Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние исследований левзей сафлоровидной (обзор литературы) 11
1.1. Историческая справка 12
1.2. Ботанико-фармакогностическая характеристика левзей сафлоровидной 15
1.3. Географическое распространение 16
1.4. Лекарственное сырье 17
1.5. Химический состав 18
1.6. Стандартизация сырья левзей сафлоровидной 25
1.7. Фармакологические свойства 27
1.7.1. Фитоэкдизоны 27
1.7.2. Тритерпеноиды, фенолокислоты, витамины, микроэлементы, кумарины 28
1.7.3. Флавоноиды 30
1.8. Препараты левзей сафлоровидной и их применение 31
Выводы к главе 1 34
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования 35
2.1. Объекты исследования 36
2.2. Методы исследования 36
2.2.1. Метод колоночной хроматографии 36
2.2.2. Методы тонкослойной хроматографии и хроматографии на бумаге 36
2.2.3. Метод спектрофотометрии 37
2.2.4. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии 38
2.2.5. Методы, использованные для установления строения и идентификации выделенных соединений 39
Глава 3. Изучение химического состава лекарственного растительного сырья левзей сафлоровидной и препарата «Левзей экстракт жидкий» 41
3.1. Исследование химического состава корневищ с корнями левзей сафлоровидной методом тонкослойной хроматографии 41
3.2 Получение суммы биологически активных веществ из корневищ с корнями левзей сафлоровидной и их хроматографическое разделение 43
3.2.1. Получение фенольных соединений из корневищ с корнями левзей сафлоровидной 43
3.2.2 Получение экдистероидов из корневищ с корнями левзей сафлоровидной 45
3.2.3. Получение суммы биологически активных соединений из левзей экстракта жидкого 46
3.3. Физико-химическая характеристика выделенных соединений 47
Выводы к главе 3 54
Глава 4. Совершенствование методов стандартизации сырья и препаратов левзей сафлоровидной 55
4.1. Совершенствование методов стандартизации корневищ с корнями левзей сафлоровидной 55
4.1.1. Качественный анализ корневищ с корнями левзей сафлоровидной 56
4.1.2 Методика качественного анализа корневищ с корнями левзей сафлоровидной 61
4.1.3. Количественное определение корневищ с корнями левзей сафлоровидной 62
4.1.4 Методики количественного анализа корневищ с корнями левзей сафлоровидной 67
4.2. Совершенствование методов стандартизации левзей экстракта жидкого 71
4.2.1. Качественный анализ левзей экстракта жидкого 72
4.2.2. Методика качественного анализа левзей экстракта жидкого 73
4.2.3. Количественное определение суммы экдистероидов в левзей экстракте жидком 74
4.2.4. Методики количественного определения суммы экдистероидов в левзей экстракте жидком 77
Выводы к главе 4 82
Глава 5. Разработка проектов нормативной документации на сырье и препараты левзей сафлоровидной 83
5.1. Разработка проекта нормативной документации на корневища с корнями левзей сафлоровидной 83
5.2. Разработка проекта нормативной документации на лекарственное средство «Левзей экстракт жидкий» 92
5.2.1. Исследования по уточнению спектра фармакологической активности левзей экстракта жидкого 101
Выводы к главе 5 104
Общие выводы 105
Список литературы 107
Приложение
Проекты фармакопейных статей
- Химический состав
- Физико-химическая характеристика выделенных соединений
- Методики количественного анализа корневищ с корнями левзей сафлоровидной
- Разработка проекта нормативной документации на лекарственное средство «Левзей экстракт жидкий»
Введение к работе
Актуальность темы. Необходимость широкого применения в
медицинской практике адаптогенных лекарственных средств по-прежнему не
теряет своей актуальности. Это обусловлено тем, что одним из самых
распространенных неблагоприятных факторов в настоящее время являются
многочисленные стрессовые ситуации, которые существенно снижают
качество жизни человека, ухудшают общее самочувствие, могут приводить к
нервному и физическому истощению Лекарственные растения, обладающие
адаптогеным действием, могут помочь современному человеку справиться с
даішой проблемой В этом отношении особую ценность представляют
лекарственные растения, сочетающие стимулирующее влияние, как на ЦНС,
так и на активность скелетных мышц. Подобным комплексным действием
обладает левзея сафлоровидная (Leuzea carthamoides (Willd) Djin) - яркий
представитель богатой и разнообразной флоры Сибири и Дальнего Востока
На сегодняшний день это единственное фармакопейное растение,
обладающее выраженным анаболическим действием Данный эффект
обеспечивают такие биологически активные соединения (БАС), как
экдистероиды - вещества, способные стимулировать синтез белка минуя
гормональпый эффект синтетических анаболиков Кроме того, левзея богата
