Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Краткая историческая характеристика 9
1.2. Характеристика семейства, рода 10
1.3. Агротехника. Условия произрастания 11
1.4. Описание растения 12
1.5. Химический состав 15
1.6. Роль ферментативных комплексов хрена обыкновенного, обуславливающих его применение в медицинской практике ...22
1.7. Использования в медицине ..24
1.8. Современные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья и получение из него лекарственных форм ..26
Выводы к главе 1 31
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования. ..32
ГЛАВА 3. Изучение фитохимического состава корневища и корней хрена обыкновенного .
3.1. Изучение качественного состава биологически активных веществ (БАВ) корневища и корней хрена обыкновенного 38
3.2. Хроматографическое изучение БАВ корневища и корней хрена ...40
3.3. Определение термических характеристик 45
3.4. Определение содержания эфирного масла 49
3.5. Определение содержания липидного комплекса 50
3.5.1. Определение физико-химических показателей и разработка характеристик подлинности липидного комплекса сырья хрена...57
3.5.1.1. Определение показателя плотности 57
3.5.1.2. Определение показателя преломления 58
3.5.1.3 Определение значения кислотного числа 59
3.5.1.4. Определение числа омыления 60
3.5.1.5. Определение значения йодного числа .61
3.5.1.6. Определение цветности липидного комплекса и порошка корневища и корней хрена до и после отгона эфирного масла 62
3.6. Измерение пероксидазной активности сырья хрена 63
3.7. Устойчивость пероксидазной активности в сырье к различным воздействиям 67
3.8. Определение содержания фенольных соединений в корневище и корнях хрена 71
3.9 Определение содержания антиоксидантных компонентов в сырье корневище и корни хрена ...77
Выводы к главе 3 79
ГЛАВА 4. Стандартизация хрена обыкновенного
4.1. Разработка характеристик подлинности корневища и корней хрена обыкновенного 81
4.1.1. Изучение внешних признаков 81
4.1.2. Исследование анатомо-диагностических признаков, микроскопический анализ 82
4.1.3. Качественные реакции на основные группы БАВ корневище и корней хрена обыкновенного 103
4.2. Разработка показателей качества хрена обыкновенного
4.2.1. Определение содержания примесей 103
4.2.2. Определение содержания влажности 104
4.2.3. Определение содержания золы общей 105
4.2.4. Определение содержания золы нерастворимой в 10 % хлороводородной кислоте ...107
4.3. Количественное определение БАВ хрена обыкновенного 109
Выводы к главе 4 110
Общие выводы 111
Список литературы ...114
- Роль ферментативных комплексов хрена обыкновенного, обуславливающих его применение в медицинской практике
- Хроматографическое изучение БАВ корневища и корней хрена
- Устойчивость пероксидазной активности в сырье к различным воздействиям
- Качественные реакции на основные группы БАВ корневище и корней хрена обыкновенного
Введение к работе
Интерес к лекарственным растениям повышается с каждым годом. Важной задачей современной науки представляется поиск новых эффективных препаратов растительного происхождения. Все чаще современная медицина обращается к фитопрепаратам, которые используются в качестве полуфункциональных средств для лечения и профилактики различных заболеваний. Известно, что задача всех фитокомплексов, содержащих биологически активные вещества (полифенолы, сапонины и др.) оказывать адаптогенное влияние на живой организм, мобилизируя его гомеостатические механизмы.
Постоянно расширяющийся ассортимент лекарственных растительных средств требует эффективного контроля их качества, поэтому исследования, направленные на разработку и совершенствование нормативной документации имеет большое значение.
Корневище и корни хрена издавна использовались в народной медицине как мочегонное, противовоспалительное, противоцинготное, противомикробное, раздражающее, отхаркивающее, витаминное, фитонцидное средство. Несмотря на широкое использование фитотерапевтами, сырье корневище и корни хрена обыкновенного в России не является официнальным.
Благодаря разнообразному химическому составу и широкому спектру действия корневище и корни хрена рассматриваются как перспективный источник лекарственного растительного сырья, вследствие этого возникает необходимость подробного изучения фотохимического состава и разработка обоснованной нормативной документации.
( Цели и задачи исследования.
Целью данной работы явилось изучение физико-химических и
* фармакогностических характеристик нового вида лекарственного
растительного сырья, корневище и корни хрена обыкновенного, обоснование методов определения подлинности и доброкачественности с последующей разработкой показателей качества нормируемых при стандартизации.
