Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Растения рода polygonum l. ботанико экологические особенности, географическое распространение. химический состав 11
1.1 Ботаническая и экологическая характеристика видов рода Polygonum L. и их
географическое распространение 11
1.2 Химический состав видов рода Polygonum L. 15
1.3 Применение видов рода Polygonum L. в официальной и народной медицине.21
1.4 Фенольные соединения в медицине 24
Выводы по главе 1 29
ГЛАВА 2. Объекты и методы 30
2.1 Объект исследования 30
2.2 Методы исследования 30
2.2.1 Химические методы. 30
2.2.2 Хроматографические методы 31
2.2.2.1 Методы бумажной и тонкослойной хроматографии 31
2.2.2.2 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии 32
2.2.2.3 Газожидкостная хроматография 32
2.2.2.4 Метод хромато-масс-спектрометрии 33
2.2.2.5 Методы определения аминокислот 33
2.2.2.6 Методы определения антиоксидантной активности 34
2.2.3 Методы спектрального анализа. 35
2.2.3.1 Метод УФ-спектроскопии 35
2.2.3.2 Атомно-абсорбционная спектрография
2.2.4 Титриметрические методы. 37
2.2.5 Методы стандартизации сырья 37
2.2.5.1 Отбор проб для анализа 37
2.2.5.2Методы морфолого-анатомического исследования 38
2.2.5.3 Определение числовых показателей качества сырья 38
2.2.5.4 Определение микробиологической чистоты сырья 38
2.2.5.5Определение сроков хранения сырья 38
2.2.6 Фармакологические методы 39
2.2.7 Статистическая обработка данных 39
ГЛАВА 3. Фитохимические исследования 40
3.1 Изучение флавоноидов и фенилпропаноидов 41
3.1.1 Выделение и идентификация флавоноидов и фенилпропаноидов 41
3.1.2 Количественное определение флавоноидов и фенилпропаноидов 50
3.1.3 Количественное определение дубильных веществ 60
3.2 Изучение полисахаридов 64
3.2.1 Качественный и количественный анализ. 64
3.3 Изучение каротиноидов 74
3.3.1 Качественный анализ каротиноидов 74
3.3.2 Количественное определение каротиноидов 75
3.4 Изучение органических кислот 77
3.4.1 Качественный анализ органических кислот 77
3.4.2Количественное определение органических кислот 78
3.5 Изучение элементного состава травы горца сахалинского 79
3.6 Изучение аминокислотного состава травы горца сахалинского 81
3.7 Определение антиоксидантной активности 83
Выводы по главе 3 86
Глава 4. Интродукционные исследования горца сахалинского в условиях кавказских минеральных вод 88
4.1 Репродукция семенами 88
4.2 Вегетативное размножение 90 4.3 Составление графиков роста и фенологических спектров 90
4.4 Сырьевая оценка и расчет объема возможных ежегодных заготовок 94
Выводы по главе 4 96
ГЛАВА 5. Стандартизация сырья и разработка проекта ФСП на траву горца сахалинского 97
5.1 Морфолого-анатомические исследования травы горца сахалинского 97
5.2 Определение товароведческих показателей сырья 117
Выводы по главе 5 124
Глава 6. Получение и стандартизация экстракта горца Сахалинского сухого 126
6.1 Определение технологических характеристик сырья 126
6.2 Разработка технологической схемы получения экстракта горца сахалинского сухого 127
6.3 Оценка качества экстракта 130
Выводы по главе 5 132
Глава 7. Фармакологические исследования 133
7.1 Определение раздражающей активности экстракта 133
7.2 Определение острой токсичности экстракта 136
7.3 Изучение специфической активности экстракта 138
Выводы по главе 7 142
Общие выводы 143
Список литературы
- Химический состав видов рода Polygonum L.
- Методы бумажной и тонкослойной хроматографии
- Количественное определение флавоноидов и фенилпропаноидов
- Определение товароведческих показателей сырья
Химический состав видов рода Polygonum L.
