Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние и перспективы исследования татарника колючего (обзор литературы) 11
1.1 Систематическое положение Onopordum acanthium L., ботаническая характеристика 11
1.2 Географическое распространение 12
1.3 Особенности произрастания 14
1.4 Этноботаника и этнофармакология 15
1.5 Морфолого-анатомическое изучение 16
1.6 Химический состав 17
1.7 Фармакологические исследования 27
Заключение по обзору литературы 34
Глава 2 Объекты и методы исследования 36
2.1 Объекты исследования 36
2.2 Оборудование и реактивы 37
2.3 Методы анализа 39
2.3.1 Морфолого-анатомическое исследование 39
2.3.2 Молекулярно-генетическое исследование 39
2.3.3 Химические методы 40
2.3.4 Пробоподготовка 42
2.3.5 Хроматографические методы 43
2.3.6 Физико-химические методы 48
2.3.7 Испытания по определению показателей качества 52
2.3.8 Валидационная оценка аналитических методик 52
2.3.9 Статистические методы 52
2.3.10 Фармакологические методы исследования 53
Глава 3 Изучение биологически активных веществ надземной части татарника колючего 58
3.1 Предварительный химический анализ 58
3.2 Анализ фенольных соединений 58
3.3 Анализ углеводного комплекса 74
3.4 Анализ тритерпеновых соединений 82
3.5 Анализ органических кислот 84
3.6 Анализ аминокислотного состава 84
3.7 Анализ минерального состава 85
3.8 Заключение по главе 3 86
Глава 4 Морфолого-анатомическое исследование надземной части татарника колючего 88
4.1 Определение макроскопических признаков 88
4.2 Определение микроскопических признаков 90
4.3 Молекулярно-генетическое исследование 99
4.4 Заключение по главе 4 103
Глава 5 Разработка показателей подлинности и качества татарника колючего травы 104
5.1 Подлинность 104
5.2 Определение показателей качества 110
5.2.1 Определение содержания экстрактивных веществ 110
5.2.2 Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка 111
5.3 Количественное определение основных групп биологически активных веществ 111
5.3.1 Обоснование выбора основного соединения 112
5.3.2 Выбор условий количественного определения фенольных соединений 113
5.3.3 Методика количественного определения фенольных соединений 114
5.3.4 Валидационная оценка методики количественного определения фенольных соединений в татарника колючего траве методом УФ-спектрометрии 115
5.3.5 Содержание суммы фенольных соединений в образцах татарника колючего травы 119
5.4 Определение фазы заготовки сырья и режима сушки 119
5.5 Определение срока годности татарника колючего травы 120
5.6 Заключение по главе 5 122
Глава 6 Результаты фармакологического скрининга 124
6.1 Оценка «острой токсичности» 124
6.2 Оценка противовоспалительной активности в условиях острой воспалительной реакции 125
6.3 Оценка противовоспалительной активности в условиях хронического пролиферативного воспаления 126
6.4 Оценка анальгетического действия 127
6.5 Оценка антиоксидантной активности 128
6.6 Заключение по главе 6 133
Общее заключение 134
Список сокращений 136
Список литературы 138
Химический состав
Для видов рода Onopordum в качестве основных групп вторичных метаболитов описаны сесквитерпеновые лактоны, флавоноиды, ацетиленовые соединения, стероиды, тритерпеноиды [187].
В надземной части татарника колючего обнаружены соединения фенольной, тритерпеновой, стероидной структуры, в семенах изучен состав жирного масла, в корнях обнаружены сесквитерпеновые лактоны, полиацетилены [140, 174, 187, 193, 194].
Группа ученых из Тегеранского университета медицинских наук (Иран, 2013) из метанольного извлечения семян, собранных от дикорастущих растений, выделили ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) фенольной природы - (Е)-1-оксо-3,4-дигидро-1Н-изохромен-7-ил 3-(3,4-дигидроксифенил) акрилат в количестве 70 мг на 100 г семян (рисунок 2) [134].
Та же группа ученых установила содержание фенольных соединений в воздушно-сухих семенах после экстракции смесью метанол-вода, которое составило 2740±26 мг в пересчёте на эквивалент галловой кислоты и 100 г семян [107].