#'
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести фитохимическое изучение сырья корневище и корни хрена с выбором основных групп БАВ и последующим определением их содержания;
Изучить особенности выделения липидного комплекса из сырья корневище и корни хрена различными экстрагентами, и на основании проведенных исследований разработать оптимальные условия выделения;
Определить физико-химические показатели и разработать характеристики подлинности липидного комплекса сырья;
.4. Изучить пероксидазную активность сырья корневище и корни хрена; 5. Разработать характеристики подлинности сырья корневище и корни хрена:
- исследование внешних признаков сырья,
проведение микроскопического анализа и выявление диагностических признаков сырья;
исследование качественных реакций на основные биологически активные вещества (БАВ);
'*
Определить содержания: влаги, золы общей и нерастворимой в соляной кислоте, органической и минеральной примесей в сырье хрена и на их основе нормировать числовые показатели данного сырья;
На основании полученных данных обосновать необходимые показатели качества и методы стандартизации сырья корневища и корней хрена.
Научная новизна.
Впервые проведено исследование пероксидазной активности корневища и корней хрена и на основании полученных данных рекомендовано включение водно-спиртового экстракта из сырья хрена в комплексное профилактическое средство для применения в стоматологической практике при заболеваниях пародонта, принятое на рассмотрение институтом патентной экспертизы (заявка на изобретение № 110.3Р0 от 07.04.04 г.).
Разработаны оптимальные условия выделения липидного комплекса из корневища и корней хрена различными методами экстракции.
Впервые определены физико-химические показатели липидного комплекса и разработаны характеристики подлинности липидного комплекса.
Выявлены диагностические признаки корневища и корней хрена на основании проведенного анатомо-морфологического анализа. Проведены качественные реакции на основные БАВ.
Определены и нормированы числовые показатели: влаги, золы общей и нерастворимой в соляной кислоте, органической и минеральной примесей в сырье корневища и корни хрена.
На основании полученных данных были обоснованы показатели качества и методы стандартизации сырья корневище и корни хрена обыкновенного.
Практическая значимость работы.
На основании проведенных исследований апробированы и внедрены: в лаборатории ОАО «Красногорсклексредства» методики количественного определения липидного комплекса и суммы фенольных соединений в измельченных корнях хрена обыкновенного;
- на ЗАО АПФ «Фито-ЭМ» в процесс контроля качества определения показателей подлинности сырья корневище и корни хрена обыкновенного.
Изучена пероксидазная активность экстрактов из сырья корневище и корни хрена, дана рекомендация для использования пероксидазы хрена в качестве пищевых добавок
Разработан проект фармакопейной статьи (ФС)'на сырье корневище и корни хрена в основу которого положены разработанные характеристики подлинности корневища и корней хрена с установлением диагностических признаков; определены и нормированы числовые показатели на данное сырье, которые могут быть включены в соответствующие проекты ФС.
Роль ферментативных комплексов хрена обыкновенного, обуславливающих его применение в медицинской практике
Пероксидаза хрена применяется в качестве метки в иммуноферментном анализе, на основе которого разрабатываются и внедряются в медицинскую практику тест- системы для определения различных лекарственных веществ, таких, как гормоны, онкомаркеры, иммуноглобулины и т.д. Иммуноферментный набор такого типа используется для целей диагностики инфекционных и аллергических заболеваний, для осуществления лекарственного мониторинга [57,72].
Особо следует отметить особые свойства веществ, выделяемых из хрена. Так, известно, что полифенолы из хрена, добавленные в культурную среду клеток Hela значительно подавляют образование сульфоксид радикалов в микросомах и митохондриях, выделяемых из этих клеток после облучения жестким УФ [114]. Особенный интерес представляет тот факт, что митохондрии, изолированные из миокарда молодых (3 мес, 18 мес.) животных (крыс), неодинаково ассимилируют кислород в системе «дыхание» in vitro. Активность синтеза АТФ и потребление Ог возрастают у молодых в 1,5 раза, а у старых в 2,6, в случае когда животным (при жизни) вводили нейтрализованные кислотные экстракты из высушенных корней хрена [118].
