Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние изученности первоцвета весеннего (обзор литературы) 14
1.1. Ботаническая характеристика первоцвета весеннего 15
1.2. Химический состав первоцвета весеннего 18
1.3. Применение первоцвета весеннего в народной и научной медицине 25
1.4. Перспективность создания отечественных фитопрепаратов на основе травы первоцвета весеннего 31
1.5. Влияние лекарственной формы на повышение эффективности фитопрепаратов 33
Выводы к главе 1 34
Глава 2 Объекты и методы исследования 36
2.1. Объекты исследования, их характеристика 36
2.2. Анатомо-морфологический анализ 36
2.3. Фитохимический анализ 37
2.3.1. Витамины 37
2.3.2. Органические кислоты 38
2.3.3. Дубильные вещества 39
2.3.4. Флавоноиды 40
2.3.5. Сапонины 41
2.4. Выделение и идентификация основных групп биологически активных соединений 42
2.5. Методы стандартизации сырья 44
2.6. Методы стандартизации сиропа 45
2.7. Методы фармакологических исследований 46
2.8. Статистическая обработка данных 48
Глава 3 Фитохимическое исследование травы первоцвета весеннего для разработки фильтр-пакетов . 49
3.1. Фитохимическое изучение сырья первоцвета весеннего 49
3.1.1. Качественное и количественное определение водорастворимых витаминов 52
3.1.2. Качественное и количественное определение содержания свободных органических кислот 54
3.1.3. Качественное и количественное определение дубильных веществ. 56
3.1.4. Качественное и количественное определение флавоноидов 57
3.1.5. Качественное и количественное определение сапонинов 60
3.1.6. Исследование липофильных соединений 61
3.1.7. Выделение и идентификация основных групп биологически активных соединений 67
3.2. Исследование водных извлечений из сырья первоцвета весеннего. 83
3.3. Разработка методов стандартизации и контроля качества сырья первоцвета весеннего для изготовления фильтр-пакетов. 87
3.3.1. Анатомо-морфологические исследования сырья 87
3.3.2. Разработка методов контроля качества сырья 93
3.3.3. Определение числовых показателей сырья 99
Выводы к главе 3 104
Глава 4 Фитохимическое изучение и разработка лекарственных средств из травы первоцвета весеннего 107
4.1. Исследование водно-спиртовых извлечений из сырья первоцвета весеннего 107
4.1.1. Изучение влияния технологических параметров на выход биологически активных соединений. 109
4.1.2. Сравнительное изучение состава водно-спиртовых извлечений. 112
4.2. Исследование и разработка экстрактов из сырья первоцвета весеннего 118
4.2.1. Сравнительный анализ антиоксидантной активности и физико-химических свойств густых экстрактов 119
4.2.2. Разработка методов стандартизации и контроля качества густого экстракта 125
Выводы к главе 4 130
Глава 5 Экспериментальное обоснование целесообразности использования густого экстракта травы первоцвета весеннего в медицине и разработка лекарственной формы на его основе . 132
5.1. Изучение острой токсичности экстракта 132
5.2. Изучение гепатозащитной активности экстракта 133
5.3. Изучение противовоспалительной активности экстракта 136
5.4. Изучение отхаркивающего действия экстракта 137
5.5. Фитохимическое изучение и разработка сиропа на основе густого экстракта первоцвета весеннего 139
5.5.1. Разработка лекарственной формы на основе густого экстракта первоцвета весеннего 139
5.5.2. Сравнительный анализ антиоксидантной активности сиропов на основе густого экстракта первоцвета весеннего 144
5.5.3. Разработка методов стандартизации и контроля качества сиропа на основе густого экстракта первоцвета весеннего. 149
Выводы к главе 5 153
Заключение 155
Выводы 156
Практические рекомендации 158
Перспективы дальнейшей разработки темы 158
Список сокращений 159
Список литературы 160
Приложения 176
- Применение первоцвета весеннего в народной и научной медицине
- Выделение и идентификация основных групп биологически активных соединений
- Разработка методов стандартизации и контроля качества густого экстракта
- Сравнительный анализ антиоксидантной активности сиропов на основе густого экстракта первоцвета весеннего
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из приоритетных научных направлений,
определенных «Стратегией развития медицинской науки в Российской Федерации на
период до 2025 года», является профилактика хронических неинфекционных
заболеваний (ХНИЗ) для снижения смертности населения Российской Федерации. В
России ХНИЗ, включающие в себя сердечно-сосудистые заболевания,
онкологические и хронические респираторные заболевания, а также сахарный диабет,
являются причиной 75% всех причин смерти населения. Это обстоятельство делает
проблему ХНИЗ для нашей страны особенно актуальной. Профилактика и контроль
ХНИЗ требуют реализации широкого ряда многоуровневых и межсекторальных мер,
направленных на весь спектр ХНИЗ с целью создания необходимых условий
эффективной фармакотерапии и здорового образа жизни (Шальнова С.А., Концевая
А.М., 2012). К основным факторам риска, приводящих к возникновению ХНИЗ,
относятся артериальная гипертония, гиперхолестеринемия, нерациональное питание,
гиподинамия и др. В комплексном лечении и профилактике многих ХНИЗ могут
широко применяться лекарственные растительные препараты (ЛРП),
специализированные пищевые продукты с растительными экстрактами, биологически активные добавки к пище (БАД). ЛРП оказывают системное воздействие на организм (что важно для лечения хронических заболеваний), обеспечивая клинический эффект с минимумом побочных реакций (Киселева Т.Л. и др., 2008; Куркин В.А., 2016; Самылина И.А. и др., 2003, 2010). В связи с этим разработка средств комплексной профилактики и лечения ХНИЗ на основе растительного сырья, содержащего богатый комплекс биологически активных соединений (БАС), является актуальным направлением.