и флавоноидами, ответственными за аЕїтиоксидантное,
иммуностимулирующее и гепатопротекторное действие Однако химический состав левзей сафлоровидной, на наш взгляд, еще недостаточно изучен В настоящее время особенно ценным лекарственным сырьем считаются корневища с корнями левзей, из которых получают такие препараты, как «Экстракт левзей жидкий» и таблетки «Экдистен» (относится к средствам спортивной медицины) Тем не менее проблематичной представляется состояние нормативной документации (НД) на корневища с корнями левзей сафлоровидпой ( ФС 42-2707-99 ) и препарат «Экстракт левзей жидкий» (ФС 42-1995-99), особенно в части решения вопросов подлинности и химической стандартизации Так, в случае ФС в разделе качественное определение
4 (сырье) и подлинность (препарат) реакция со спиртовым раствором ванилина
не воспроизводится Кроме того, используемый для целей идентификации
ТСХ-анализ дает нечеткие результаты в плане определения экдистена,
несмотря на то, что в методиках используется Государственный стандартный
образец (ГСО) экдистерона (экдистен) В разделе «Количественное
определение» представляется нецелесообразным длительная (7 часов)
экстракция сырья таким токсичным реагентом, как метиловый спирт На наш
взгляд, как для идентификации, так и в целях количественного определения
может быть использована УФ-спектрофотометрия
Результаты современных исследований химического состава,
взаимосвязи «химический состав - фармакологическое действие»
обусловливают предпосылки для расширения спектра фармакологической
активности данного лекарственного растительного сырья
Таким образом, представляется актуальным дальнейшее
фитохимическое исследование сырья левзей сафлоровидной, разработка
новых подходов к решению проблемы химической стандартизации, а также
поиск новых путей в области применения препаратов левзей в медицинской
практике
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является
фитохимическое исследование корневищ с корнями левзей и разработка
новых подходов к решению проблемы стандартизации сырья и препаратов
растения
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи
Изучение химического состава корневищ с корнями левзей сафлоровидной
Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов корневищ с корнями левзей сафлоровидной с учетом принципа унификации методик в ряду лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма
5 3. Разработка методик качественного анализа корневищ с корнями
левзей сафлоровидной (ФС 42-2702-99), а также галенового препарата
«Экстракт левзей жидкий» (ФСП 42-1995-99)
Разработка методик количественного анализа корневищ с корнями левзей сафлоровидной и галенового препарата «Экстракт левзей жидкий»
Разработка проектов и изменений БД на корневища с корнями левзей и «Экстракт левзей жидкий»
Научная новизна. В результате изучения химического состава левзей сафлоровидной выделено и идентифицировано 3 индивидуальных вещества фенольной природы и 2 индивидуальных вещества стероидной природы Для установления структуры и изучения физико-химических свойств выделенных соединений были использованы УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия, а также результаты различных химических превращений Из корневищ с корнями левзей впервые в России выделен 5-0-глюкозид З.З'-диметилкверцетина, ранее выделенный польскими учеными (Varga Е, Szenlrei К, Reich J., 1982 г), и впервые для видов рода Leuzea описан понастероп-С 2-циннамат, который ранее бы выделен только в Dacrydium intermedium (хвойное растение, эндемичный представитель флоры Новой Зеландии)
Обоснована целесообразность использования тонкослойной хроматографии (ТСХ) для определения подлинности корней и корневищ не только по экдистену, но и по другим соединениям - понастерон С 2-циннамат (экдистероид) и 5-О-глюкозид З^'-диметилкверцетина (флавоноид), которые, в отличие от экдистерона, являются не только диагностическими, но и доминирующими
Показано, что кривая поглощения УФ-спектров растворов водно-спиртового извлечения и экстракта левзей обусловлена гидроксикоричными кислотами (кофейная кислота, хлорогеновая кислота, понастерон С 2-циннамат), для которых характерны максимумы поглощения при 300 и 330 нм, и на этом основании разработана методика определения подлинности
На основе изучения химического состава сырья и с учетом методологических подходов по выделению целевой группы действующих веществ выполнены фитохимические и аналитические исследования по разработке новых методик стандартизации и включению их в проекты нормативной документации
Практическая значимость.