Порядок Polygonales - гречихоцветные включает в себя семейство Polygonaceae Juss. – гречишные; род Polygonum L. - Горец насчитывает около 300 видов. Горец сахалинский Polygonum sachalinense F. Schmidt [134] некоторые ботаники относят к роду Fallopia Adans. – Fallopia sachalinensis (F. Schmidt) Ronse Decr. и Reynoutria sachalinensis (Fr. Schmidt) Nakai [151,153].
Растения рода - многолетние травянистые растения, реже полукустарники, кустарники и лианы. Цветки мелкие, обоеполые, часто протандричные в колосовидных или метельчатых соцветиях, иногда пазушные. Стебли прямостоячие или распростертые, иногда вьющиеся. Листья простые, очередные. Опыляются насекомыми, нередко самоопыление. Плоды трёхгранные орешки, заключённые в разросшийся околоцветник; распространяются животными, ветром, водой. В 1 г содержится до 100 семян. Растения рода распространены по всему земному шару, но преимущественно в умеренных поясах.
Что касается названия рода Polygonum, то оно произошло от греческих слов «polys» — много и «gonos» — колено; встречаются также другие названия рода -Persicaria, Fallopia, Reynoutria, Tovara [45].
В культуре встречается около 20 видов. Некоторые виды используются в цветоводстве. На территории России хорошо адаптировались многие виды горцев. Они также оказались довольно неприхотливыми и успешно культивируются [56] это: Polygonum hydropiper L. – Горец перечный
Однолетнее травянистое растение высотой до 50 см. Цветет горец перечный в июле-августе, плодоносит в августе-сентябре. Свежие листья растения обладают остро-жгучим вкусом, что и определило название растения.
Произрастает горец перечный по всей лесной зоне бывшего СССР, кроме Крайнего Севера и Крыма. Основные районы сбора и заготовки: Северный Кавказ, Краснодарский край, Ростовская и Воронежская области. На Дальнем Востоке г. перечный распространен в Приморье, Приамурье, на Курильских островах и в южных районах Сахалинской области; местами образует небольшие заросли. Polygonum persicaria L.- Горец почечуйный Однолетнее травянистое растение. Период цветения июнь-август. Растение не имеет запаха, на вкус горьковато-терпкое.
Горец почечуйный широко распространен на территории бывшего Советского Союза, включая Дальний Восток, Сибирь, Среднюю Азию и Кавказ. На Дальнем Востоке это Приморье, Сахалин и южные районы Хабаровского края. Растет горец почечуйный на лугах, в рвах, у дорог и как сорняк. Однако, растение предпочитает сырые места: по берегам рек и канав, на влажных полях и огородах. Polygonum aviculare L. - Горец птичий
Однолетнее травянистое растение. Цветет и плодоносит горец птичий с середины весны до глубокой осени. Горец птичий встречается повсеместно. Растет как сорняк, на выпасах по берегам водоемов, в садах, огородах, парках, лесополосах [63]. Polygonum alpinum All. - Горец альпийский
Разрастается в мощные раскидистые кусты высотой до 150 см. Цветение приходится на середину июля. Polygonum ajanense (Regel&Tiling) Grig. - Горец аянский Многолетнее растение до 30-40 см высотой. Ареал: Сибирь, Дальний Восток, Япония, Китай. Растет на каменистых склонах, щебнистых осыпях в гольцовом и подгольцовом поясах гор. Polygonum weyrichii Fr.- Schmidt Горец Вейриха В диком виде разрастается в заросли высотой до 200 см на травянистых склонах Сахалина, Курил и Японии. Цветет в конце августа. Этот вид горца неприхотливый и зимостойкий. Polygonum viviparum L. - Горец живородящий Многолетнее растение до 50 см высотой. Цветет в июне-августе. Произрастает в болотистой местности и в лесах, а также встречается в горах в высокогорье [2,151].
Экологическую характеристику рода Горец можно дать, опираясь на труды российского ученого-агронома и ботаника Л.Г. Раменского, проводившего широкомасштабные исследования по изучению видового состава лугов и физических условий их произрастания.