К перспективным источникам получения как гидрофильных, так и
липофильных соединений относятся растения рода PrimulaL. Наиболее изученным,
широко распространенным на территории РФ, в том числе Республике Башкортостан,
является первоцвет весенний (лекарственный) [PrimulaverisL. или P. officinalis
(L.)Hill.]. В зарубежной медицинской практике разрешены к применению корневища
с корнями, цветки первоцвета весеннего, в Российской Федерации (РФ) – листья в
качестве пищевого растительного сырья. Известны следующие фармакологические
свойства препаратов из первоцвета весеннего: отхаркивающее, бронхолитическое,
потогонное, мочегонное, спазмолитическое, антимикробное (Киселева Т.Л. и др.,
2008; Куркин В.А., 2016; ГРЛС, 2017). В экспериментальных исследованиях у травы
первоцвета весеннего выявлены антигипоксантная, антиоксидантная,
ангиопротекторная, эндотелиопротекторная активности (Латыпова Г.М., 2015). На
фармацевтическом рынке РФ присутствуют зарубежные ЛРП на основе данного
растения, используемые преимущественно в качестве отхаркивающих,
бронхолитических средств и БАД к пище в качестве дополнительных источников пищевых веществ, используемых для коррекции ряда гинекологических заболеваний. Однако вновь выявленные фармакологические свойства изучаемого растения
позволяют расширить область применения и возможность его использования в медицинской практике, в том числе при ХНИЗ. Несмотря на широкое применение ЛРП и БАД к пище на основе первоцвета весеннего в медицинской и фармацевтической практике, отечественные препараты на его основе до сих пор не созданы.
Таким образом, актуальным является фармакогностическое исследование первоцвета весеннего, направленное на исследование сырья и экстрактов, с целью разработки рациональных лекарственных форм.
Степень разработанности темы. В настоящее время в медицинской практике
разрешены к применению корневища с корнями, цветки первоцвета весеннего, на
основе которых созданы зарубежные отхаркивающие ЛРП, включены
в Государственный реестр лекарственных средств для медицинского применения РФ
(ГРЛС), международные фармакопеи. В числе зарегистрированных – «Бронхикум»,
«Бронхикум эликсир» (Rhne-Poulenc Rorer), «Бронхипрет ТП» (BionoricaAG),
«Гербион сироп первоцвета» (KRKA). Листья данного растения разрешены
к применению в качестве поливитаминного пищевого растительного сырья (ГОСТ
3166-76 «Листья первоцвета весеннего»). В отечественной и зарубежной литературе
имеются сведения об изучении химического состава первоцвета весеннего: сапонинов
(Мичник О.В., 1976; Poracova J., 2009; Mulas S., 2012; Борисова Д.А., 2013; Латыпова
Г.М., 2015; ApelL., 2017), в соответствии с Европейской Фармакопеей стандартизацию
корневищ с корнями Primulaveris L. проводят по содержанию эсцина
(EuropeanPharmacopoeia, 2008); фенольных соединений (RichardsJ., 1993; Романова З.Р., 2010; Борисова Д.А., 2013; Латыпова Г.М., 2015); полиметоксилированных флавоноидов (BudzianowskiJ., 2005; VitaliniS., 2011; Латыпова Г.М., 2015); липофильных соединений (SayanovaO., 1999; Латыпова Г.М., 2015).
Несмотря на достаточную изученность химического состава и
фармакологических свойств первоцвета весеннего, вопросы целенаправленного фитохимического исследования сырья разной степени измельчения и переработки, экстрактов, изучения влияния факторов на выход БАС, получения рациональной лекарственной формы, разработки методов оценки качества решены не в полной мере. Это и обусловило выбор темы диссертационного исследования.
Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является фармакогностическое исследование первоцвета весеннего, направленное на разработку и совершенствование методов стандартизации сырья и лекарственных средств на его основе.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Провести фитохимическое исследование сырья первоцвета весеннего для получения лекарственных растительных средств.
-
Провести анатомо-морфологическое исследование и установить диагностические признаки измельченного сырья травы первоцвета весеннего для стандартизации лекарственной формы – фильтр-пакет.
-
Провести исследования по подбору оптимальных условий извлечения биологически активных соединений травы первоцвета весеннего и разработке способов получения экстрактов.
-
Провести сравнительное фитохимическое исследование сырья и экстрактов на основе травы первоцвета весеннего.
-
Обосновать состав и технологию получения фармацевтической субстанции растительного происхождения (ФСРП) «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего», лекарственного растительного препарата «Первоцвета весеннего сироп».
-
Провести исследования по стандартизации и разработке методик качественного и количественного анализа лекарственных средств (ЛС) «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего», «Первоцвета весеннего сироп».
-
На основе результатов фармакогностических исследований разработать нормативную документацию (НД) на ЛС «Первоцвета весеннего трава», «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего», «Первоцвета весеннего сироп».
Научная новизна. Проведено фитохимическое изучение сырья первоцвета
весеннего для получения лекарственных растительных средств. Методом высоко
эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) изучен состав водорастворимых
витаминов травы первоцвета весеннего, среди которых фолиевая кислота,
пиридоксина гидрохлорид и тиамина гидрохлорид обнаружены впервые. Исследован
состав полифенольных соединений с использованием методов хроматографии
[тонкослойной (ТСХ), хроматоденситометрии, ВЭЖХ, хромато-масс-спектрометрии
(ГХ/МС)], идентифицировано 28 соединений фенольной природы, из которых 18
отнесены к флавоноидам (в том числе 9 – к полиметоксилированным), 2 – к
кумаринам, 1– к простым фенолам, 1 – к дубильным веществам, 1 – к
антраценпроизводным, 5 – к оксикоричным кислотам, 1 – к фенолокислотам. В траве
первоцвета весеннего из группы полиметоксилированныхфлавоноидов впервые
выделен и идентифицирован 5-гидрокси-4-метокси-7-метил-флавон, из группы
антраценпроизводных гликозидов – 1,8-диметокси-9,10-антрацендион. Методом
хромато-масс-спектрометрии определен состав липофильных соединений,
идентифицировано 11 веществ, среди которых витамин Е, сквален, этиловые эфиры
9-гексадеценовой, гексадекановой, 9,12-октадекадиеновой, 9,12,15-
октадекатриеновой кислот, метиловый эфир 9,12,15-октадекатриеновой кислоты определены впервые.
Впервые исследовано анатомо-морфологическое строение измельченного сырья травы первоцвета весеннего. К диагностическим признакам отнесены простые двух-, трехклеточные волоски, расширенные у основания и заостренные на конце, а также железистые волоски с одноклеточными головками шаровидной формы, заполненные серо-бурой массой.
Впервые проведено сравнительное фитохимическое изучение сырья и
экстрактов на основе травы первоцвета весеннего по доминирующим группам БАС.
Разработан оптимальный способ получения субстанции и подтверждена
идентичность качественного состава сырья и экстракта. Разработаны методические
и методологические подходы к стандартизации сырья и ФСРП «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего» с использованием ТСХ, спектрофотометрии.
Обоснована перспективность использования ФСРП «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего» в качестве гепатозащитного, противовоспалительного, эндотелиопротекторного и отхаркивающего средства.
Обоснованы состав, способ получения,методы контроля качества ЛС на основе травы первоцвета весеннего «Первоцвета весеннего сироп» с использованием принципов унификации, применяемых в современной стандартизации.
Новизна исследований подтверждена патентами РФ на изобретения: «Новое природное вещество из травы первоцвета весеннего» (патент № 2532999 от 20.01.15); «Средство растительного происхождения, обладающее гепатозащитным действием» (патент № 2554493 от 27.06.15); «Средство растительного происхождения, обладающее эндотелиопротекторной активностью» (патент № 2561064 от 20.08.15).
Теоретическая и практическая значимость. На основе анатомо-морфологических исследований определены характеристики показателей качества измельченного сырья травы первоцвета весеннего, разработан проект НД «Первоцвета весеннего трава» (ООО «Травы Башкирии», г. Уфа).
Разработаны состав, способ получения, определены показатели качества и методы их оценки для ФСРП на основе травы первоцвета весеннего «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего», ЛРП «Первоцвета весеннего сироп».
Предложены методики качественного и количественного анализа основных
действующих веществ в лекарственном растительном сырье (ЛРС), ФСРП и ЛРП,
отвечающие принципам унификации, предъявляемым к современному
фармацевтическому анализу (Самылина И.А. и др., 1994; 2006). Разработанные методики внедрены в работу кафедр фармации ИДПО, фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии Башкирского государственного медицинского университета, фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета.