Выделепы и охарактеризованы доминирующие вещества корневищ с корнями левзей сафлоровидпой понастерон С 2-циннамат и 5-О-глюкозид 3,3'-диметилкверцетина
Разработаны методики качественного и количественного анализа корневищ с корнями левзей сафлоровидной (ФС 42-2707-99) в ФС предложено пересмотреть раздел «Качественные реакции» и «Количественное определение»
Разработаны методики качественного и количественного определения препарата «Экстракт левзей жидкий» (ФСП 42-1995-99) с использованием ТСХ-анализа и спектрофотометрии
4 Оформлены проекты НД для представления на экспертизу в
Фармакопейный государственный комитет Министерства здравоохранения и
социального развития РФ
5 Результаты исследований используются в научных изысканиях и
в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами
фитотерапии Государственного образовательного учреждения высшего
профессионального образования "Самарский государственный медицинский
университет Федеральпого агентства по здравоохранению и социальному
развитию" (акты внедрения № 1 и № 2 от 28 03 2007 г )
7 Положения, выносимые на защиту:
Результаты изучения химического состава корневищ с корнями левзей сафлоровидной
Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации сырья и препаратов левзей сафлоровидной
Методики качествешюго и количественного анализа ЛРС «Корневища с корнями левзей» и препарата «Экстракт левзей жидкий»
Результаты разработки и определения показателей качества ЛРС и соответствующих препаратов
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государствешіьш медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (Государственная регистрация № 012001053332) и Республиканских программ
1 «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и
лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме
«Создание лекарственных средств природного происхождения
антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№
Государственной регистрации 01990005277)
2 «Разработка методик качествешюго и количественного анализа сырья
и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпрапоноиды и
флавоноиды» (Государственной регистрация № 01990007536)
Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на IX и ХШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002, 2006), на VII Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), на межрегиональной конференции «Аспирантские чтения» (Самара 2003, 2006), на XXIV International Conference on Polyphenols, (Canada, 2006)
8 Основное содержание диссертации опубликовано в 8 научных работах
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 15 рисунков Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 200 источников, из которых 60 - на иностранных языках
Химический состав
В литературе широко освещены различные аспекты изучения этого растения [107]. Фитохимическому изучению усилиями отечественных и зарубежных ученых подвергались как надземные, так и подземные органы левзей сафлоровидной [117, 166].
Растение содержит до 18,4% белка (в надземной части), минеральные вещества: Са - 1,5%, Р - 0,7%, К - 4,4%, Mg - 2,8%; микроэлементы: Мп -159мг/кг, Си - 8,4 мг/кг, В - 20,4 мг/кг, Мо - 3,3 мг/кг, аскорбиновую кислоту, дубильные вещества - до 12%, инулин, эфирное масло - 0,9% жиры - 3,3%, флавоноиды, гликозиды, стерины, воски, алкалоиды [107, 118].
В надземной и подземной частях левзей содержатся фитоэкдизоны, флавоноиды, кумарины, фенолгликозиды, дубильные вещества, сапонины, сердечные гликозиды, иридоиды, органические кислоты, липиды, витамины, алкалоиды [112, 121].
В соцветиях левзей обнаружены 9 антоциановых гликозидов, из которых основными по содержанию являются цианидин 3-глюкозид (хризантемин) и цианидин 3,5-диглюкозид (цианин) [112].
