг и 1200 мг, соответственно. Фармакокинетика в диапазоне доз 400 мг – 1200 мг является линейной по Сmax (r2 = 0,9999) и несколько менее выражено для AUC (r2 = 0,94), графики линейности приведены на Рис. 11-12. Период полувыведения перхлозона составил около 9 – 12 ч, среднее время удерживания – около 11-16 ч. Для единственного добровольца, у которого были установлены фармакокинетические параметры после приема дозировки 1600 мг, величина Сmaxсоставила 18,08 мг/мл, AUC0-72 – 495,50 мкг/мл. Усредненные и индивидуальные фармакокинетические профили перхлозона приведены на Рис. 13 – 20 и 21 – 54.
На фоне курсового применения препарата была определена равновесная (стационарная) концентрация. Для этого у пациентов на очередном визите за 10-15 минут до приема дозы препарата был проведен забор крови для последующего фармакокинетического анализа.
Усредненный профиль равновесной концентрации перхлозона в плазме крови на приведен на Рисунке 10. Рисунок 10. Усредненный профиль равновесной концентрации перхлозона в плазме крови.
В период с 3 по 7 визита в плазме крови пациентов (n=13) установилась равновесная концентрация (Css) перхлозона, которая составила от около 3,45 мкг/мл (визит 3) до 1,98 мкг/мл (визит 7). Разброс индивидуальных значений равновесных концентраций перхлозона составил от 0,39 мкг/мл (min) до 6,94 мкг/мл (max). К восьмому визиту (после завершения приема препарата) перхлозона в плазме обнаружено не было.
Полученные в ходе настоящего исследования фармакокинетические параметры достоверно отличаются от описанных в доступной литературе [73]. Параметры Tmax, t , рассчитанные в данном исследовании, в среднем меньше, а Сmax больше, чем в работе А.М. Власова и др.
Примеры типичных хроматограмм, полученных в ходе исследования фармакокинетики и записанных с применение хроматографической системы Agilent 1200, представлены на Рисунках 55 – 82.
Применение разработанной методики для исследования фармакокинентики оригинального противотуберкулёзного
Образцы интактной («чистой») и исследуемой плазмы крови хранили в морозильнике для плазмы крови (Pozis, MM-180/20/35, Россия) при температуре от -35оС до -40оС. Стандартные растворы хранили в фармацевтическом холодильнике при температуре от 2оС до 8оС (Pozis, ХФ-250, Россия). Чистая плазма достоверно не содержала исследуемого вещества и была предоставлена Отделом внедрения новых лекарственных средств Научно-исследовательского Института Фармации.
Исходный стандартный раствор перхлозона готовили растворением навески в метаноле и хранили при температуре от -35 оС до -40 оС. Рабочие стандартные растворы готовили путем разведения исходного стандартного раствора перхлозона водой Milli-Q (Millipore, Milli-Q Advantage A10, Франция).
Первоначально была предпринята попытка воспроизвести подходы, описанные в статье А.М. Власова и др. [63], однако не удалось получить удовлетворительных результатов. В связи с этим на основании описанных в предыдущей главе общих подходов к разработке биоаналитических методик были экспериментально подобраны оптимальные условия анализа, которые будут описаны далее.
В качестве способа пробоподготовки было выбрано осаждение белков плазмы с помощью трифторуксусной кислоты (ТФУ). 150 мкл исследуемой плазмы (либо плазмы с предварительно прибавленным стандартным раствором перхлозона) вносили в центрифужные пробирки Eppendorf вместимостью 1,5 мл, прибавляли 50 мкл 50 % раствора ТФУ, перемешивали на вортекс-шейкере в течение 1 мин, центрифугировали при 15200 об/мин в течение 10 минут, после чего переносили 125 мкл надосадочной жидкости в микровиалы для ВЭЖХ.
Количественное определение проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе WatersAlliance 2695 с диодноматричным детектором 2998. Обработку данных проводили при помощи программного обеспечения WatersEmpower 2.
Подвижная фаза: ацетонитрил - 50 мМ фосфатный буфер с 5 мМ октансульфонатом натрия рН 2,50, 15% : 85% по объёму, предварительно профильтрованная и дегазированная. Скорость потока подвижной фазы: 1 мл/мин.
Неподвижная фаза: хроматографическая колонка WatersAtlantisT3 5u, 150x4.6 мм, 5 мкм, предколонка WatersAtlantisT3 5 мкм 4.6 20 мм, при температуре 25 оС.
Условия анализа подобраны экспериментально. Осаждение белков плазмы ТФУ является удобным и быстрым способом пробоподготовки, причём, т.к. перхлозон является слабым основанием, он не соосаждается с белками, а остаётся в надосадочной жидкости в виде соли.
Как следствие, перхлозон в форме катиона слабо удерживался неполярной неподвижной фазой, но в присутствии ион-парного реагента (октансульфонат натрия) удалось улучшить удерживание исследуемого вещества на колонке и достичь оптимального хроматографического разделения.
Валидацию методики определения перхлозона в плазме крови человека проводили на основании руководств по валидации биоаналитических методик FDA[58] и EMA [59] по следующим характеристикам: селективность, линейность, правильность и прецизионность (на уровне intra-day – внутри цикла и inter-day – между циклами), предел количественного определения.
Хроматограмма чистой плазмы. Для определения селективности проводили анализ 6 образцов чистой плазмы и образца чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхлозона до получения концентрации 1 мкг/мл. На хроматограммах образцов чистой плазмы не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания перхлозона. Хроматограммы чистой плазмы и чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхлозона до получения концентрации 1 мкг/мл приведены на Рисунках 2-3.
Эффективность хроматографической колонки по пику перхлозона составила 9166 теоретических тарелок, фактор асимметрии составил 1,25. 2.2.1.2 Линейность
Проводили анализ 5 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхлозона до получения концентраций: 200 нг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл. По полученным значениям был построен калибровочный график (r2 0,998), приведенный на Рисунке 4, и рассчитано уравнение калибровочной кривой (Y = 2,44 105 X – 1,68 104).
Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных по уравнению линейной зависимости, от фактических значений приведены в Таблице 1. Полученные отклонения соответствуют нормам FDA и EMA (не более 20 % для нижнего диапазона линейности, не более 15 % - для остальных точек).
Для оценки прецизионности и правильности методики проводили анализ 3 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхлозона до получения концентраций: 200 нг/мл, 2 мкг/мл, 20 мкг/мл. Каждый раствор хроматографировали 5 раз. Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины стандартного отклонения (SD), относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (, %), приведенные в Таблице 2.