На основании проведенных исследований разработаны проекты НД «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего», «Первоцвета весеннего сироп» (согласован с ООО «Травы Башкирии»).
Методология и методы исследования. Методология диссертационного
исследования основана на информационно-аналитическом поиске отечественных и
зарубежных литературных данных по фармакогностическому,
фитотехнологическому, фармакологическому исследованию первоцвета весеннего,
оценке изученности и актуальности темы; фитохимическом, анатомо-
морфологичеком, стандартизационном, фармакологическом исследовании
лекарственного растительного сырья и ЛС на его основе.
В ходе выполнения диссертационной работы использованы физические, физико-химические, химические, макро- и микроскопические, фармакологические и статистические методы анализа.
Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертация
выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования
«Башкирский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России) по проблеме «Изыскание и изучение новых лекарственных средств» (государственная регистрация № 01200707996).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Результаты фитохимического исследования сырья первоцвета весеннего для получения лекарственных растительных средств.
-
Результаты анатомо-морфологического исследования измельченного сырья травы первоцвета весеннего для стандартизации лекарственной формы – фильтр-пакет.
-
Результаты исследований по подбору оптимальных условий извлечения БАС и разработке способов получения экстрактов на основе травы первоцвета весеннего.
-
Результаты сравнительного фитохимического исследования сырья и экстрактов на основе травы первоцвета весеннего.
-
Результаты обоснования состава и технологии получения фармацевтической субстанции растительного происхождения «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего», лекарственного растительного препарата «Первоцвета весеннего сироп».
-
Результаты исследований по стандартизации и разработке методик качественного и количественного анализа ЛС «Густой экстракт из травы первоцвета весеннего», «Первоцвета весеннего сироп».
-
Результаты фармакологических исследований лекарственных растительных средств на основе травы первоцвета весеннего.
Степень достоверности. Достоверность полученных результатов
подтверждена проведением достаточного количества экспериментальных
исследований с применением современных методов исследований (колоночная,
тонкослойная хроматография, УФ-, ЯМР1Н-, ЯМР13С-спектроскопия, корреляционная
спектроскопия ЯМР 1H-1H COSY, 1H-13C HSQCED, НМВС, хромато-масс-
спектрометрия, микроскопия), позволяющих получать воспроизводимые и
достоверные результаты.
Статистическая обработка результатов исследований проводилась согласно требованиям ГФ РФ XIII издания с использованием программного обеспечения «Statistica 8.0», «MicrosoftExcel 2016».
Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования
представлены на ежегодных итоговых научных сессиях Башкирского
государственного медицинского университета (Уфа, 2012–2017); на II
международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации»
(Москва, 2012); на международной конференции «Кластерные подходы
фармацевтического союза: образование, наука и бизнес» (Белгород, 2012); на VIII, IX международных симпозиумах «Фенольные соединения: фундаментальные и
прикладные аспекты» (Москва, 2012; 2015); на Всероссийской молодежной конференции «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов» (Уфа, 2012); на международных конференциях «Экобиотех» (Уфа, 2011; 2013); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фармацевтическое образование, современные аспекты науки и практики» (Уфа, 2016); на VII Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация – потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2017); XXIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2017).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, 10 из которых опубликованы в журналах, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ. Имеются 3 патента РФ на изобретение.
Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного
исследования используются в учебном процессе кафедр фармации ИДПО,
фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии Башкирского
государственного медицинского университета, кафедры фармакогнозии с ботаникой
и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета,
ООО «Травы Башкирии», в Государственном бюджетном учреждении
здравоохранения «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» (ГБУЗ «Лекконтроль»).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выполнении экспериментальных исследований, интерпретации, анализе и обобщении полученных результатов. На всех этапах исследования: от информационно-аналитического поиска, постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в докладах и научных публикациях – вклад автора является определяющим.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Диссертационное исследование соответствует паспорту научной специальности 14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия» (пунктам 2, 3, 6).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 175 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литература (1 глава), экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (главы 2, 3, 4, 5), общих выводов, списка литературы, приложений. В диссертации содержится 54 таблицы, 52 рисунка. Библиографический список состоит из 152 источников, из которых 111 отечественных и 41 иностранных.
Применение первоцвета весеннего в народной и научной медицине
Лечение и профилактика различных заболеваний растительными лекарственными средствами является давней традицией во всем мире и не теряет своей актуальности по сегодняшний день [56, 68, 96, 100]. Еще в древности для лечения туберкулеза, цинги и малокровия использовали листья первоцвета в виде порошка, а цветки – для лечения глазных инфекций [120]. Для облегчения дыхания в Турции использовали сушеную траву. Первоцвет также используют как витаминную траву для салатов, например, в Нидерландах и Англии [133].