Методы бумажной и тонкослойной хроматографии
Объектом исследования был лабораторный образец сухого экстракта травы г. сахалинского. Фармакологические исследования начали с изучения раздражающей активности и острой токсичности согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» с определением LD50 [81,106]. Далее изучали желчегонное и мочегонное действия экстракта при пероральном способе применения.
Опытные группы лабораторных животных получали предварительно нагретый в термостате до температуры 37,0+0,2 0С экстракт перорально. В качестве контроля использовали изотонический раствор натрия хлорида в эквивалентном объеме [95,106,119,129]. Препаратом сравнения служили таблетки фламин (50 мг) производства ЗАО «Вифитех» (Россия). Лабораторные животные. Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария Пятигорского медико-фармацевтического института. Животные получали корм и воду ad libitum [129]. Дозы и способы введения:
Для определения острой токсичности экстракт вводили мышам per os в дозах 5000 мг/кг, 2500 мг/кг, 1250 мг/кг в объеме 0,5 мл [29]. Изучение раздражающей активности проводили на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона и на глазе морских свинок [106, 111]. При переносе доз с человека на лабораторных животных и обратно использовали коэффициент межвидового переноса, составляющий 5,9 в случае использования крыс и 11,8 в случае использования мышей [32].
Результаты, которые считали достоверно значимыми при наблюдении эффекта в 95% случаях (р 0,05), обрабатывали статистичеcки по методике ГФ XI с помощью программы Microsoft Excel 2000 [23, 36,68,72,105]. ГЛАВА 3. Фитохимические исследования травы г. сахалинского 3.1. Изучение фенольных соединений г. сахалинского
Фитохимический состав г. сахалинского практически не изучен. Известно, что от места произрастания растения может зависеть качественный состав и количественное содержание БАС в нем. В связи с этим, нам представлялось интересным изучение качественного состава БАС травы г. сахалинского в условиях интродукции на КМВ, а также определение количественного содержания БАС в траве, собранной в различные фазы вегетации.
Для выделения БАВ 100,0 г высушенного и измельчённого до размера частиц 2-5 мм сырья г. сахалинского обезжиривали в аппарате Сокслета петролейным эфиром, растворитель отгоняли на роторном испарителе до образования смолообразного остатка (фракция 1). Сырьё после обезжиривания высушивали до удаления растворителя. Обезжиренное и измельченное сырье помещали в круглодонную колбу вместимостью 2л, заливали спиртом этиловым 70% в соотношении 1:6 и выдерживали в течение 72 часов, периодически помешивая сырье. Полученную вытяжку сливали в сборник, а остаток слегка отжимали. Остаток после отжима заливали экстрагентом в соотношении 1:4 и оставляли на 24 часа при периодическом помешивании. Полученную вытяжку сливали, а в колбу с сырьем прибавляли 3 л 1%-го раствора кислоты хлористоводородной в 70%-ном спирте этиловом. Экстракты объединяли и фильтровали через вату в колбу вместимостью 2 л, а остаток окончательно отжимали. Из объединенного извлечения на роторном испарителе отгоняли спирт этиловый до объема около 100 мл. Затем переносили в делительную воронку вместимостью 500 мл и 5-6 раз порциями по 80 мл обрабатывали хлороформом до получения бесцветной фракции, хлороформ отгоняли на роторном испарителе при пониженном давлении (фракция 2). Далее маточный раствор нагревали на водяной бане и 7 раз по 70 мл обрабатывали в делительной воронке эфиром, затем этилацетатом. Остатки этилацетатной и эфирной фракций, полученных после отгонки экстрагента, высушивали под вакуумом и получали 3 и 4 фракцию соответственно [26,31].