Экдистероиды. Вначале экдистероиды были обнаружены у членистоногих (насекомые, ракообразные) [11], а сравнительно недавно - в растениях (японскими учеными в 1966 году). Экдистероиды как самостоятельная группа БАС были выделены 1992 году профессором В. Л. Куркиным [64, 98]. Экдистеронды иногда называют растительными гормонами, среди которых наиболее распространенными является а-эвдшон и р-экдизон (экдистерон). Левзея сафлоровидная является единственным экдистероидсодержащим растением, имеющим фармакопейный статус. В корневищах с корнями левзей найдены 9 веществ экдистероидного характера: экдистерон, 24(28)-депщгомакистерон А, интегристерон А, 22-дезоксиэкдистерон, 2,3-моноацетонид экдистерона, 20,22-моноацетонид экдистерона, рапистерон, аюгастерон С, полиподин В [16, 17, 18, 74, 75, 188, 194].
Экдистероны содержатся у левзей во всех частях растения: корнях, корневищах, стебле, листьях, цветах, плодах [11, 12, 31, 104].
Максимальное накопление экдистерона в корнях и корневищах наблюдается в вегетативной фазе (весной и осенью) и составляет у дикорастущей левзей до 0, 81 %, а у культивируемой - до 0,60 % от массы абсолютно сухого сырья [53, 59].
В течение суток содержание экдистерона в корнях и корневищах колеблется. Наибольшее содержание этого вещества наблюдается в 7 и 23 часа [39, 140].
Флавоноиды. В корнях с корневищами левзей обнаружено около 10 соединений флавоноидной природы и идентифицированы агликоны: кверцетин, кверцетагенин, лютеоліні, кемпферол, изорамнетин, цианидин, пеларгонидин, гесперидин, апигешш. Польскими учеными были выделены гликозиды: 5-О-гликозид кверцетина, 5-О-гликозид изорамнетина и гликозид гесперетина [30, 38 103].
Тритерпеноиды. В левзеє тритерпеноиды представлены 8 гликозидами, производными хедерагенина, который в свою очередь является производным р-амирина (рапонтикозиды А, В, С, D, Е, F, G, Н) [103].
Фенилпропаноиды (коричные кислоты) представлены хлорогенової! кислотой, а также неохлорогеновой, юохлорогеновой, кофейной, п кумаровой и феруловой кислотами, а фенолкарболовые кислоты ванилиновой, я-гидроксибензойной и протокахеновой кислотами [69,103].
На основе анализа содержания биологически активных веществ, содержащихся в разных сырьевых органах левзей сафлороидной, можно сделать вывод о целесообразности более глубоко изучения именно корневищ с корнями левзей как более ценного источника получения лекарственных препаратов. Поэтому мы сочли необходимым систематизировать химический состав именно этих органов растения. Результаты систематизации литературных данных по химическому составу корневищ с корнями левзей сафлоровидной представлены в табл. 2.
Физико-химическая характеристика выделенных соединений
Для установления структуры выделенных веществ использовались данные УФ-, -ЯМР- и масс-спектров, а также результаты химических превращений и непосредственное сравнение с достоверными образцами веществ. Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировалось методом ТСХ в нескольких системах и с использованием различных способов детекции.
Вещества сушили в вакуум-пистолете при температуре 60-78 С/2 мм над пятиокисыо фосфора и затем определяли температуру плавления на блоке Кофлера. УФ-спектры снимали на приборах СФ-4, СФ-26, СФ-46 (Россия), Specord 40 (Германия) в этаноле. Применяли реагенты сдвига: 0,1 М раствор метилата натрия, свежеплавленный ацетат натрия, безводная борная кислота (или ее насыщенный раствор в метаноле), 5% раствор безводного А1СЬ, 10% НС1. Спектры !Н-ЯМР записывали на приборе Gemini-200 фирмы Varian с рабочей частотой 200 МГц. Величины химических сдвигов приведены в шкале 8. Внутренний стандарт - тетраметилсилан (5=0). Приняты следующие сокращения: с-синглет, д-дублет, т-триплет, дд-двойной дублет, кв-квартет, м-мультиплет. Масс-спектры электронного удара выполняли на приборе Varian СН-8 при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Температуру ионного источника варьировали от 30 до 300 С. Калибровку масс-спектрометра проводили с помощью перфторкеросина. Углы вращения получали на поляриметре Polamat А при 546 нм с пересчетом для 589,3 нм.