Греки называли первоцвет «цветком двенадцати богов» или «цветком Олимпа» и верили, что он является лекарством от всех болезней [121]. А на Украине считали, что первоцвет может сохранить жизнь и уберечь от горя и невзгод; поэтому с ним никогда не разлучались и зашивали в тряпицу [26].
В народной медицине многих стран водные вытяжки первоцвета весеннего применяют при лечении бронхита, гриппа, ангины, риносинусита, астмы, полли 26 ноза, невроза, как седативное, диуретическое, спазмолитическое, сосудорасширяющее средство [115, 119, 148]. Известны факты использования в сборах листьев P. veris L. при сахарном диабете.
Опыт народной медицины привлекает внимание современных исследователей [136, 145]. В частности, была доказана эффективность использования растений рода примула для лечения судорог.
В тибетской медицине данное растение применяли для лечения заболеваний крови, заживления ран и подавления опухолей [52]. Ученые заинтересовались этим свойством первоцвета; было проведено исследование по воздействию метанольной фракции первоцвета на раковые клетки толстой кишки, и доказана проапоптотическая активность изучаемого экстракта [131, 134, 140]. Благодаря уникальному составу первоцвет проявил ингибирующее действие на клетки рака.
Первоцвет весенний богат фенольными соединениями, обуславливающими ряд фармакологических свойств: участие в окислительно-восстановительных процессах, повышение прочности стенок капилляров, снятие спазмов сосудов, заживление ран, а также антиканцерогенное и антитромботическое действие [80, 81, 104]. Была исследована и обоснована связь между содержанием фенольных соединений и антиоксидантной активностью [58, 118, 144]. В этой связи первоцвет весенний является перспективным источником антиоксидантов [55, 64].
Это доказывает и изучение содержания диеновых конъюгатов в растении. Диеновые конъюгаты могут использоваться как показатели интенсивности пери-кисного окисления липидов (ПОЛ), так как являются его первичными метаболитами [55, 142]. По полученным данным наиболее богатая антиоксидантными свойствами часть растения – цветок.
По литературным данным, цветки первоцвета обладают противовоспалительным, противовирусным и противоаллергическим действием. Достаточно широко и подробно изучены лепестки P. veris L. и экстракты на их основе. С помощью ВЭЖХ в спиртовых экстрактах на основе лепестков обнаружены ан-тоцианы, тритерпеновые сапонины, флавоноиды, а также гликолизированные производные. Посредством масс-спектроскопии идентифицированы производ 27 ные кверцетина: кверцетин-3-O-гентибиозид, кверцетин-3-О-рутинозид, кверцетин-тригексозид, а также 3-О-рутинозид, кемпферол-3-O-галактозид-рамнозид-7-O-рамнозид, катехин3-О-диглюкозид-7-О-глюкозид, сапониновая кислота примулы I или первоцветная кислота I [55, 64].
Водные, водно-спиртовые извлечения, порошок, салат из листьев P. veris L. используют как раствор, обогащенный каротиноидами, витаминами А, С, Е, при авитаминозах.
В большинстве стран первоцвет весенний разрешен как пищевое салатное растение, культивируется и реализуется как приправа. В РФ по ГОСТ 3166-76 листья используют как пищевое витаминное растительное сырье [36]. Свое применение первоцвет весенний нашел и в гомеопатии [50].
В России зарегистрированы препараты в различных лекарственных формах и применяемых при множестве заболеваний (таблица 4) [40, 107]. Так, например, изучено и доказано отхаркивающее действие корней первоцвета весеннего за счет усиления секреции бронхиальных желез. Препаратом на основе корней первоцвета является «Гербион сироп первоцвета», используемый для лечения острых респираторных заболеваний (ОРЗ), сопровождающегося кашлем взрослых и детей [109]. Комбинированный препарат «Бронхикум эликсир» обладает отхаркивающим, бронходилатирующим и противомикробным действием. Препарат «Синупрет» обладает муколитическим, противовоспалительным, отхаркивающим действиям. Уменьшает отек, способствуя оттоку экссудата из пазух носа. Препарат также обладает противовирусной, антимикробной и иммуномодули-рующей активностью; показан к применению при острых и хронических синуситах. Препарат «Бронхипрет ТП» оказывает отхаркивающее, секретолитическое, бронхолитическое, противовоспалительное действие, снижает вязкость мокроты, способствует ее эвакуации.
В экспериментальных исследованиях, проведенные в ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, у травы P. veris L. выявлены антигипоксантная, антиоксидантная, ангиопротекторная, эндотелиопротекторная активности [4, 42, 43, 44].