Koc S. с соавторами (Турция, 2014) определили содержание фенольных соединений в метанольном, этанольном и ацетоновом извлечениях из цветков и листьев Onopordum acanthium L., Carduus acanthoides L., Cirsium arvense (L.) Scop., Centaurea solstitialis L. (Asteraceae). Сырье собрали в период цветения в июне-июле 2011 г. в Кастамону, Турция. Максимальное содержание фенольных соединений установлено в метанольном извлечении из цветков татарника колючего в пересчете на эквивалент галловой кислоты – 24,70 мг/л; в листьях – в ацетоновом извлечении – 36,67 мг/л [190].
Количественное содержание фенольных соединений в листьях татарника, собранных в округе Хеншела на северо-востоке Алжира в июне 2014 г., определяли в работе Habibatni S. с соавторами. Количество фенольных соединений в бутанольной фракции листьев татарника колючего составило 8,93 мг в пересчете на эквивалент галловой кислоты в 100 мг сухого остатка извлечения [132].
Количество фенольных соединений в семенах, собранных в Тунисе, в пересчете на эквивалент галловой кислоты составило 78,06 ± 5,5 мг в 1 г воздушно-сухого сырья. Количество конденсированных дубильных веществ в пересчете на эквивалент катехина составило в метанольном извлечении 9,37±0,18 мг в 1 г воздушно-сухого сырья. При этом в жирном масле, полученном экстракцией петролейным эфиром, содержится 1,11±0,1 мг/г дубильных веществ в пересчете на катехин [99].
Флавоноиды
В татарнике колючем обнаружены флавоноиды из группы флавонов, флавонолов, флавононов. В надземной части обнаружены гликозиды апигенина, кверцетина, лютеолина (таблица 1) [136].
Ученые из Сегедского университета (Венгрия) выделили апигенин и лютеолин из надземной части татарника колючего, собранного на территории Южного Альфёльда в Венгрии, в количестве 4,5 мг на 4,4 кг воздушно-сухого сырья. Эти соединения обнаружены также в листьях и цветках [129, 132 136, 140].
Ученые Японии и Испании в совместной работе обнаружили в листьях 4 -метиловый эфир скутелляреина (6-гидроксиапигенина) в количестве 9,5 мг на 215 г воздушно-сухих листьев [161]. Другие метокси-производные обнаружены в надземной части татарника колючего в количестве 8,0 мг из 4,4 кг воздушно-сухого сырья (непетин), 3,5 мг (гиспидулин), а также в листьях - 1,6 мг из 215 г воздушно-сухого сырья (пектолинаригенин) и цветках (хризоэриол) [129, 136, 140, 161].
В цветках содержатся эриодиктиол и кверцетин [136]. Гликозиды апигенина, лютеолина и кверцетина найдены в траве, антоциан цианин обнаружен в цветках (рисунок 3) [95, 96 136].
Kos S. с соавторами (Турция, 2014) так же определили содержание флавоноидов в нескольких извлечениях из цветков и листьев татарника колючего. Содержание флавоноидов в пересчете на кверцетин в цветках было максимальным в метанольном извлечении (42,09 мг в 1 л извлечения), в листьях – в ацетоновом извлечении (85,37 мг/л) [190].
Habibatni S. с соавторами установили содержание флавоноидов в бутанольной фракции листьев татарника колючего (3,93 мг катехина на 100 мг сухого остатка извлечения) [132].
В метанольном извлечении после обезжиривания семян (Тунис, 2019) обнаружено 20,38±2,1 мг/г флавоноидов в пересчете на рутин и воздушно-сухое сырьё, в жирном масле – 2,46±0,54 мг/г [99].
Фенилпропаноиды
Цветочные корзинки татарника накапливают кофейную и хлорогеновую кислоты [136]. В метанольном извлечении из плодов, собранных в трех местах произрастания в Республике Косово, Daci A. с соавторами определили содержание изохлорогеновой кислоты А (3,5±0,4 мг/г в пересчёте на свежие плоды). При этом на долю изохлорогеновой кислоты приходилось 10,2±0,2% от всех обнаруженных компонентов метанольного извлечения [176]. Фенилпропаноид аконизид был выделен из хлороформного излечения высушенных плодов татарника в Узбекистане [164] (рисунок 4).