1. Кофейная кислота. Светло-желтые кристаллы состава С9Н804 с т.пл. 218-221 С (водный ацетон); УФ - спектр в 95% этиловом спирте : Ятах 217, 242, 326 нм. Масс-спектр при 100 С: М+ 180 (100%), 179(16), 163(31), 162(5), 135(16), 134(39), 123(7), 117(11), 89(15). -ЯМР-спектр в d-ацетоне (200 МГц, м.д.): 7,52 (д, 16 Гц, Н-7), 7,22 (с, Н-2), 7,11 (д, 9 Гц, Н-6), 6,80 (д, 9 Гц, Н-5), 6,25 (д, 16 Гц, Н-8).
2. Хлорогеновая кислота (3) СібН1809. Т. пл. 203-205 (вода). УФ спектр в спирте этиловом: 243, ЗООпл, 330 нм. -ЯМР-спектр в ДМСО-ё6 (100 МГц, м.д.): 7.45 (д, 16 Гц, Н-7), 7.06 (д, 2 Гц, Н-21), 7.01 (дд, 2 и 8 Гц, Н 61), 6.80 (д, 8 Гц, Н-51), 6.18 (д, 16 Гц, Н-8), 5.10 (дт, 5 и 9 Гц, Н-5), 4.00 (кв, 3 Гц, Н-3), 3.62 (дд, 3 и 9 Гц, Н-4).
3. 5-О-глюкозид З -Диметилкверцетиііа. Желтые кристаллы состава С22Н21О7; : УФ-спектр в метиловом спирте: Х,тах 250, 360 нм. Масс-спектр при 100 С: М +330 (100%) -ЯМР-спектр в d -метаноле: 7,73 м.д. (д, 2,1 Гц, Н- 21), 7,65 м.д (8,4 д.д. и 2,1 Гц, Н-61), 6,96 м.д. (д, 8,4 Гц, Н-51), 6, 76 м.д. (д, 8, 4 Гц, Н-51), 6,76 м.д. (д. 2,2 Гц, Н-81), 6,6 м.д. (д.2,2 Гц, Н-6 ), 3,94 м.д. - (с, СНзО), 3,77 м.д. (с, СНзО), 4,5 - 5,1 м.д. (м, З Н глюкозы), 3,0 - 4,0 м.д. (м, 4 Н глюкозы).
4. Экдистерон. -ЯМР-спектр 20-гидроксиэкдизона в CD3OD: 5, 82 (д. 2,4 Гц, Н-7), 4,66 (уш., с, 6Н, 60Н), 3,97 (м, Н-3), 3,89 (м, Н-2), 3,40 (м, Ш, Н-22) 3,1-3,2 (м, Н-9), 1,30-2,15 (м, 16 Н, 2Н-1, 2Н-4, 2Н-11, 2Н-12, 2Н-15, 2Н-16, 2Н-23, 2Н-24), 1,23 (с, 6Н, СН3-26/27), 1,22 (с, ЗН, СН3-21), 0,97 (с, ЗН, СНз-19), 0,89 (с, ЗН, СНз-18).
5. Понастерон С 2 -циннамат. -ЯМР-спектр (Gemmini 200) понастерона С 2-циннамата в CD30D (5, м.д.): 7,2-7,26 (м, ЗН ароматических), 6,92-6,96 (м, 2Н ароматических), 6,40 (д, 16 Гц, Ш, Н-71), 6,36 (д, 16 Гц, Ш, Н-81), 5,72 (д, 1,8 Гц, Н-7), 3,55-3,75 (м, 6Н, Н-1; Н-3, 2Н-4, Н-22; Н-24), 2,95-2,98 (м, 2Н, Н-9, Н-17), 1,80-1,90 (м, 9Н, Н-11, Н-12, 2Н-15, 2Н-16, 2Н-23, Н-25), 1,30 (с, 9Н, СН 3-18, СН3-19,СН3-21), 0,92 (д, 7 Гц, 6Н, 2 СНз-26/27).