Из гомогенатов корней хрена описано выделение гетероциклических веществ имидазольной и пирролидиновой природы, которые предположительно являются метаболитами обмена нуклеотидов. Известно, что эти вещества обладают способностью уменьшать скорость свертывания крови in vitro, за счет подавления активности протромбина [119]. Из корней хрена была выделена фракция термостабильных веществ группы флавоноидов, которые служат основой для биосинтеза ФМН и ФАД-кофакторов и обладают автономной антиоксидантной активностью (АОА). Выделенные вещества были испытаны на АОА в системе (in vitro), содержащих супероксидцисмутазу и изолированные митохондрии миокарда крыс. В тоже время полезность введения пероксидаз растений с пищей обусловлена её структурой, содержащей гем. Хотя в литературе практически нет сведений именно об употреблении нативной пероксидазы хрена в пище, но есть основания полагать, что полезные для медицины свойства хрена в значительной степени обусловлены и наличием гем-содержащего фермента - пероксидазы. Особую роль в пищевой промышленности играют мутантные формы, позволяющие производить трансгенные овощи. Целебные свойства хрена давно используются в народной медицине. Корень и препараты из хрена обладают противовоспалительными [5,43], мочегонными, раздражающими, витаминными, отхаркивающими, сокогонными, фитонцидными, противоцинготными, болеутоляющими противомикробными и противогрибковыми свойствами [28,35,53,55]. Также есть сведения о противоопухолевом действии [12,19,35,61,74]. В народной медицине многих стран хрен применяют при водянке, затрудненном мочеиспускании, образовании камней в мочевом пузыре, желчекаменной болезни, хроническом ревматизме, невралгиях, радикулитах, ишиасе, подагре, как средства возбуждающее аппетит и усиливающее деятельность кишечника [17,39,46,55]. Хрен также употребляется при остановке менструации, малокровии, цинге и болезнях дыхательных органов с влажным кашлем, при малярии, при различных болезнях кожи, при костно-суставных болях и при шпорах, при сахарном диабете [35,42,47,55]. В виде настоя и сока хрен, рекомендуется при заболеваниях печени, насморке, синусите, гайморите [35,42,47,55,74]. Настой используют для профилактики инфекционных заболеваний, дизентерии; отвар корней применяют при атеросклерозе, гипертонии. В народной медицине кашицу, свежий сок, настой из корней хрена, а также порошок семян рекомендуется принимать внутрь при онкологических заболеваниях различной локализации[12,19,35,55,74]. В индийской медицине корни растения применяли как мочегонное и отвлекающее средство при воспалении седалищного нерва. Водные растворы хрена, чаще его сока, в соотношении 1:3 используются в качестве полосканий при воспалении слизистой полости рта, горла. Сок растения закапывают в уши при воспалении и гнойных выделениях [35,41,47,55], Настой и кашицу хрена употребляют и как эффективное косметическое средство для обмывания лица против веснушек, загара и темных пигментных пятен на коже [42,35,55]. Хрен в тертом виде широко используется как острая приправа с мясной и рыбной пищей. Прибавка его в пищу стимулирует образование витамина Ві в организме [3,74].
Применение хрена допустимо в лечебных целях под контролем врача с соблюдением . предписанной дозировки и продолжительности. Употребление хрена внутрь противопоказано при острых гастритах с повышенной кислотностью, язвенной болезни, энтероколитах, нефритах из-за раздражающего действия, острых воспалительных заболеваниях печени и почек. В случае передозировки может наступить воспалительная реакция слизистых оболочек, а также развиться интоксикация [35]. Горчичное масло, содержащееся в корнях хрена, обладает резко выраженным местным действием и вызывает гиперемию кожи и жгучую боль, а при длительном применении - ожоги кожи и гангрену. Пары масла хрена вызывают сильный кашель и слезотечение. После применения внутрь больших доз может вызвать явления тяжелого гастроэнтерита и почечные кровотечения. Употребление сока хрена в качестве мочегонного средства при отеках недопустимо при лечение отеков, связанных с патологией почек[35,42,43].
Хроматографическое изучение БАВ корневища и корней хрена
Из таблицы видно, что при снижении размера частиц с 3 до 2мм происходит значительное увеличение выхода липидного комплекса. Дальнейшее измельчение сырья не целесообразно поскольку в конечном продукте обнаруживается присутствие значительного количества мелкого порошка сырья хрена, который загрязняет поры фильтра, при этом выход липидного комплекса существенно не возрастает.
Таким образом, отмечено, что степень и характер измельчения существенно влияют на процесс экстрагирования. Оптимальным является измельчение сырья хрена обыкновенного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2мм.
Соблюдая вышеописанную методику, варьировали применяемым экстрагентом. Для экстракции использовали хлороформ, смесь хлороформ :метанол-2:1 (метод Фолча), смесь хлороформ : метанол -1:1 (метод Блая), гексан, петролейный эфир. Время экстракции 5 часов (табл.10). По данным, приведенным в табл. 10, видно что использование в качестве экстрагента смеси хлороформ : метанол (2:1) (метод Блая) и хлороформ: метанол (1:1) (метод Фолча) значительно повышает выход липидного комплекса корневища и корней хрена.