В метанольном извлечении из семян татарника колючего (Тунис, 2019) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-детектором обнаружены транс-коричная (132,9±3,8 мг на 100 г воздушно-сухого сырья), м-кумаровая (65,4±2,84 мг), п-кумаровая (21,03±1,94 мг), о-кумаровая (2,56±0,75 мг), сиреневая (1,66±0,64 мг) кислоты [99].
Из семян татарника колючего выделено производное фенилпропаноидов 1-О-2-(3,4-диметоксибензил)-3-карбокси-4-(3-метокси-4-оксифенил)-бутил--d-галактопираноза [46].
Лигнаны
Lajter I. с соавторами выделили лигнаны пинорезинол (5,5 мг из 4,4 кг воздушно-сухой надземной части, собранной в Южном Альфёльде в Венгрии), сирингарезинол (9,4 мг) и медиорезинол (3,4 мг) (таблица 2) [94 129 140].
Анализ фенольных соединений
Качественный анализ фенольных соединений проводили хроматографически (раздел 2.3.4. Прободготовка, 2.3.5. Хроматографические методы).
Результаты хроматографического анализа водно-спиртового извлечения (экстрагент – спирт этиловый 70%) из надземной части татарника колючего представлены в таблице 9.
В водно-спиртовом извлечении из надземной части татарника колючего методом бумажной хроматографии обнаружены лютеолин-7-О-гликозид, кофейная кислота, хлорогеновая кислота.
В системе растворителей вода-ацетонитрил-уксусная кислота ледяная (78:19:31) не наблюдали разделения компонентов водно-спиртового извлечения из надземной части татарника колючего. Для оценки подлинности сырья татарника колючего основным маркерным компонентом предложена хлорогеновая кислота, поэтому в качестве подвижной фазы для проведения анализа методом ТСХ может быть рекомендована система растворителей муравьиная кислота безводная-уксусная кислота ледяная-вода-этилацетат (11:11:26:100), в которой достигается наилучшее разделение хлорогеновой кислоты с сопутствующими соединениями. На хроматограмме испытуемого извлечения должна обнаруживаться зона адсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета на уровне зоны адсорбции СО хлорогеновой кислоты, возможно обнаружение зон адсорбции с голубой, желтой и бурой флуоресценцией выше зоны адсорбции хлорогеновой кислоты (рисунок 9).
Анализ кумаринов проводили с хлороформной фракцией и водно-спиртовым извлечением, полученным экстракцией спиртом этиловым 70%. Проводили качественную реакцию с диазореактивом, наблюдали оранжево-красное окрашивание раствора. Хроматографический анализ методом ТСХ проводили в системе бензол:этилацетата (1:1), на хроматограммы, наряду с извлечениями, наносили растворы стандартных образцов кумарина, скополетина, умбеллиферона в спирте этиловом 70% (0,5 мг/мл). Детектирование зон адсорбции проводили натрия гидроксида спиртовым раствором 10%. Зон адсорбции, совпадающих по значению коэффициента подвижности с зонами адсорбции СО кумаринов, не обнаружено.
Анализ фенольных соединений методом ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС
Профили водно-спиртового извлечения (экстрагент – спирт этиловый 70%) из татарника колючего травы при диодно-матричном детектировании в градиентном режиме элюирования (Раздел 2.3.5. Хроматографические методы) при длине волны 255 и 325 нм соответственно представлен на рисунках 10 и 11.
На хроматограммах водно-спиртового извлечения из надземной части татарника колючего обнаружены пики со временами удерживания 4,27 мин (соединение 1) и 5,45 мин (соединение 2), что совпадает с временами удерживания хлорогеновой и кофейной кислоты соответственно. При этом при регистрации масс-спектров соединение 1 имеет максимум с m/z 353 в режиме отрицательной ионизации, что соответствует молекулярной массе хлорогеновой кислоты (Приложение А, рисунок 2). Соединение 2 имеет максимум с m/z 179, совпадающий с фрагментом молекулярного иона кофейной кислотой (Приложение А, рисунок 4). В испытуемом извлечении не обнаружена феруловая кислота.