Методики количественного анализа корневищ с корнями левзей сафлоровидной
Метод прямой хроматоспектрофотометрии (метод 1).
Около 1 г (точная навеска) корневищ помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 50 мл и добавляют 30 мл спирта 70 %. Колбу закрывают пробкой, взвешивают (погрешность + 0,01 г), присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, взвешивают и доводят спиртом до первоначальной массы. 1 мл извлечения фильтруют через слой оксида алюминия, сформированный в 95 % спирте этиловом высотой 1 см на стеклянном фильтре в мерную колбу вместимостью 25 мл 95 % спиртом, элюируют 20 мл 95 % спирта, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают (раствор А); 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки 95 % этиловым спиртом и тщательно перемешивают. В качестве раствора сравнения используют 95 % этиловый спирт.
Определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны А,=242 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Параллельно определяют оптическую плотность раствора ГСО экдистена при длине волны 71=242 им в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Содержание суммы экдистероидов в пересчете на экдистен и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: D х 30 х 25 х Шо х 100 х 100 х 2 Х= где D0xmxlx 25x25x(100-W) D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора ГСО экдистена; m - навеска сырья в граммах; Шо - навеска ГСО экдистена в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Примечание.
Приготовление раствора ГСО экдистена: около 0,025 г (точная навеска) ГСО экдистена растворяют в 10 мл 95 % спирта в мерной колбе вместимостью 25 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, доводят 95 % спиртом до метки и перемешивают(раствор А); 5 мл раствора (А) переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают (раствор Б).
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (метод 2) Около 1 г (точная навеска) корневищ помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 50 мл и добавляют 30 мл спирта 70 %. Колбу закрывают пробкой, взвешивают (погрешность + 0,01 г), присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, взвешивают и доводят спиртом до первоначальной массы. Полученное швлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса) и перемешивают.
По 2 мкл испытуемого раствора и 2 мкл раствора ГСО экдистена попеременно хроматографируют на жидкостном хроматографе «Мнлихром 5» с ультрафиолетовым детектором, получая не менее 5 хроматограмм для каждого из растворов, в следующих условиях:
- колонка размером 2x64 мм, заполненная сорбентом Сепарон С-18 с размером частиц 5 мкм;
- подвижная фаза: ацетонитрил-вода-кислота уксусная ледяная (50:50:1), дегазированная вакуумом в течение 1-2 минут;
- скорость подвижной фазы - 50 мкл/мин;
- детектирование при длине волны 242 нм;
- масштаб регистрации 3,0 единиц оптической плотности;
- объем элюента: 400 мкл - регенерация колонки, 6 мкл - буфер, 500 мкл -анализ;
- время интегрирования сигнала - 0,4 сек;
- чувствительность - 0,1 V;
- время регистрации хроматограммы 12,5 мин.
Содержание суммы экдистероидов в пересчете на экдистен в процентах (X) в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле: Sx30 х m0x5xVox 100 х 100 S хтохКх2400 Х= — = SoxmxVx25x25x(100-W) Soxmx(lOO-W) где: S - среднее значение площадей пиков экдистероидов, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца, мм2; S0 - среднее значение площадей пиков экдистена, вычислительное из хроматограмм раствора ГСО экдистена, мм2; m - масса навески сырья, г; то - масса навески ГСО экдистена, г; W - влажность сырья в процентах; К -коэффициент, характеризующий чистоту стандарта; рассчитываемый как отношение площадей пика экдистена и примеси; V - объем вводимой пробы раствора испытуемого образца в микролитрах; Vo - объем вводимой пробы раствора ГСО экдистена, в мкл.
Результаты анализа считаются достоверными, если выполняются требования теста «Проверка пригодности хроматографической системы».
Примечание.