Качественные реакции - к 1 мл фракции 4 добавляли 2мл 5% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом и 3 мл 95% спирта этилового, наблюдали желтое окрашивание; - к 2 мл фракции 4 прибавляли 5 капель кислоты хлористоводородной концентрированной и 10 мг металлического цинка, через 3 минуты наблюдали розовое окрашивание. Для выделения полифенольных соединений траву г. сахалинского обрабатывали петролейным эфиром, затем экстрагировали спиртом этиловым. Из полученного извлечения спирт удаляли, а в остаток добавляли горячую воду очищенную 1:3 и фильтровали. Фильтрат последовательно обрабатывали хлороформом, эфиром диэтиловым и этилацетатом. В результате были получены 4 фракции, которые мы использовали для изучения основных классов БАС хроматографическим способом на пластинках «Sorbfil» (УФ-254) и хроматографической бумаге марки «Filtrak (FN-4)» [48,62]. В качестве растворителей использовались системы, рекомендуемые для хроматографического разделения фенольных соединений: 1. Бутанол - кислота уксусная - вода (4:1:2) [16,73]; 2. 15% кислота уксусная [11]; 3. 2% кислота уксусная [3,13,21]; 4. Хлороформ – спирт метиловый (8:2) [55,137]; 5. Этилацетат – кислота уксусная – вода (5:1:1) [73]; 6. Хлороформ – спирт этиловый [16,137]. Системы 1-3 использовались для хроматографии на бумаге, а системы 4-6 для тонкослойной хроматографии [121]. Как видно из таблицы 2, с помощью бумажной хроматографии было установлено 5 зон адсорбции, характерных для флавоноидов и фенилпропаноидов.
Количественное определение флавоноидов и фенилпропаноидов
к 2 мл водного извлечения прибавляли по каплям 1% раствор желатина, наблюдали появление мути, исчезающее при добавлении избытка реактива (дубильные вещества);
к 2 мл водного извлечения прибавляли несколько капель раствора железоаммониевых квасцов, наблюдали черно-зеленое окрашивание (конденсированные дубильные вещества) [51].
Определение содержание дубильных веществ проводили титриметрическим и спектрофотометрическим методами. Для исследования использовали сырье, собранное в разные вегетативные фазы. Результаты исследований представлены в таблицах.
Метод 1 - Перманганатометрический согласно ГФ XI Количественное содержание дубильных веществ определяли перманганатометрическим методом в модификации А. Л. Курсанова в пересчёте на танин [36]. Содержание дубильных веществ (%) рассчитывали по формуле: (V-V) -0.004157 250-100-100 Х= , (4) m-25-QOO- W) где V - объем раствора калия перманганата (0,02 моль/л), израсходованное на титрование извлечения, мл; Vi - объем раствора калия перманганата (0,02 моль/л), израсходованное на титрование в контрольном опыте, мл; m - навеска сырья, г; 0,004157 - количество дубильных веществ, соответствующих 1 мл раствора калия перманганата (0,02 моль/л) (в пересчете на танин), в г; W - потеря в массе при высушивании сырья, в %. Таблица 14 - Количественное содержание дубильных веществ в траве г. сахалинского (метод 1) Фаза f X Sx p t(p,f) Х Е,% Фаза бутонизации 6 13,8 0,058 0,95 2,45 0,148 1,08 Фаза цветения 6 17,1 0,06 0,95 2,45 0,15 0,87 Фаза плодоношения 6 17,33 0,061 0,95 2,45 0,16 0,91 Метод 2 – Перманганатометрический в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином Дубильные вещества в 20 мл полученного извлечения осаждали 1% раствором желатина в 10% растворе натрия хлорида. Полученный осадок отфильтровывали. 10 мл фильтрата помещали в колбу вместимостью 1000 мл, добавляли 500 мл воды, 25 мл индигосульфокислоты и титровали 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания.
Cодержание других окисляющихся веществ (Х2) рассчитывали по вышеприведенной формуле, в которой брали вместо V1 значение V2 – объема раcтвора перманганата калия (0,02 моль/л), израcходованного на титрование извлечения после осаждения дубильных веществ, мл [100]. Содержание дубильных веществ, определенных методом перманганатометрии в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином (X): Х = Х1 – Х2 (5) Где Х1 – общее содержание веществ, окисляющихся при титровании раствором калия перманганата; Х2 – содержание других окисляющихся веществ Таблица 15 – Содержание дубильных веществ в траве г. сахалинского (метод 2) Фаза f X Sx p t(p,f) Х Е,% Фаза бутонизации 6 10,3 0,105 0,95 2,45 0,27 2,7 Фаза цветения 6 11,18 0,087 0,95 2,45 0,22 2,00 Фаза плодоношения 6 12,27 0,124 0,95 2,45 0,32 2,62
Метод перманганатометрии в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином позволяет определить окисляемые компоненты в вытяжке до и после осаждения желатином дубильных веществ. По разнице этих двух определений определяется количественное содержание дубильных веществ [51].