На фармацевтическом рынке РФ присутствуют зарубежные ЛРП на основе данного растения, используемые преимущественно в качестве отхаркивающих, бронхолитических средств, и БАД к пище в качестве дополнительных источников пищевых веществ, используемых для коррекции ряда гинекологических заболеваний [48, 86].
Таким образом, проведенный анализ данных литературы показал достаточную изученность состава действующих веществ сырья P. veris L. и широкое применение препаратов, преимущественно на основе подземных органов, лишь только в качестве отхаркивающих, бронходилатирующих, противовоспалительных средств [74].
Однако вновь выявленные фармакологические свойства изучаемого растения позволяют расширить область применения и возможность его использования в медицинской практике, в частности, при ХНИЗ.
Несмотря на широкое применение ЛРП и БАД к пище на основе P. veris L. в медицинской и фармацевтической практике препараты отечественного производства на его основе до сих пор не созданы.
Выделение и идентификация основных групп биологически активных соединений
Выделение и установление структуры выделенных соединений из изучаемого сырья проводили совместно с кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ и лабораторией физико-химических методов анализа Уфимского Института химии Российской академии наук (УфИХ РАН).
Препаративное выделение основных групп БАС проводили из сухого ЛРС, измельченного до частиц размером 1–3 мм. Для чего было взято от 100,0 г до 500,0 г сырья. Ранее было установлено, что оптимальным экстрагентом, обеспечивающий мак 68 симальный выход фенольных соединений, является спирт этиловый 70%.
Извлечения концентрировали путем упаривания под вакуумом до водного концентрата, его подвергли фракционированию методами избирательной жидкостной экстракции. Далее соединения разделяли с помощью адсорбционной колоночной хроматографии, сорбент – силикагель L 40/100 и L 100/110 мкм (Чехия).
Соединения элюировали в ступенчатом режиме хлороформом, спирто-хлороформными смесями и спиртом этиловым. Хроматографируемые вещества разделяли по фракциям одинакового состава, упаривали под вакуумом. Выделение индивидуальных БАС осуществляли на микроколонках с полиамидным сорбентом («Wolem DC»).
При выполнении избирательной жидкостной экстракции очищенные концентраты извлечений обрабатывали органическими растворителями (бутанолом, диэтиловым эфиром, хлороформом, этилацетатом). Обработку повторяли 6–8 раз. Извлечения упаривали под вакуумом до полного удаления растворителя. Соединения во фракциях разделяли с помощью кристаллизации и перекристаллизации, рехроматографией на полиамиде и силикагеле.
Фракционирование БАС контролировали методом тонкослойной хроматографии, а также методом УФ-спектроскопии. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках «Sorbfil» (марок ПТСХ-П-А и ПТСХ-АФ-А-УФ), "Silufol" UV 254, 366, используя следующие системы растворителей: БУВ (4:1:2), хлороформ – спирт этиловый – вода (26:16:3); наиболее эффективной оказалась система БУВ (4:1:2).
УФ-спектры водно-этанольных извлечений из сырья и растворов выделенных соединений регистрировали на спектрофотометре «Specord 40».
Для выделения БАС высушенное измельченное растительное сырье – надземную часть первоцветов весеннего (500,0 г) экстрагировали раствором спирта этилового 70% в соотношении 1:10 методом дробной мацерации. С целью очистки извлечения от липофильных веществ экстракт сутки отстаивали в холодильнике, после чего осадок отфильтровывали. Извлечение упаривали при t=40– 60С на вакуумном испарителе до получения густого остатка (около 50 мл). Сгу 69 щенный экстракт смешивали с силикагелем L40/100 (50 г), полученную смесь (извлечение + силикагель) переносили на хроматографическую колонку (d=5 см, h=3 см), предварительно заполненную силикагелем в смеси с хлороформом.
Элюирование БАС проводили последовательно хлороформом, далее раствором спирта этилового 96% в хлороформе в следующих концентрациях (1%, 3%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%) и спиртом этиловым 96%. Фракционное разделение БАС контролировали методами ТСХ, УФ-спектроскопии. Результаты фракционного разделения БАС представлены в таблице 14.
Последующую очистку фракций выполняли методом рехроматографии на микроколонках с полиамидным сорбентом. Элюировали водой очищенной и водно-спиртовыми растворами соответствующих концентраций (20%, 40%, 70%, 96%). Фракции с одинаковыми веществами объединяли, при необходимости упаривали. Выпавшие осадки отделяли, перекристаллизовывали из водно 70 спиртовых растворов и спирта этилового.
В ходе проведенных исследований были получены следующие фракции. Во фракциях 6–15 (элюент – раствор спирта этилового в хлороформе в соотношении 1:99) выделены вещества, представляющие собой густые маслянистые жидкости от желтовато-зеленого до темно-зеленого цвета.