1. Приготовление подвижной фазы
Ацетошггрил для жидкостной хроматографии (ТУ 6-09-5449-89) смешивают с водой дистиллированной (ФС 42-2619-96) и кислотой уксусной «х.ч. ледяной» (ГОСТ 61-75) в соотношении 50:50:1, фильтруют через стеклянный фильтр от механических примесей и дегазируют вакуумом в течение 1-2 минут при 15 дюймах атмосферного давления. Подвижную фазу используют свежеприготовленной.
2. Приготовление раствора государственного стандартного образна экдистена. Около 0, 05 г (точная навеска) экдистена стандартного образца (ВФС 42-1713-87) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, Прибавляют 20 мл спирта этилового и перемешивают. Затем доводят объем раствора спиртом этиловым до метки и перемешивают (раствор А). 5 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят тем же спиртом до метки и фильтруют через стеклянный фильтр ПОР (раствор Б).
Раствор хранят в темном месте в колбе с притертой пробкой. Срок годности раствора 1 месяц.
3. Проверка пригодности хроматографической системы. Для проверки пригодности хроматографической системы перед хроматографированием испытуемого раствора хроматографируют раствор ГСО экдпстепа, получая не менее 5 хроматограмм, в условиях, описанных выше. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:
- эффективность хроматографической колонки по техническому паспорту должна быть не менее 3000 теоретических тарелок (ГФ XI, вып. 1, с. 10);
- степень разделения пиков, рассчитанная для пиков на хроматограмме раствора ГСО экдпстена должна быть не менее 0, 63 (ГФ XI, вып. 1, с. 105)
- относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площади экдпстена на хроматограмме раствора ГСО экдпстена должно быть не более 3%(ГФХ1,вып.1,с.199);
- коэффициент ассиметрии пика, рассчитанный по пику экдпстена на хроматограмме раствора ГСО экдпстена должен быть не менее 1,0 и не более 1,5.
- коэффициент ассимметрии пика (Т) рассчитывают по формуле
Разработка проекта нормативной документации на лекарственное средство «Левзей экстракт жидкий»
Необходимость в пересмотре некоторых разделов имеющейся НД на лекарственное средство продиктована главным образом целью унификации методик качественного и количественного аналюа, как корневищ с корнями левзей сафлоровидной, так и экстракта левзей жидкого. При анализе данной лекарственной формы также целесообразно проводить метод тонкослойной хроматографии, ориентируясь не только на ГСО экдистсна, но и на доминирующие вещества: понастерон С 2 -циннамат и 5-О-глюкозид 3,3і-диметилкверцетина. В Разделе «Количественное определение» метод прямой хроматоспектрофотометрии также является оптимальным вследствие сочетания простоты, воспроизводимости и достоверности.
Выделяя в сырье и галеновых препаратах левзей сафлоровидной экдистероиды как ведущую группу биологически активных соединений и флавоиоиды в качестве преобладающей сопутствующей группы нами предложен ТСХ-аналго для оценки качества "Левзей экстракта жидкого" и хроматоспектрофотометрический анализ с использованием ГСО экдистсна, понастерона С 2-цшшамата и 5-О-глюкозида З -диметилкверцетшга.
Раздел «Подлинность».
С учетом ранее обсужденных данных по содержанию в сырье и экстракте левзей сафлоровидной характерных диагностических компонентов (понастерон С 2-циннамат и 5-О-глюкозид З -диметилкверцетина) разработана ТСХ-методика установления подлинности препарата, предусматривающая определение Rs данных соединений по отношению к экдистену.
В предлагаемой методике используются готовые пластинки "Силуфол УФ 254" или "Сорбфил ПТСХ-А-УФ", которые предварительно активируют в сушильном шкафу для четкого разделения компонентов, и система растворителей хлороформ - метиловый спирт - вода (4:1). Предпочтение было отдано выше указанной системе, т.к. она используется в аналше корневищ с корнями левзей сафлоровидной (ФС 42-2707-99).