Метод 3 – Спектрофотометрическое определение дубильных веществ 5 мл извлечения помещали в мерную колбу на 50 мл и доводили до метки спиртом этиловым 70%. В мерную колбу на 25 мл отбирали 2,5 мл полученного разведения и доводили до метки cпиртом этиловым 70%. Измеряли оптичеcкую плотность при длине волны 276 нм относительно спирта этилового 70% на спектрофотометре СФ-101 в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного образца танина чайного.
Приготовление раствора стандартного образца танина Около 0,0025 г (точная навеска) стандартного образца танина (Танин, х.ч. ООО «НПО Альфарм»), высушенного до постоянной массы при температуре 100-105С, помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили до метки спиртом этиловым 70%. В мерную колбу на 25 мл отбирали 2,5 мл полученного разведения и доводили до метки спиртом этиловым 70% [100,128]. где Mcm– масса РСО танина, г; Mx – масса сырья, г; Dcm – оптическая плотность РСО танина; Dx – оптическая плотность исследуемого раствора. Суммарное содержание дубильных веществ в пересчете на воздушно-сухое сырье (X,%) определяли по формуле Рисунок 13 – УФ-спектры спиртового извлечения из травы г. сахалинского 1- Извлечение из травы г. сахалинского 2- Стандартный образец танина Таблица 16 – Содержание дубильных веществ в траве г. сахалинского (метод 3) Фаза f X Sx p t(p,f) Х Е,% Фаза бутонизации 6 3,67 0,042 0.95 2,45 0,108 2,95 Фаза цветения 6 4,45 0,043 0.95 2,45 0,11 2,47 Фаза плодоношения 6 5,08 0,065 0.95 2,45 0,168 3,3 В зависимости от фазы сбора сырья содержание дубильных веществ составляет от 13,8±0,15 до 17,33±0,16 перманганатометрическим методом, 10,3±0,27 до 12,27±0,32 желатиновым методом, 3,67±0,108 до 5,08±0,168 спектрофотометрическим методом. Наибольшее количество дубильных веществ накапливается в фазы цветения и плодоношения. 3.2. Изучение полисахаридов 3.2.1 Качественный и количественный анализ
Качественная реакция - к 2 мл водного извлечения прибавляли 6 мл 95% спирта этилового и перемешивали. Наблюдали появление белого студенистого осадка, который образовывал хлопья при встряхивании. Выход полисахаридов из травы г. сахалинского составил 0,22 – 0,24 %. Исследование мономерного состава Гидролиз полисахаридов Точную навеску полисахаридов (20 мг) помещали в ампулу объемом 10 мл, добавляли 5 мл 4М кислоты трифторуксусной. Ампулу запаивали и выдерживали в сушильном шкафу при температуре 85 0С (6 часов). После охлаждения содержимое ампулы переносили в колбу и упаривали на роторном испарителе, добавляя трижды (по 0,5 мл) метанол для освобождения от остатков трифторуксусной кислоты. Сухой остаток растворяли в 96% спирте этиловом, фильтровали и переносили в чистую пенициллинку, в которой раствор высушивали до постоянной массы при температуре не более 50 0С
Определение товароведческих показателей сырья
Учитывая данные проведенного нами исследования химического состава травы г. сахалинского, мы рекомендуем проводить стандартизацию сырья по сумме флавоноидов и фенилпропаноидов.
Для определения основных БАВ использовали измельченную до размера частиц 1 мм траву г. сахалинской с целью обеспечения более полной экстракции.