Ранее в извлечениях из надземной части двух видов рода Onopordum (O. illyricum, O. horridum) были обнаружены производные кофеилхинной кислоты: неохлорогеновая, криптохлорогеновая, хлорогеновая кислоты; 1,3-дикофеилхинная, 1,5-дикофеилхинная, 3,5-дикофеилхинная, 4,5-дикофеилхинная кислоты [184]. В водно-спиртовом извлечении из надземной части татарника колючего соединение 3 имеет максимумы светопоглощения при длинах волн 243 и 329 нм (Приложение А, рисунок 5). На масс-спектрах основной пик имеет m/z 515, сопутствующие пики m/z 191, 257, 353 (Приложение А, рисунок 6).
Соединение 4 имело максимумы светопоглощения при длинах волн 243 и 330 нм (Приложение А, рисунок 7). На масс-спектре соединения присутствует пик с m/z 615,1, а также сопутствующие пики с m/z 191, 307, 353, 453 (Приложение А, рисунок 8).
На УФ-спектре соединения 5 наблюдаются максимумы светопоглощения при длинах волн 243 и 329 нм (Приложение А, рисунок 9). Основной пик на масс-спектре имеет значение m/z 714,2. Кроме того, имеются пики с m/z 198, 329, 357, 453, 515 (Приложение А, рисунок 10).
На основе данных УФ-спектров, полученных значений молекулярных масс и масс-спектров и литературных данных соединение 3 идентифицировано нами как 3,5-дикофеилхинная кислота, соединение 4 - дикофеилсукцинилхинная кислота и соединение 5 -дикофеилсукцинилфумарилхинная кислота [92, 101, 127, 135, 144].
При хроматографическом анализе стандартного раствора флавоноидов установлено, что время удерживания рутина составляет 8,10 мин, лютеолин-7-О-гликозида – 8,77 мин, кверцетина – 14,44 мин, лютеолина – 15,06 мин. При этом на УФ-спектрах рутина обнаруживаются максимумы светопоглощения при длинах волн 255 и 353 нм, для лютеолин-7-О-гликозида характерны максимумы светопоглощения при 254 и 348 нм, для кверцетина – 255 и 370 нм (Приложение А, рисунок 11, 13, 15).
На хроматограммах водно-спиртового извлечения из надземной части татарника колючего обнаружены пики со временами удерживания 8,14 мин (соединение 6), 8,79 мин (соединение 7) и 14,43 мин (соединение 8), что совпадает с временами удерживания рутина, лютеолин-7-О-гликозида и кверцетина соответственно. При этом при регистрации масс-спектров соединение 6 имеет максимум с m/z 609 в режиме отрицательной ионизации, что соответствует молекулярной массе рутина (Приложение А, рисунок 12). Соединение 7 имеет максимум с m/z 447, совпадающий с фрагментом молекулярного иона лютеолин-7-О-гликозида (Приложение А, рисунок 14). Соединение 8 характеризуется пиком с m/z 301, значение которого аналогично пику кверцетина (Приложение А, рисунок 16). В испытуемом извлечении не обнаружен лютеолин.
Также в водно-спиртовом извлечении из надземной части татарника колючего вероятно присутствие следующих соединений: производное криптохлорогеновой кислоты, 1,3-дикофеилхинная кислота, 1,5-дикофеилхинная кислота (Приложение А, рисунок 17-20).
Таким образом, при сравнении с максимумами поглощения, временами удерживания и пиками m/z в извлечении из татарника идентифицированы хлорогеновая и кофейная кислоты, дикофеилсукцинилфумарилхинная, 3,5-дикофеилхинная и дикофеилсукцинилхинная кислоты, рутин, кверцетин и лютеолин-7-О-гликозид (таблица 10). Таким образом, в водно-спиртовом извлечении из надземной части татарника колючего одним из мажорных фенольных соединений является хлорогеновая кислота, а также производные кофеилхинной кислоты. Полученные результаты анализа водно-спиртового извлечения методом ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС позволяют проводить оценку подлинности сырья татарника колючего методом ТСХ и количественное определение фенольных соединений в пересчете на один из основных компонентов - хлорогеновую кислоту.