Повышение содержания липофильной фракции объясняется введением в экстракционную смесь метанола, который дезактивирует ферменты, вызывающие разрушение липидов во время экстракции, разрушает комплексы липидов с белками, растворяет структурные липиды.
Но использование метанола в качестве возможного экстрагента нежелательно из-за его токсического действия.
Дальнейшее исследование с применением других экстрагентов, таких как хлороформ и петролейный эфир (гексан), показывает снижение выхода липидного комплекса. Так при использовании в качестве экстрагента хлороформ (метод Сокслета) выход липидного комплекса 5,95%. Однако, в качестве метода стандартизации по содержанию действующих веществ предлагается методика количественного определения липидного комплекса, включающая экстракцию липидного комплекса хлороформом, несмотря на то, что использование данного растворителя в качестве экстрагента значительно снижается выход липидного комплекса. Выбор именно хлороформа для экстракции связан с наименьшей токсичностью. Методика количественного определения содержания липидного комплекса сырья корневище и корни хрена обыкновенного. Навески сырья хрена, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2мм, помещают в предварительно взвешенные до постоянной массы патроны из фильтровальной бумаги. Определяют точную массу каждой навески. Патроны с навесками помещают в рабочую часть аппарата Сокслета и проводят экстракцию хлороформом в течение 5 часов. Затем вынимают 5 патронов, высушивают до постоянной массы и определяют выход липидного комплекса (X, %) в пересчете на абсолютно сухое сырье по формуле: Mi - масса бумажного патрона, г М2 - масса патрона с сырьем до обезжиривания, г М3 - масса патрона с обезжиренным сырьем, г W - потеря в массе при высушивании сырья, % Содержание липидного комплекса в пересчете на абсолютно сухое сырье не менее 5,5%. Липидный комплекс корневища и корней хрена представляет собой густую жидкость темно-зеленого, коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом. Определение плотности проводили с использованием пикнометра по методике ГФ XI, вып.1, С.24-25. Результаты определения плотности масла сырья хрена представлены в табл. 11.
Устойчивость пероксидазной активности в сырье к различным воздействиям
Раздел микроскопия был выполнен в соответствии с требованиями ГФ XI, предъявляемые к -технике микроскопического исследования на подземные органы. С целью определения диагностических признаков корней хрена обыкновенного изучали анатомическое строение анализируемого сырья в сравнении с имеющимися литературными данными [69]. Микроскопический анализ проводился на поперечных и продольных срезах, а также на давленых препаратах и порошке подземных органов хрена обыкновенного.
Для приготовления поперечных и продольных срезов небольшие кусочки корней хрена обыкновенного помещали в холодную воду и выдерживали около суток, затем помещали в смесь 95% спирта и глицерина (1:1) на 3 суток. Размоченные объекты выравнивали скальпелем и делали срезы. Микропрепараты готовили в растворе глицерина.
Для приготовления давленых препаратов небольшие кусочки корней кипятили в 5%-ом растворе едкого натра в течение 3-5 минут, промывали водой, раздавливали между двумя предметными стеклами, часть раздавленного кусочка помещали на чистое предметное стекло в каплю глицерина, накрывали сверху покровным стеклом.
Для приготовления микропрепаратов порошка, порошок корней хрена обыкновенного делили на фракции с помощью сит. Делали несколько серий препаратов из каждой фракции. Небольшое количество порошка с помощью препаровальной иглы помещали в каплю раствора глицерина и накрывали покровным стеклом.
При рассмотрении поперечного среза корня хрена видна покровная ткань - многослойная пробка, состоящая из узких мелких клеток. Паренхима коры рыхлая с большими воздухоностными полостями. Клетки коровой паренхимы с утолщенной оболочкой, по направлению к центру корня паренхимные клетки несколько уменьшаются в размерах. Клетки заполнены крахмальными зернами простыми и сложными, состоящими из 2-4 простых. В первичной коре присутствуют каменистые клетки желтоватого цвета, толстостенные, по форме от изодиаметрических до сильно-вытянутых, располагающиеся по одиночке или группами. Редко в коре встречаются волокновидные склереиды. Отдельные клетки паренхимы заполнены эфирным маслом. Линия камбия четкая. Основная ткань древесины представлена рыхлой паренхимой, ничем не отличающейся от паренхимы коры. В древесине видны толстостенные сосуды одиночные или в радиальных группах и концентрические пучки флоэмы, возникающие дополнительно из участков древесной паренхимы, принимающей характер меристемы. В древесине также встречаются отдельные волокна. Сердцевинные лучи выражены слабо, так как их клетки не отличаются от основной паренхимы (рис. 1,2,3,4,5,6,7,8,29,30,31,32,34).