К около 10,0г помещенной в колбу на 200 мл измельченный травы г. сахалинского приливали 50мл спирта этилового 70%. Колбу взвешивали (погрешность до ± 0,01г), присоединяли обратный холодильник и нагревали на электрической плитке с асбестовой сеткой 1 час. Затем колбу охлаждали, снова взвешивали (погрешность до±0,01г) и доводили ее массу до начальной спиртом этиловым 70%. Содержимое взбалтывали и через воронку с ватным тампоном фильтровали в колбу на 100мл. С полученным извлечением проводили качественные реакции на флавоноиды (см. п.2.2.1 и ТСХ).
На хроматографическую пластинку, предварительно выдержанную в сушильном шкафу (100-105С) с целью ее активации, наносили 10мкл полученного извлечения. Параллельно наносили по 5 мкл растворов РСО [55]. Хроматографирование проводили в герметично закрытой камере восходящим способом, система растворителей (хлороформ – спирт этиловый 9:1).
После прохождения фронтом растворителей 10-11 см, пластинку вынимали и высушивали на воздухе, после чего просматривали ее в УФ свете.
В период 3-х лет хранения влажность сырья находилась в пределах 11%, золы общей в пределах 7%, золы нерастворимой в 10% кислоте хлористоводородной 2%. В течение 3-х лет результаты оставались неизменными, при дальнейшем хранении сырья происходило снижение количественного содержания флавоноидов. Поэтому рекомендуемый нами срок годности сырья г. сахалинского–3 года с момента заготовки. Спецификация травы г. сахалинского приведена в таблице 34.
Подлинность - на флавоноиды- на дубильные вещества Качественные химическиереакции:к 2 мл спиртовогоизвлечения добавляется 5капель концентрированнойхлористоводороднойкислоты и 10 мгметаллического цинка.к 2 мл водного извлеченияприбавляется несколькокапель растворажелезоаммониевыхквасцов. Малиновое окрашиваниеЧерно-зеленое окрашивание
Числовые показателиСодержаниефенилпропаноидовВлажностьЗола общаяЗола, нерастворимая в HCl10%-нойОрганические примеси, %Минеральные примеси, %Частицы, прошедшие сквозьсито с d =7 мм, %Пожелтевшие, побуревшие ипочерневшие части растения,% ЭкстракционнаяспектрофотометрияГФ XIГФ XIIГФ XIГФ XI ГФ XI ГФ XIГФ XI Не менее 4,5%Не более 11 % Не более 7 % Не более 2 %Не более 1%Не более 0,5%Не более 6%Не более 1,5% Микробиологическая чистота ГФ XII, категория 4 а Соответствует Упаковка По НД Соответствует Маркировка По НД Соответствует Хранение По НД В сухом, защищенном от света месте Срок годности - 3 года. Разработан проект ФС «Трава горца сахалинского». 2. В качестве сырья г. сахалинского предложены высушенные облиственные отрезки стеблей 15 - 20 см длиной растений 3-го года вегетации и старше, собранные в фазу плодоношения.
В результате проведенных морфолого-анатомических исследований установлены диагностические признаки сырья: - лист имеет дорзовентральное строение, под эпидермой с абаксиальной стороны от 5 до 12 слоев уголковой колленхимы; волоски простые одно и двухклеточные; железки на абаксиальной и адаксиальной сторонах листа из 8 выделительных клеток; на верхней стороне эпидермиса листа устьица отсутствуют; трихомы в виде простых редко расположенных сосочковидных волосков по жилкам; клетки нижнего эпидермиса с сильно извилистыми антиклинальными стенками; устьица аномоцитного типа с 3-5 околоустьичными клетками; проводящие пучки коллатеральные с паренхимной обкладкой из клеток с пигментом желтого цвета. В клетках мезофила друзы оксалата кальция; - на поперечном срезе черешка листа - друзы оксалата кальция; -стебель имеет многогранная форму. Количество граней 6-12.Тип стели-аустель. Сосуды крупные пористые и мелкие кольчатые; редко встречающиеся устьица с 4 околоустьичными клетками; -в эпидермальных клетках лепестков околоцветника имеются крупные друзы оксалата кальция и железки с 4-клеточной головкой на одноклеточной ножке; по краю лепестков венчика встречаются редко расположенные железистые волоски булавовидной формы с многоклеточной головкой.