Количественное определение хлорогеновой кислоты в надземной части татарника колючего методом ВЭЖХ
В водно-спиртовых извлечениях (экстрагент - спирт этиловый 70%) из образцов татарника колючего травы (раздел 2.1 Объекты исследования), собранных в разных местах произрастания в фазу массового цветения было рассчитано количественное содержание хлорогеновой кислоты.
Извлечения готовили согласно разработанной методике (раздел 5.3.3. Методика количественного определения фенольных соединений). При этом из раствора А отбирали пробу в количестве 20 мкл, которую вносили в хроматограф. Анализ проводили в изократическом режиме в системе растворителей ацетонитрил - 0,5% муравьиная кислота (20:80) со спектрофотометрическим детектированием пиков при длине волны 330 нм. Температура пробы составляла 20С, температура в колонке поддерживалась при 25С, скорость подвижной фазы 1 мл/мин, время хроматографирования 10 минут.
Подлинность
Цельное сырье. Облиственные цветоносные ветвистые стебли до 20 см длиной, с зелеными крыльями, расположенными по 4 ребрам и по всей длине стебля, с острыми желтыми колючками по краю крыльев. Стебли ребристые, внутри полые. Листья очередные, эллиптической или продолговатой формы, перистолопастные, по краю с острыми колючками. На нижней стороне листа хорошо видна сетка жилок. Стебли и листья с обеих сторон густо опушены. Соцветия – корзинки на верхушках стеблей, расположены по 2-3 или одиночные. Обертка корзинок состоит из треугольных зеленых листочков, имеющих на конце желтые шипы; обертка голая, ложе корзинки ямчатое. Цветки трубчатые, обоеполые. Чашечка в виде волосков. Венчик пурпурный или светло-фиолетовый из пяти глубокоразделенных долей. Тычинок пять со сросшимися в трубку пыльниками. Пестик с одногнёздной нижней завязью. Плоды - темно-бурые семянки с поперечно-морщинистой поверхностью, имеют рыжеватый хохолок, в 1,5-2 раза длиннее семянки.
Цвет стеблей и листьев светло-зеленый, стебли на поперечном сечении желтоватые, корзинки с зеленой оберткой, венчик пурпурный или фиолетовый, семянки темно-бурые. Запах слабый, вкус водного извлечения нейтральный (рисунок 32).
Измельченное сырье. Кусочки стеблей, листьев и фрагменты соцветий, проходящие сквозь сито с отверстиями размером 5 мм.
При рассмотрении пробы измельченного сырья под лупой (10) или стереомикроскопом (16) видны части ребристых стеблей, кусочки листовых пластинок, густо опушенные с обеих сторон простыми волосками. С нижней стороны видны жилки. Видны желтые крупные колючки крыльев стеблей и листовых пластинок; фиолетовые венчики, фрагменты ямчатых цветолож корзинок. Цвет стеблей и листьев – светло-зеленый, стебли на поперечном сечении желтоватые, цветки фиолетовые, плоды темно-бурые. Запах слабый, вкус водного извлечения нейтральный (рисунок 33).
Порошок. Смесь стеблей, листьев, соцветий, плодов, проходящих сквозь сито с размером отверстий 2 мм.
При рассмотрении пробы измельченного сырья под лупой (10) или при помощи стереомикроскопа (16) видны волокнистые фрагменты стеблей, кусочки листовых пластинок, густо опушенные с обеих сторон простыми волосками. Встречаются желтые крупные колючки крыльев стеблей и листовых пластинок; фиолетовые венчики, темно-бурая оболочка семянок. Цвет светло-зеленый, сырье имеет войлочный вид. Запах слабый, вкус водного извлечения нейтральный (рисунок 34).
Микроскопические признаки
Цельное, измельченное сырье
При рассмотрении препаратов с поверхности листа видны многоугольные клетки с прямыми антиклинальными стенками на верхнем эпидермисе и клетки с сильно извилистыми стенками, толщина которых меньше, на нижнем эпидермисе. Устьица расположены на верхнем и нижнем эпидермисе, на нижнем эпидермисе их больше; устьица окружены 4-5 околоустьичными клетками (аномоцитный тип). Замыкающие клетки устьиц имеют почковидную форму. Волоски простые многоклеточные, встречаются на обеих сторонах листа. Поверхность волосков гладкая, у основания волосков расположено 7-8 клеток эпидермиса. На поперечном срезе листовой пластинки видны солевые клетки на нижней стороне листа.