На продольном тангентальном разрезе видна многослойная пробка бурого цвета. Клетки паренхимы изодиаметрические или вытянутые, содержат крахмальные зерна простые и сложные. В коровой части встречаются каменистые клетки одиночные или группами, а также отдельные клетки с эфирным маслом. Сосуды членистые: сетчатые, пористые, лестнично-пористые, сетчато-пористые (рис.9,10,11,12). В давленом препарате видны клетки пробки толстостенные 4-х 6-ти гранной формы. Клетки паренхимы с утолщенными стенками, овальной формы с крахмальными зернами. Сосуды членистые: сетчатые, пористые, лестнично-пористые, сетчато-пористые. Каменистые клетки различной формы. Редко встречаются отдельные волокна (рис.13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,33,36). При рассмотрении порошка видны обрывки пробки, фрагменты членистых сосудов, каменистые клетки отдельные или группами, обрывки паренхимы, обрывки волокон, отдельные клетки с эфирным маслом, отдельные крахмальные зерна, простые и сложные, состоящие из 2-4 простых. Изучение порошков в зависимости от степени измельчения Было проведено изучение микроскопии порошков следующих фракций: - менее 0,25 мм - 0,25-0,5 мм - 0,5-1мм. Во всех фракциях встречались обрывки пробки, обрывки паренхимы с простыми и сложными крахмальными зернами, клетки паренхимы с эфирным маслом, обрывки сосудов и волокон. Все три фракции хорошо диагностируются. Основными диагностическими признаками можно считать: механические элементы (каменистые клетки и волокна), клетки паренхимы с эфирным маслом (рис. 23,24,25,26,27,28,35).
Качественные реакции на основные группы БАВ корневище и корней хрена обыкновенного
Определение влажности проводили по методике ГФ XI статья «Определение влажности лекарственного растительного сырья».
Под влажностью понимают потерю в массе за счет гигроскопической влаги и летучих веществ, которую определяют в сырье при высушивании до постоянной массы. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц около 10 мм, перемешивали и брали две навески массой 3-5г, взвешивали с погрешностью ±0,01г. Каждую навеску помещали в предварительно высушенную и взвешенную вместе с крышкой бюксу и ставили в нагретый до 100-105С сушильный шкаф. Время высушивания отсчитывали с того момента, когда температура в сушильном шкафу вновь достигнет 100-105 С. Первое взвешивание проводили через 3 часа. Высушивание проводится до постоянной массы. Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями, после 30 мин. высушивания и 30 мин. охлаждения в эксикаторе, не превышает 0,01 г. Определение потери в массе при высушивании для пересчета количества действующих веществ и золы на абсолютно сухое сырье проводят в навесках 1-2 г (точная навеска),; взятых из аналитической пробы, предназначенной для определения содержания золы и действующих веществ вышеописанным методом, но при разнице между взвешиваниями, не превышающей 0,0005 г. Определение содержания золы общей проводилось по методике ГФ XI статья « Определение золы». Около 5г измельченного сырья хрена (точна) навеска) помещали в предварительно прокаленный и точно взвешенный фарфоровый тигель, равномерно распределяя вещество по дну тигля. Затем тигель осторожно нагревали, давая сначала веществу сгореть или улетучиться при возможно более низкой температуре. Сжигание оставшихся частиц угля проводили при возможности более низкой температуре; после того как уголь сгорел почти полностью, увеличивали пламя. При неполном сгорании частиц угля остаток охлаждали, смачивали насыщенным раствором нитрата аммония, выпаривали на водяной бане и остаток прокаливали снова. В случае необходимости такую операцию повторяли несколько раз. Прокаливание проводили при слабо красном калении (около 500С) до постоянной массы, избегая сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. По окончании прокаливания тигель охлаждали в эксикаторе и взвешивали. Содержание золы общей (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляли по формуле: Полученные данные показывают, что значение золы общей колеблется от 11,7 % до 13,2 %. Предлагаемая норма - не более 14 %. Для определения золы, нерастворимой в 10% хлороводородной кислоте, к остатку в тигле, полученному после определения золы общей прибавили 15 мл 10 % НС1, тигель накрывали часовым стеклом и нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 мин. К содержимому тигля прибавляли 5 мл горячей воды, обмывая ею часовое стекло. Содержимое фильтровали через беззольный фильтр, перенося на него остаток с помощью горячей воды. Фильтр с остатком промывали горячей водой до прекращения появления мути в промывных водах от капли 2 % раствора нитрита натрия (хлориды), переносили его в тот же тигель, высушивали, сжигали и прокаливали до постоянной массы.