В ходе дальнейших исследований соединения из данных фракции были отнесены к флавоноидам полиметоксилированного ряда [127]. Фракции 30–37 содержали соединения кумаринового ряда, фракции 38–50 – простые фенолы. Фракции 60–68 содержали соединения, отнесенные к фенолокислотам, фракции 69–75 содержали окискоричные кислоты, фракции 76–84 – дубильные вещества, фракции 85–105 – флавоноиды.
При выполнении данных исследований были использованы известные групповые методики выделения фенольных соединений. Схема выделения индивидуальных веществ представлена на рисунке 16.
Идентификация. Структуру выделенных соединений определяли на основании результатов 1Н-ЯМР, 13С –ЯМР- спектроскопии; корреляционной спектроскопии ЯМР1Н-, 1H COSY, 1H-13C HSQCED, НМВС; хромато-масс-спектрометрии, а также принимались во внимание физико-химические свойства, данные УФ – спектроскопии и ТСХ (путем сравнения со стандартными образцами веществ).
В ходе проведенных исследований во фракциях 6–15 были определены по-лиметоксилированные флавоноидные соединения, являющиеся хемотаксономи-ческими маркерами для рода Primula L. По результатам выполненного исследования выделено 9 соединений. Из P. veris L. впервые выделено и идентифицировано новое природное вещество 3 ,4 -метилендиокси-5 - метоксифлавон (патент № 2532999 от 20.01.15). Результаты исследований приведены в таблице 15 и на рисунках 17–27.
Таким образом, в ходе проведенных фитохимических исследований сырья P. veris L. идентифицированы следующие соединения: витамины, среди которых фолиевая кислота, пиридоксина гидрохлорид и тиамина гидрохлорид обнаружены впервые; 4 соединения из группы органических кислот; 28 поли-фенольных соединений, из них 18 флавоноидных соединений (в том числе 9 полиметоксилированных), 2 кумарина, 1 соединение из группы простых фенолов, 1 – из группы дубильных веществ, 5 – из группы оксикоричных кислот, 1 фенолокислота; из класса тритерпеновых сапонинов идентифицирован эсцин, а также идентифицировано 9 липофильных соединений. Результаты количественного определения основных групп БАС в сырье P. veris L. представлены на диаграмме (рисунок 28).
Разработка методов стандартизации и контроля качества густого экстракта
С учетом преемственности подходов к стандартизации в ряду «ЛРС – субстанция – ЛП» для стандартизации полученного экстракта использованы разработанные методики качественного и количественного анализа для сырья P. veris L., адаптированы для ГЭТПВ, установлены нормы их содержания [73].
Для этого было приготовлено водно-спиртовое извлечение из ГЭТПВ: 0,5 г густого экстракта растворяли в 100 мл 70% спирта этилового.
Разработка методики качественного и количественного определения флавоноидов в ГЭТПВ Анализ качественного состава флавоноидов в ГЭТПВ проводили методом ТСХ в экспериментально выбранной ранее оптимальной системе растворителей – БУВ (4:1:2).
Количественное определение флавоноидов проводили спектрофотомет-рическим методом в пересчете на рутин по адаптированной методике, разработанной ранее (глава 2, раздел 2.3.4.).
С использованием данной методики было проанализировано пять партий экстрактов (таблица 40).
Из данных таблицы видно, что содержание суммы флавоноидов в ГЭТПВ составляет от 5,97 до 6,81%.
Разработка методики качественного и количественного обнаружения сапонинов в ГЭТПВ
Анализ качественного состава сапонинов в ГЭТПВ проводили методом ТСХ в экспериментально выбранной ранее, оптимальной системе растворителей: этилацетат – спирт метиловый – диэтиламин (70:20:15).
При использовании данной системы в исследуемых образцах экстракта обнаружены зоны адсорбции с Rf 0,42; Rf 0,55; Rf 0,79; Rf 0,82, Rf 0,97. Зона адсорбции СО эсцина составила Rf 0,79. Таким образом, в исследуемых образцах идентифицирован эсцин.
Количественное определение сапонинов проводили спектрофотометриче-ским методом в пересчете на эсцин по методике разработанной нами (глава 3, раздел 3.1.5).
По данной методике было проанализировано пять партий экстрактов (таблица 41).
Из данных таблицы видно, что содержание сапонинов в пересчете на эсцин в ГЭТПВ составляет от 12,69 до 13,05%.
Валидацию методик качественного определения суммы флавоноидов и сапонинов проводили по специфичности хроматографической системы. Специфичность методики определяли по совпадению между собой основных зон адсорбций, по их соответствию указанной методике в образцах сырья.
Приемлемость оценивалась по совпадению зон адсорбций различных исследуемых образцов сырья описанию методики. Проведенные исследования показали, что зоны адсорбции исследуемых образцов совпали между собой и соответствовали описанной методике.