Эпидермис стебля и цветоноса состоит из вытянутых многоугольных клеток с прямыми антиклинальными стенками, устьица аномоцитного типа. На эпидермисе стебля волоски простые многоклеточные. Волоски имеют часть клеток со спадающимися стенками. Поверхность волосков гладкая, клеточная стенка тонкая. На эпидермисе цветоноса встречаются простые многоклеточные волоски со спавшимися члениками и железистые волоски. Ножка волосков состоит из 2-3 клеток, головка многоклеточная, с желто-бурым содержимым.
Эпидермис обертки корзинок сложен многоугольными клетки со слабоизвилистой клеточной стенкой, устьица аномоцитного типа с 3-4 околоустьичными клетками, устьичные клетки сферовидные. На эпидермисе встречаются простые многоклеточные гусеницеобразные волоски с гладкой поверхностью, клетки тонкостенные. Видные простые многоклеточные многорядные щетинистые волоски чашечки. На эпидермисе венчика по краю и на поверхности видны сосочковидные волоски, по краю они остроконечные. Во фрагменте трубчатого цветка видны пигментсодержащие клетки с хромопластами. (рисунок 35).
Порошок
При рассмотрении препаратов порошка видны фрагменты эпидермиса листьев с устьицами аномоцитного типа со слабоизвилистыми клетками и прямыми антиклинальными стенками. Встречаются простые нитевидные перекрученные волоски; простые многоклеточные многорядные щетинистые волоски (элементы чашечки цветка). Видны фрагменты эпидермиса стебля и цветоноса с вытянутыми многоугольными клетками, устьица аномоцитного типа. Пыльца округлая, ее поверхность щиповатая. Пыльца окрашена в оранжево-красный цвет (рисунок 36).
Оценка антиоксидантной активности
Ранее нами проведена оценка антиоксидантной активности извлечений из надземной части татарника колючего в сравнении с кофейной кислотой [67].
При оценке DPPH – ингибирующей активности (рисунок 42) исследуемых извлечений было установлено, что минимальное значение IC50 отмечено для водно-спиртового (экстрагент – спирт этиловый 70%) извлечения из татарника (2,48±0,021 мкг/мл), что статистически значимо не отличалось от аналогичного показателя для хлорогеновой кислоты. Также значение IC50 для извлечения ЭТ70 было меньше по сравнению с остальными изучаемыми объектами (p 0,05).
Оценка супероксид-радикал ингибирующей активности позволила установить, что наиболее выраженные скэвенджерные свойства проявляет изучаемое извлечение ЭТ70, показатель IC50 для которого (2,03±0,011 мкг/мл) был статистически значимо меньше по сравнению с аналогичным показателем для спиртового (экстрагент – спирт этиловый 96%), водно-спиртового (экстрагент – спирт этиловый 40%), водного извлечений и сока татарника (p 0,05) (рисунок 43).
Гидроксил-радикал ингибирующие свойства (рисунок 44) также были более выражены у водно-спиртового (экстрагент – спирт этиловый 70%) извлечения татарника. Показатель IC50 для данного исследуемого объекта при оценке гидроксил-радикал ингибирующей активности составлял 2,69±0,014 мкг/мл, т.е. статистически значимо не отличался от показателя кофейной кислоты и был меньше (p 0,05) по сравнению с остальными изучаемыми объектами.
Оценивая нитрозил-радикал ингибирующие свойства (рисунок 45) исследуемых извлечений было установлено, что наиболее близкое значение к IC50 хлорогеновой кислоты (2,4±0,014 мкг/мл) было получено при оценке антирадикальной активности водно-спиртового (экстрагент – спирт этиловый 70%) извлечения из татарника (IC50 = 2,5±0,013 мкг/мл), что статистически значимо было меньше полуингибирующей концентрации для спиртового (экстрагент – спирт этиловый 96%), водно-спиртового (экстрагент – спирт этиловый 40%), водного извлечений и сока татарника (p 0,05).