Для идентификации указанных соединений были использованы в качестве свидетелей ГСО экдистен и достоверно известные образцы веществ. При облучении УФ-светом (254 им) экдистен на хроматограмме экстракта просматривается в виде нечеткого пятна с фиолетовой флуоресценцией с Rf около 0,10. Понастерон С 2-цшшамат просматривается в виде доминирующего фиолетового пятна с величиной Rf около 0,7. В УФ-свете при длине волны 366 им 5-О-глюкозид З -диметилкверцетина просматривается в виде дампирующего пятна ярко-голубого цвета с Rf около 0,2.
Для обнаружения данных веществ предложено проявлять хроматограмму свежеприготовленным раствором фосфорновольфрамовой кислоты с последующим их нагревом при температуре ПО С в течение 5 мин в сушильном шкафу. При этом экдистен проявляется в виде пятна слабо-розового цвета с Rf около 0,1 практически на уровне пятна ГСО экдистена. Пятно понастерона С 2-цишгамата проявляется в віще ярко-выраженного пятна розово-коричневого цвета с Rf около 0,7 практически на уровне пятна образца этого вещества. Отношение Rf понастерона С 2-циннамата к Rf ГСО экдистена соответствует величине Rs = 7. Пятно 5-0-глюкозида З -диметнлкверцетина проявляется в віще ярко-выраженного пятна лимонно-желтого цвета практически на уровне образца этого вещества. Отношение Rf 5-О-глюкозида З -димегилкверцетина по отношению к Rf ГСО экдистена соответствует величине Rs=2.
Предложенная методика позволяет объективно оценивать подлинность препарата по наличию не только экдистерона, но и двух основных компонентов корневищ с корнями левзей сафлоровидной - понастерон С 2-циннамат и 5-О-глюкозида З -диметилкверцетина.
Раздел «Количественное определение».
Для определения экдистена в "Левзей экстракте жидком" использовали хроматоспектрофотометрическнГі метод, с предварительны отделением его от сопутствующих веществ с использованием оксида алюминия. В качестве аналитической длины волны, на наш взгляд, целесообразно использовать 242 ILM так как максимум поглощения в этой области УФ-спектра обусловлен экдистероидами. В качестве стандарта нами рекомендовано использовать Государственный стандартный образец экдистена (ВФС 42-1714-87).
Анализ серии образцов препарата, проведенный с использованием обсуждаемой методики показал, что нижний предел содержания экдистена в экстракте 1:1 равен 1,0%.
Метод 1. 1,00 мл экстракта фильтруют через слой оксида алюминия толщиной 1 см в мерную колбу вместимостью 25 мл, элюируют 20 мл 95 % спирта, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают. Затем 1 мл полученного раствора переносят в колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки 95 % спиртом и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 242 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит 95 % этиловый спирт.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО экдистена, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Приготовление раствора ГСО экдистена: около 0,025 г (точная навеска) ГСО экдистена растворяют в 10 мл 95 % спирта в мерной колбе вместимостью 25 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, доводят 95 % спиртом до метки и перемешивают (раствор А); 5 мл раствора (А) переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают (раствор Б).
Метод 2. 1 мл исследуемого препарата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят 95 % спиртом до метки и перемешивают; полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса) и перемешивают.
По 2 мкл испытуемого раствора и 2 мкл раствора ГСО экдистена попеременно хроматографируют на жидкостном хроматографе «Милихром 5» с ультрафиолетовым детектором, получая не менее 5 хроматограмм для каждого из растворов, в следующих условиях:
- колонка размером 2x64 мм, заполненная сорбентом Сепарон С-18 с размером частиц 5 мкм или аналогичная;
- подвижная фаза: ацетонитрил-вода-кислота уксусная ледяная (50:50:1), дегазированная вакуумом в течение 1-2 минут;
- скорость подвижной фазы — 50 мкл/мин;
- детектирование при длине волны 242 нм;
- масштаб регистрации 3,0 единиц оптической плотности;
- объем элюента: 400 мкл - регенерация колонки, 6 мкл - буфер, 500 мкл -анализ;
- время интегрирования сигнала - 0,4 сек,
- чувствительность - 0,1 V;
- время регистрации хроматограммы 12,5 мин.