Валидационная оценка методик количественного определения суммы флавоноидов и сапонинов проводилась по показателям: правильность, прецизионность, специфичность, линейность, подобно обсужденных в главе 3, раздел 3.3.2. По данным исследования установили, что разработанная методика хорошо воспроизводима, доступна, проста в исполнении, не требует особых затрат.
Оценка с использованием разработанных методик остаточного содержания БАС в отработанном сырье показала: содержание суммы флавоноидов и сапонинов не более 0,1%.
Для стандартизации ГЭТПВ были установлены показатели качества: содержание тяжелых металлов – не более 0,001%, потеря в массе при высушивании – не более 25%.
Так как при получении густого экстракта используется спирт этиловый, было целесообразно определение остаточного содержания органического растворителя в готовом продукте. Испытание проводили методом газо-жидкостной хроматографии согласно ГФ РФ ХIII издания. Было установлено содержание спирта этилового не более 50 мг/сут.
Микробиологическую чистоту определяли в соответствии с требованиями ГФ РФ ХIII издания. Анализ показал, что густой экстракт травы P. veris L. соответствуют требованиям, предъявляемым к средствам растительного происхождения.
На основании полученных результатов были установлены показатели и нормы качества ГЭТПВ (таблица 42).
Сравнительный анализ антиоксидантной активности сиропов на основе густого экстракта первоцвета весеннего
Следующим этапом исследований было проведение сравнительного анализа антиоксидантной активности сиропов, полученных различными способами.
Исследования проводили методом хемилюминесценции на модели желе-зоиндуцированной ХЛ в двух модельных системах, ранее использованных для изучения АОА ГЭТПВ [46].
При добавлении в модельную систему, генерирующую АФК, сиропов, уменьшалась амплитуда быстрой вспышки, удлинялся латентный период, медленная вспышка начиналась позже и угасала раньше, значение максимальной светимости снижалось. Вследствие этого самая показательная характеристика хемилюминесценции – светосумма свечения – была меньшей по сравнению с контролем (рисунок 49).
Далее для исследования была использована модельная система, в которой протекают реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Внесение в МС желточных липопротеидов сиропов также сопровождалось уменьшением параметров светосуммы и амплитуды максимального свечения, наибольшую активность проявил сироп 2 (рисунок 50).
В таблице 56 приведены данные о влиянии сиропов травы P. veris L. на ХЛ модельной системы, инициирующей реакции ПОЛ.
В обеих МС исследуемые сиропы с ГЭТПВ действовали в одинаковом направлении: снижали процессы образования свободных радикалов.
После проведенных исследований по разработке технологии приготовления сиропа первоцвета весеннего предложена технологическая схема производства, представленная на рисунке 51.
Процесс получения сиропа первоцвета весеннего состоит из следующих стадий: ВР 1 Подготовка производства. ВР 2 Подготовка сырья и материалов. ТП 3 Приготовление сиропа. УМО 4 Фасовка и упаковка сиропа.
Для приготовления сиропа используют помещения 3 классу чистоты. Проводят очистку воздуха, технологического оборудования, производственных помещений, технологической одежды и персонала.
В процессе подготовки сырья и материалов производят отвешивание вспомогательных веществ и густого экстракта.
Технология производства сиропа включает следующие этапы: приготовление сахарного сиропа, введение ингредиентов в сахарный сироп, фильтрация (рисунок 51).
Растворение экстракта проводят в десятикратном объеме воды очищенной при температуре 40С с постоянным перемешиванием в течение 30 мин. Для получения сиропа сахарного в сироповарочный котел подают воду очищенную. Воду подогревают до 50–60С, после чего, не прекращая нагревания, при непрерывном перемешивании вводят рассчитанное количество сахара. Скорость вращения якорной мешалки около 30–40 оборотов в минуту. После полного растворения сахара раствор доводят до кипения. Продолжительность варки не должна превышать 30 мин, так как длительное нагревание сиропа может вызвать кара-мелизацию сахара, что повлечет за собой пожелтение или потемнение сиропа.
Готовность сиропа определяют по концентрации в нем сахара с помощью рефрактометра. Полученный сироп фильтруют. В приготовленный и охлажденный до 40С сахарный сироп добавляют консервант (натрия бензоат), предварительно растворенный в воде очищенной в соотношении 1:1, при вращении мешалки со скоростью 50 оборотов в минуту. Перемешивание проводят в течение 20 минут. Введение раствора экстрактов в сироп проводят при температуре 40С при вращении мешалки со скоростью 50 оборотов в минуту. Перемешивание проводят в течение 30 минут. Фасовка готового сиропа производится по 100 мл во флаконы оранжевого стекла, укупоренные крышками.